一种硫酸盐还原菌制氢使用的发酵基质制备方法及应用

摘要

本发明提供一种硫酸盐还原菌制氢使用的发酵基质制备方法及应用，属于生物制氢技术领域。将底物进行处理，先粉碎底物粒度小于5mm的碎末；将底物碎末与有机溶剂混合；对有机溶剂与底物混合物在350W的功率下超声萃取2h，有机溶剂的萃取对底物碎末的物理形貌产生破坏，并萃取部分无机物小分子从而使底物碎末的孔隙变大、结构更疏松；过滤分离有机溶剂液和底物，加热干燥处理过后的底物挥发残余有机溶剂使底物碎末的粒径的分布均匀化、更容易被外源菌所利用，最终产物即为发酵基质。其通过有机溶剂的预处理对难降解褐煤进行活化，改变褐煤的物理性质，能明显提高产氢效率；将褐煤的资源化清洁利用。

权利要求

1.一种硫酸盐还原菌制氢使用的发酵基质制备方法，其特征在于步骤为：

将底物进行处理，先粉碎底物为粒度小于5mm的碎末，底物为经过预处理的褐煤碎末；

将底物碎末与有机溶剂混合，每100g褐煤碎末中加入1L有机溶剂，有机溶剂为醇、酯、烃、醚中的一种；

对有机溶剂与底物混合物在350W的功率下超声萃取2h，有机溶剂的萃取对底物碎末的物理形貌产生破坏，并萃取部分无机物小分子从而使底物碎末的孔隙变大、结构更疏松；

过滤分离有机溶剂液和底物，加热干燥处理过后的底物即为发酵基质。

2. 一种如权利要求1所述的方法制备得到的发酵基质的应用，其特征在于：将预处理好的褐煤碎末与活化的硫酸盐还原菌种子液混合在发酵基质中厌氧发酵制氢；硫酸盐还原菌种子液中的菌种为产气克雷伯氏菌Klebsiella aerogenes，菌株为短杆状菌，该菌株利用硫酸盐作为呼吸链末端电子受体，将硫酸盐还原为硫化物，10‑36 h进对数生长对数期，最适生长pH为7.0，最适温度为35℃，菌种为可购买商品。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：活化的硫酸盐还原菌种子液由硫酸盐还原菌和种子培养基组成，其中种子培养基组分质量百分比为：磷酸氢二钾0.005%、酵母提取物

0.01%、硫酸钠0.005%、硫酸镁·七水0.02%、半胱氨酸盐酸盐0.01%、50%浓度的乳酸钠

0.07%、氯化铵0.01%、氯化钙·二水0.01%、0.1%浓度的刃天青0.01%和水99.85%。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：厌氧发酵使用的发酵培养基包括预处理后的褐煤碎末、基本无机盐和水；其中发酵培养基的基本无机盐的组分质量百分比为：磷酸氢二钾0.005%、硫酸钠0.005%、硫酸镁·七水0.02%、氯化铵0.01%、氯化钙·二水0.01%、底物

10%、水89.95%；褐煤碎末的含量为80g/L，每升调配好的发酵培养基另添加半胱氨酸盐酸盐

1.0g保持发酵过程中的还原性。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于：底物在发酵培养中的发酵温度为35℃，厌氧发酵，发酵周期为7天。

说明书

一种硫酸盐还原菌制氢使用的发酵基质制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及一种硫酸盐还原菌制氢使用的发酵基质制备方法及应用，属于生物制氢技术领域。

背景技术

[0002] 氢燃料的单位能量含量高(比碳氢化合物燃料高2.75倍)，燃烧时不会产生温室气体，因此被认为是未来理想的能源载体。然而，生产氢气的技术仍然依赖于能源密集型的过程，这是不可持续的。因此，迫切需要以可再生、可持续和环境友好的方式生产氢气的方法。生物制氢是一种非常有效的替代方法，因为它需要能源输入低，如果使用废物或可再生基质，它是可持续的。煤是一种被广泛使用的资源，但其中有很大一部分是以品质较差的褐煤的形式存在。突破并发展生物转化煤炭的关键技术就显得极为重要。而硫酸盐还原菌是一类主要的环境厌氧细菌，该类微生物的特征是氢化酶水平非常高，氢化酶是负责产生或者消耗H2的酶，通常在基因组中存在多个拷贝，所以硫酸盐还原菌具有很高的产氢气潜力。

[0003] 现有技术中：专利号为201410309486.7的发明专利，使用木糖发酵制氢的菌株及制氢方法。所述菌株为蜡样芽孢杆菌S1株和圆滑短波单胞菌Z1株，这些菌株是基于木糖降解筛选获得，具有较高的产氢能力。所述制氢方法以木糖为底物，采用蜡样芽孢杆菌S1株和/或圆滑短波单胞菌Z1株进行发酵培养制氢，需要使用木糖为底物，成本高，不适合工业中大规模的应用。

[0004] 如专利号为：201710173666.0公开的一种超低温与粉碎联合预处理花生壳作为生物制氢补充底物的方法，将干燥的花生壳置于超低温环境下一段时间，取出后迅速采用物理方式将其粉碎；将以上处理后的花生壳同葡萄糖厌氧发酵培养基一起置于培养瓶内，充入氮气后，高温灭菌；将上述混合葡萄糖厌氧发酵培养基中接入已活化后的厌氧产氢菌种，置于适宜条件下，进行厌氧生物发酵产氢。其对环境温度要求苛刻，使整个方案严重受制于环境条件，通过人工模拟低温环境又会显著提高生产成本，因此并不适合工业大规模的生产。

发明内容

[0005] 针对现有技术的不足之处，提供一种硫酸盐还原菌制氢使用的发酵基质制备方法及应用，使用褐煤为底物，先使用有机溶剂对褐煤进行活化，增加其生物可利用性，然后利用硫酸盐还原菌进行生物发酵产氢，产氢结束的这些底物的物化性质未发生明显的变化，还可继续使用，具有绿色环保、稳定性高、周期短、产氢效率高等优点。具有很好的经济效益，有利于实现商业化应用。

[0006] 为实现上述技术目的，本发明的一种硫酸盐还原菌制氢使用的发酵基质制备方法，其步骤为：

[0007] 将底物进行处理，先粉碎底物粒度小于5mm的碎末；

[0008] 将底物碎末与有机溶剂混合；

[0009] 对有机溶剂与底物混合物在350W的功率下超声萃取2h，有机溶剂的萃取对底物碎末的物理形貌产生破坏，并萃取部分无机物小分子从而使底物碎末的孔隙变大、结构更疏松；

[0010] 过滤分离有机溶剂液和底物，加热干燥处理过后的底物挥发残余有机溶剂使底物碎末的粒径的分布均匀化、更容易被外源菌所利用，最终产物即为发酵基质。

[0011] 进一步，有机溶剂为醇、酯、烃、醚中的一种，每100g煤粉中加入1L有机溶剂。

[0012] 进一步，底物为经过预处理的褐煤碎末。

[0013] 一种使用硫酸盐还原菌制氢使用的发酵培养基基质制备方法制备出的发酵培养基。

[0014] 一种发酵基质的应用，其特征在于：将预处理好的褐煤碎末与活化的硫酸盐还原菌种子液混合在发酵培养基中厌氧发酵制氢。

[0015] 进一步，硫酸盐还原菌种子液中的菌种为产气克雷伯氏菌Klebsiella aerogenes，菌株为短杆状菌，该菌株利用硫酸盐作为呼吸链末端电子受体，将硫酸盐还原为硫化物，10‑36h进对数生长对数期，最适生长pH为7.0，最适温度为35℃，菌种为可购买商品。

[0016] 进一步，活化的硫酸盐还原菌种子液由硫酸盐还原菌和种子培养基组成，其中种子培养基组分质量百分比为：磷酸氢二钾0.005％、酵母提取物0.01％、硫酸钠0.005％、硫酸镁·七水0.02％、半胱氨酸盐酸盐0.01％、50％浓度的乳酸钠0.07％、氯化铵0.01％、氯化钙·二水0.01％、0.1％浓度的刃天青0.01％和水99.85％；根据需要在培养基中加入葡萄糖、缓冲溶液、微量元素、有利于细菌生产的组份同样适用于本细菌的培养过程。

[0017] 进一步，厌氧发酵使用的发酵培养基包括预处理后的褐煤碎末、基本无机盐和水；其中发酵培养基的基本无机盐的组分质量百分比为：磷酸氢二钾0.005％、硫酸钠0.005％、硫酸镁·七水0.02％、氯化铵0.01％、氯化钙·二水0.01％、底物10％、水89.95％；其中发酵培养基的底物为有机质沉积物；每升调配好的发酵培养基另添加半胱氨酸盐酸盐1.0g保持发酵过程中的还原性。

[0018] 进一步，底物在发酵培养中的发酵温度为35℃，厌氧发酵，发酵周期为7天。

[0019] 一种生产氢气的方法，通过产氢气微生物进行厌氧发酵生产氢气。

[0020] 产生的氢气可以用一次性针管从厌氧发酵反应器中吸取，采用气相色谱对氢气含量进行检测。

[0021] 有益效果：

[0022] 本发明首先将褐煤进行预处理，将其转化为易被微生物转化利用的状态，进一步利用硫酸盐还原菌进行发酵产氢。经实验证明，经过预处理的褐煤与原煤相比，发酵产氢效率都得到了明显提升，经过醇类有机溶剂预处理的褐煤组提升效率最为明显，是原煤产气组的两倍，达到19.13μmol/g煤。经过产气后的褐煤还可以正常的用作其他生产活动。本发明实现了对褐煤的资源化清洁利用。

[0023] 本发明使用硫酸盐还原菌与经过有机溶剂预处理的褐煤厌氧发酵来产生氢气。与现有产氢技术相比，该技术针对的底物为难降解大分子(有机质沉积物)；通过有机溶剂的预处理对难降解有机质进行活化，能明显提高产氢效率；可以实现大分子难降解有机固废的资源化利用；通过微生物发酵制氢，能明显地降低产氢能耗。

[0024] 说明书附图

[0025] 图1为四种经过预处理前后褐煤的SEM照片图，其中a为原煤，b为醇类萃余煤，c为酯类萃余煤，d为醚类萃余煤，e为烃类萃余煤；

[0026] 图2为原煤和四类有机溶剂萃余煤的XRD图谱；

[0027] 图3为不同有机溶剂处理煤的产氢情况曲线图。

具体实施方式

[0028] 下面结合附图对本发明的实施例做进一步说明：

[0029] 本发明所用产氢气菌株为分离自煤生物产气体系的一株硫酸盐还原菌株Klebsiella SKA1，菌株为短杆状菌，大小约为(1.5‑2.2)μm×(0.4‑0.8)μm，该菌株可以利用硫酸盐为呼吸链末端电子受体，将硫酸盐还原为硫化物，10‑36h进入生长对数期，最适生长pH为7.0，最适温度为35℃。

[0030] 本发明提供一种生产氢气的方法，其包括使用产氢气微生物进行厌氧发酵来生产氢气，其中所述产氢气微生物为上述硫酸盐还原菌—产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)，进一步的优选产气克雷伯氏菌对数生长期菌种作为产氢气的微生物。

[0031] 本发明提供的生产氢气的方法，包括：

[0032] 对底物进行预处理其方案为：先利用粉碎机粉碎底物，将底物粉碎为粒度小于5mm的碎末，有机溶剂与底物混合超声波处理，过滤使处理后的有机溶剂液和底物分离，处理过后的底物加热干燥从而挥发残余处理液，从而完成预处理。

[0033] 将所述产氢气微生物活化后接种到种子培养基中进行厌氧培养，得到种子液；

[0034] 将所述种子液接种到含有经过预处理底物的发酵培养基中进行厌氧发酵培养，得到氢气。

[0035] 在一个具体的实施方式中，所述底物为经过预处理的褐煤、页岩、油页岩、沥青砂、沥青、泥炭等类似的含有机质沉积物。预处理可以包括粉碎机粉碎(粒度较大的底物进行该操作)，有机溶剂处理，过滤使处理液和底物分离，处理过后的底物进行加热挥发残余处理液。

[0036] 在一个具体的实施方式中，加工步骤为粉碎机粉碎。将粒度较大的底物粉碎为粒度小于5mm的碎末。

[0037] 在一个具体的实施方式中，加工步骤为有机溶剂预处理。

[0038] 在一个具体的实施方式中，有机溶剂处理所用的有机溶剂为醇、酯、烃、醚等类型的有机溶剂。将底物碎末与有机溶剂混合，对有机溶剂与底物混合物在350W的功率下超声萃取2h，每100g煤粉中加入1L有机溶剂。本方法提出此四类有机溶剂，但并不仅限于在此提出的四类有机溶剂。

[0039] 在一个具体的实施方式中，加工步骤为固液分离。将有机溶剂处理结束的固液混合物进行过滤分离，处理过后的底物可用做产氢微生物厌氧发酵的底物，处理过后的有机溶剂处理物混合液可收集重复利用，进行下一批底物的处理。

[0040] 在一个具体的实施方式中，加工步骤为加热蒸发过滤后底物上残留的处理液。将过滤出来的底物加热到50℃进行处理液的挥发，直到底物干燥完全。

[0041] 其中，在一个具体的实施方式中，种子培养基由磷酸氢二钾、酵母提取物、硫酸钠、硫酸镁·七水、半胱氨酸盐酸盐、50％浓度的乳酸钠、氯化铵、氯化钙·二水、0.1％浓度的刃天青和水，在所述的种子培养基中的质量百分比分别为0.005％、0.01％、0.005％、0.02％、0.01％、0.07％、0.01％、0.01％、0.01％和99.85％。厌氧培养。

[0042] 值得说明的是，说明中仅给出该菌株种子培养基的最常用的培养基，在培养基中加入葡萄糖、缓冲溶液、其他微量元素等有利于细菌生产的组份同样适用于本细菌的培养过程。

[0043] 其中，其中发酵培养基的基本无机盐由磷酸氢二钾、硫酸钠、硫酸镁·七水、氯化铵、氯化钙·二水，所述的基本无机盐质量百分比分别为0.005％、0.005％、0.02％、0.01％、0.01％。其中发酵培养基的底物为有机质沉积物，占整个发酵培养基的10％。水占整个发酵培养基的89.95％。每升调配好的发酵培养基另添加半胱氨酸盐酸盐1.0g保持发酵过程中的还原性。

[0044] 在一个具体的实施方式中，所述底物在厌氧发酵培养基中的含量为80～100g/L。

[0045] 在发酵培养中，发酵温度为35℃，发酵时间为7天。

[0046] 实施例

[0047] 实施例1菌种的分离

[0048] 实验所用产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes)菌株，分离自煤生物产气体系。

[0049] 通过多次滚管分离纯化实验后，可以获得在厌氧试管中出现的单一黑色菌落，将其挑出到液体种子培养基中扩培，将得到的菌液进行分子生物学测定。将测序结果上传至NCBI比对，检索与试验菌株同源性相近的菌株，选取了其中同源性较高的15种细菌，绘制菌株的系统发育树。结果可知试验菌株与Klebsiella aerogenes(产气克雷伯氏菌属)具有比较近的同源性，故而可以认为本研究获得的菌株属于变形菌门，产气克雷伯氏菌属。该菌种属于常见的克雷伯氏菌，菌种为可购买商品。

[0050] 实施例2底物的预处理

[0051] 本发明所选用的底物为褐煤、页岩、油页岩、沥青砂、沥青、泥炭等类似的含有机质沉积物。由于这些物质都属于碳氢化合物，有类似的化学性质，故均可被硫酸盐还原菌利用产氢气。本实施例以褐煤为例，说明褐煤预处理流程。

[0052] 首先取胜利5号褐煤煤样，用粉碎机将煤样研磨至粒度小于5mm，然后将其分装，分别与醇、酯、烃、醚有机溶剂混合均匀，要求每升有机溶剂中含有100g褐煤煤粉。然后将混合均匀的褐煤有机溶剂混合液放入超声波清洗机在350W的功率下超声萃取2h。之后拿出超声波萃取结束的煤粉有机溶剂混合物静置沉淀1小时，之后进行过滤，使固液分离。过滤出的煤粉在电热鼓风干燥箱中50℃烘干2h。烘干后的煤粉可作为发酵培养基的底物使用。过滤出的有机溶剂可收集进行下次褐煤煤粉的萃取。

[0053] 对原煤和经过预处理后的煤样进行扫面电镜(SEM)观察，结果如附图1所示，a：原煤，b：醇类萃余煤，c：酯类萃余煤，d：醚类萃余煤，e：烃类萃余煤。在扫描电镜下可以观察到，原煤颗粒是不均一的，但结构较紧密，其中的小颗粒是堆砌或附着在大颗粒的间隙中的，表面相对来说比较平整。经过有预处理后，其粒径的分布逐渐变得均匀化，并且在颗粒间出现清楚的间隙。同时可以看出原煤中紧致的整体片状结构变成稀松的块状和颗粒结构。可知萃取作用能够对煤的形貌产生破坏，还能提取部分小分子从而使得孔隙变大。通过使用Matlab分析软件分析原煤和预处理后煤样的孔隙度和孔隙比率，结果显示出经过四类有机溶剂预处理后使得煤样的孔隙度和孔隙比均发生了不同程度的增加，经过有机溶剂的预处理作用，使得煤的孔隙增大，结构更疏松，从而使煤更容易被外源菌所利用。

[0054] 对原煤和经过预处理后的煤样进行X射线晶体衍射(XRD)表征，结果如附图2所示。结果表明萃余煤中的衍射特征峰与原煤相比，有增加或者消失的情况，但是这些特征峰都比较小，代表对应的矿物质含量也较小，表明溶剂的萃取作用，使得煤样中部分无机矿物质的含量降低，质量下降，从而造成煤样内部分子间孔隙增大，使其更易于被微生物降解利用，这一结论也是与煤样的工业分析结果相互印证的，如表1所示；

[0055] 表1原煤和四类有机溶剂预处理煤样的孔隙度和孔隙比结果

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[0057] 煤虽然是一种非晶态的物质，但在煤中还存在少量的类石墨结构，因此可用研究石墨的方法来对煤进行研究。将煤样XRD谱图中的002峰和100峰作为分析与计算的特征峰，002峰能够反映芳香环层间的堆垛，对应着由缩聚芳香核所形成的芳香微晶，100峰能够反映芳香环的缩合程度，也就是芳香碳网层片的大小。运用Bragg和Scherrer方程计算煤样的微晶结构参数，λ取0.15405nm，结果如表2所示；

[0058] 表2原煤和四类有机溶剂萃余煤的微晶结构参数

[0059]

[0060] 在四种萃余煤中，反映延展度的参数La也具有很大区别，酯类和烃类萃余煤小于原煤的延展度，而醇类和醚类萃余煤的延展度比原煤大，这有可能是由于醇类和醚类与酯类和烃类具有不同的极性和亲水性，对煤内部结构的渗透能力不同，作用在芳香层片上的效果也不同，且煤的微晶结构具有一定的弹性，有机溶剂溶胀能力的区别，也会导致La发生不同的变化。N值在2.5左右波动，表明有机溶剂的萃取作用对平均堆垛层数没有很大的影响，在四种萃余煤中，酯类萃余煤和醚类萃余煤是大于原煤的，而醇类和烃类萃余煤是小于原煤的，说明经过醇类和烃类萃取后，使得煤样的结构更不稳定，易发生反应。

[0061] 实施例3微生物处理褐煤产氢气

[0062] 将已活化的产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes SKA1)接种到种子培养基中进行厌氧培养，在温度35℃下培养15h，得到产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes SKA1)种子液。

[0063] 以总种子液与种子培养基的体积比为10％(V/V)接种至含有种子培养基中，35℃震荡培养15h。然后将培养好的种子培养基、灭菌水、经过预处理的胜利5号褐煤煤粉(4份胜利5号褐煤煤粉，分别经过醇类、酯类、醚类、烃类有机溶剂处理)作为发酵培养基，分别密封，并在35℃下厌氧发酵7天。另外，使用仅破碎的而未用任何有机溶剂处理过的煤粉为底物做原煤产气组。再使用仅破碎的而未用任何有机溶剂处理过的煤粉作为底物，并且不接种微生物作为空白对照组。每组实验重复三次。厌氧发酵产气7天，每天检测一次H2产量。

[0064] 不同预处理的胜利5号褐煤间的H2生成曲线呈相同趋势，在1～4d，H2产量上升迅速，在5d左右上升速度变缓并逐渐趋于稳定。其中，未用任何有机溶剂处理过的煤粉(原煤)H2累计产量为8.91μmol/g煤，空白组几乎不产H2。不同有机溶剂处理后的褐煤煤样H2产量均比原煤有不同程度的增加，其中醇类有机溶剂处理的褐煤煤样的H2产量是最高，达到19.13μmol/g煤，其次依次为烃类有机溶剂处理煤(16.02μmol/g)>酯类有机溶剂处理煤(14.96μmol/g)>醚类有机溶剂处理煤(13.06μmol/g)。其中产氢量最高的醇类有机溶剂处理的褐煤煤样每吨煤可生产0.425立方米的氢气。

[0065] 其中，所使用的发酵培养基褐煤粉在厌氧发酵培养基中的含量为80g/L。

[0066] 氢气的测定结果附图3显示，由此可见当产气克雷伯氏菌(Klebsiella aerogenes SKA1)厌氧发酵经过完全预处理的褐煤粉时产氢气效果最佳。

[0067] 对预处理前后及产气后的褐煤煤粉进行工业分析(表3)和元素分析(表4)，结果表明褐煤煤粉经过微生物发酵产气后并未发生明显的理化性质的改变，后续回收后还可以继续使用。而且在厌氧发酵过程褐煤煤粉中的一部分无机硫被微生物利用，可以减少后续利用过程中硫的环境污染问题。

[0068] 表3产气前后煤的工业分析

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[0071] 表4产气前后煤的元素分析

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