一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物及方法

摘要

本发明公开一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物及方法，雌雄性别鉴定引物包括四对引物PV625、PV430、PV389和PU318中的任意一对，每对所述引物包括正向引物和反向引物，雌雄性别鉴定方法包括：(1)提取刺边小金发藓基因组DNA；(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；(3)将步骤(2)中PCR扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测刺边小金发藓的雌雄性别。本发明还提供上述雌雄性别鉴定引物或PCR试剂盒在刺边小金发藓的雌雄性别鉴定中的应用。本发明设计的刺边小金发藓的雌雄鉴定引物在小金发藓雌雄样本中扩增的特异性强，扩增效率高，扩增效果好，可以用于快速、准确的鉴定刺边小金发藓的雌、雄株。

权利要求

1.一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物，其特征在于，包括三对引物PV625、PV430和PV389中的任意一对，每对所述引物包括正向引物和反向引物，其中，所述PV625的正向引物为SEQ ID NO:1的序列，反向引物为SEQ ID NO:2的序列；所述PV430的正向引物为SEQ ID NO:3的序列，反向引物为SEQ ID NO:4的序列；所述PV389的正向引物为SEQ ID NO:5的序列，反向引物为SEQ ID NO:6的序列。

2.一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)提取刺边小金发藓基因组DNA；

(2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用权利要求1所述的引物进行PCR扩增；

(3)将步骤(2)中PCR扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测刺边小金发藓的雌雄性别，其中，利用引物PV625、PV430或PV389时，雄性刺边小金发藓基因组DNA能够扩增出条带，雌性刺边小金发藓基因组DNA无扩增。

3.如权利要求2所述的雌雄性别鉴定方法，其特征在于，所述PCR扩增的反应体系包括：

12.5uL PCR premix，1uL DNA模板，9.5uL去离子水，1uL浓度为10uM的权利要求1所述的正向引物，1uL浓度为10uM的权利要求1所述的反向引物。

4.如权利要求2所述的雌雄性别鉴定方法，其特征在于，所述PCR的反应条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸45秒，33个反应循环后，72℃进一步延伸10分钟。

5.一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定的PCR试剂盒，其特征在于，包括权利要求1所述的引物。

6.权利要求1所述的刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物或权利要求5所述的刺边小金发藓的雌雄性别鉴定的PCR试剂盒在刺边小金发藓的雌雄性别鉴定中的应用。

说明书

一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物及方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体涉及一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物及方法。

背景技术

[0002] 苔藓植物是现存的最早的有胚植物和先锋植物，代表了陆地植物的重要分支，具有重要的生态和经济价值。苔藓植物包括苔类(～7300种)、藓类(～13000种)和角苔类(～250种)三大支。陆地植物中，维管植物是孢子体世代占主导，而苔藓植物是配子体世代占主导，孢子体世代寄生于配子体上。苔藓植物中60％左右都是雌雄异株，孢子萌发后，经过营养生长阶段，到达生殖阶段，雌株发育出颈卵器，雄株发育出精子器，并释放精子，精子游动到颈卵器上，完成受精，受精的卵子发育成孢子体，孢子体寄生在配子体上，直到成熟，并释放孢子。苔藓植物矮小，其雌雄株在营养生长阶段很难区分，甚至到了生殖生长阶段，由于苔藓植物的性器官及其微小，雌雄株依然很难分辨。这影响了对苔藓植物利用和保护遗传学的研究。

[0003] 为了快速、准确的鉴定苔藓植物的性别，开发苔藓植物性别鉴定的分子标记十分重要。以刺边小金发藓(Pogonatum cirratum Bird.)为苔藓植物的代表，其属于金发藓科植物，高度抗逆，生长在林边和树基，热带亚洲广泛分布，植物体大，高8‑15厘米，形如小松苗，是良好的森林地被植物，可用于园林绿化、盆景、微景观搭配等，具有重要的生态和经济价值。刺边小金发藓属于雌雄异株，其雌、雄株在营养生长阶段高度相似，无法区分，妨碍了对其进行有效的栽培和种植。

发明内容

[0004] 本发明提供一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物及方法，旨在解决苔藓植物的性器官极其微小，刺边小金发藓雌雄株在营养生长阶段高度相似，无法区分的技术问题。

[0005] 本发明提供一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物，包括四对引物PV625、PV430、PV389和PU318中的任意一对，每对所述引物包括正向引物和反向引物，其中所述PV625包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列或者与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列组成；所述PV430包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列或者与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列组成；所述PV389包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列或者与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列组成；所述PU318包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列或者与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列组成。

[0006] 本发明还提供一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定方法，包括以下步骤：

[0007] (1)提取刺边小金发藓基因组DNA；

[0008] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用上述的引物进行PCR扩增；

[0009] (3)将步骤(2)中PCR扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测刺边小金发藓的雌雄性别。

[0010] 进一步地，所述PCR扩增的反应体系包括12.5uL PCR premix，1uL DNA模板，9.5uL去离子水，1uL浓度为10uM的上述的正向引物，1uL浓度为10uM的上述的反向引物。

[0011] 进一步地，所述PCR的反应条件为：95℃预变性3分钟，95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸45秒，33个反应循环后，72℃进一步延伸10分钟。

[0012] 进一步地，利用PV625、PV430和PV389时，雄性刺边小金发藓基因组DNA能够扩增出条带，雌性刺边小金发藓基因组DNA无扩增；利用PU318时，雌性刺边小金发藓基因组DNA能够扩增出条带，雄性刺边小金发藓基因组DNA无扩增。

[0013] 本发明还提供一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定的PCR试剂盒，包括上述的引物。

[0014] 本发明还提供上述的刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物或上述的刺边小金发藓的雌雄性别鉴定的PCR试剂盒在刺边小金发藓的雌雄性别鉴定中的应用。

[0015] 与现有技术相比，本发明的有益效果是：

[0016] 本发明通过测序刺边小金发藓的雌、雄株染色体级别的基因组，获得了该物种雌雄株的基因组信息，通过注释、比对和比较分析，获得了雌雄株特异的性染色体上的基因，并对其进行引物设计，获得了3对鉴定雄株的引物和1对鉴定雌株的引物，这四对引物扩增效率高，扩增结果稳定，鉴定效果好，适宜用于刺边小金发藓在任何生长发育阶段的性别鉴定，解决了刺边小金发藓雌、雄株鉴定的难题。并且使用本发明的引物，能够高效的鉴定刺边小金发藓的雌株和雄株，从而能够促进保育和遗传学研究。

附图说明

[0017] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对本发明实施例的描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0018] 图1为雌性样本的染色体HIC交互热图；

[0019] 图2为雄性样本的染色体HIC交互热图；

[0020] 图3为四对性别鉴定引物的雌、雄特异性扩增产物的电泳结果。

具体实施方式

[0021] 为了使本发明要解决的技术问题、技术方案及有益效果更加清楚明白，以下结合实施例及附图，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。以下结合具体实施例对本发明作具体的介绍。

[0022] 本发明实施例提供一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物，包括四对引物PV625、PV430、PV389和PU318中的任意一对，每对所述引物包括正向引物和反向引物，其中所述PV625包含SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列或者与SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2的序列组成；所述PV430包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列或者与SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4的序列组成；所述PV389包含SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列或者与SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6的序列组成；所述PU318包含SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列或者与SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8同源性80％以上的序列，或者由SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8的序列组成。

[0023] 本发明实施例还提供一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定方法，包括以下步骤：

[0024] (1)提取刺边小金发藓基因组DNA；

[0025] (2)以步骤(1)提取的基因组DNA为模板，利用上述的引物进行PCR扩增；

[0026] (3)将步骤(2)中PCR扩增后得到的产物进行电泳分离，根据带型判定所检测刺边小金发藓的雌雄性别。

[0027] 进一步地，所述PCR的反应体系包括12.5uL PCR premix，1uL DNA模板，9.5uL去离子水，1uL浓度为10uM的上述的正向引物，1uL浓度为10uM的上述的反向引物。

[0028] 进一步地，所述PCR的反应条件为95℃预变性3分钟，95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸45秒，33个反应循环后，72℃进一步延伸10分钟。

[0029] 进一步地，利用PV625、PV430和PV389时，雄性刺边小金发藓基因组DNA能够扩增出条带，雌性刺边小金发藓基因组DNA无扩增；利用PU318时，雌性刺边小金发藓基因组DNA能够扩增出条带，雄性刺边小金发藓基因组DNA无扩增。

[0030] 本发明实施例还提供一种刺边小金发藓的雌雄性别鉴定的PCR试剂盒，包括上述的引物。

[0031] 本发明实施例还提供上述的刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物或上述的刺边小金发藓的雌雄性别鉴定的PCR试剂盒在刺边小金发藓的雌雄性别鉴定中的应用。

[0032] 本发明实施例还提供上述的刺边小金发藓的雌雄性别鉴定引物的基因筛选及设计方法，通过测序刺边小金发藓的雌、雄株染色体级别的基因组，获得了该物种雌雄株的基因组信息，通过注释、比对和比较分析，获得了雌雄株特异的性染色体上的基因，并对其进行引物设计，获得了3对鉴定雄株的引物和1对鉴定雌株的引物，包括以下步骤：

[0033] 步骤S1、刺边小金发藓雌、雄样本的采集和材料准备：

[0034] 通过野外采集获取具有显著雌雄分化的样本，实验室显微观察，对雌雄器官进行切片鉴定，在解剖镜下分选雌、雄株样本，蒸馏水清洗干净。用流式细胞仪对样本进行C值测定获得样本的基因组大小预估；同时对部分样本进行HIC文库的构建并测序获得下机数据，用于将组装好的序列挂载到染色体上。

[0035] 步骤S2、DNA和RNA的提取，文库构建和转录组测序：

[0036] 对步骤S1获得的干净样本分别进行DNA和RNA的提取，文库构建和高通量测序，获得基因组长度长三代Nanopore数据，测序深度>60X，用于基因组组装；获得短读长二代全基因组测序数据(测序深度～100X)，用于基因组大小预估和组装基因组的碱基矫正；获得转录组数据，用于辅助基因注释。

[0037] 步骤S3、基因组的组装：

[0038] 将步骤S2获得的二代下机数据用fastQC和Trimmomatic进行质控。结合基因组预估大小，用Nextdenovo对三代测序数据完成基因组组装，得到基因组初步组装结果。

[0039] 步骤S4、基因组组装结果矫正：

[0040] 将步骤S3获得的基因组初步组装结果用三代数据和二代数据分别进行3轮Racon和3轮pilon的迭代纠错，获得矫正后的组装结果。

[0041] 步骤S5、基因组的Hi‑C拼接：

[0042] 将步骤S4获得的矫正后的组装结果，用NCBI BLAST工具包的BLASTN比对藓类细胞器数据库，过滤掉细胞器序列后，用3D‑DNA流程进行HIC拼接，得到染色体级别的基因组，根据HIC热图初步鉴定雌、雄株中高度异质化的性别染色体U和V。

[0043] 步骤S6、基因预测和重复序列注释：

[0044] 将步骤S5获得的染色体级别的基因组组装结果用RepeatMasker进行重复序列注释，用BRAKER2流程进行蛋白编码基因的预测，并用Eggnog‑mapper进行蛋白功能注释，用BUSCO进行蛋白集的完整度评估。

[0045] 步骤S7、U/V染色体和雌雄特异基因的鉴定：

[0046] 对刺边小金发藓的雌、雄基因组序列做全局比对，进一步确定雌雄株的性别染色体，获取其染色体编号。同时对雌雄株的蛋白集采用NCBI BLAST工具包的BLASTP进行相互比对，获得比对文件。结合比对文件和性别染色体的编号，鉴定U和V性染色体上的雌雄特异基因。

[0047] 步骤S8、雌雄特异基因片段的引物设计和PCR实验验证：

[0048] 将步骤S7获得的U/V特异基因映射到雌、雄基因组序列上，并在Geneious软件中在这些雌、雄特异基因的CDS区间内设计引物序列。对设计的引物序列在11个雌性和11个雄性中做PCR扩增验证，证明其扩增特异性和鉴定的可靠性。

[0049] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到，未详细描述的技术均按照本领域人员熟知的标准方法进行。本申请中提及的试剂及载体等均有商品供应或以别的途径能为公众所得，它们仅作为举例，对本发明不是唯一的，可分别用其它适合的工具或生物材料来替代。

[0050] 实施例1雌雄性别鉴定引物的基因筛选

[0051] S1刺边小金发藓雌、雄样本的采集和材料准备：

[0052] 通过对深圳市大梧桐山顶的刺边小金发藓居群进行长期观察，在该物种的生殖生长阶段对其进行野外采集，获得了大量的雌雄分化显著的刺边小金发藓材料。用塑料保鲜盒将样本带回实验室，对其进行样本形态学解剖和鉴定，并在解剖镜下分离雌、雄样本，长有孢蒴的为雌株，长有精子器的为雄株，对两份材料用无菌水冲洗多次后，再一次解剖镜镜检，排除污染。挑选部分雌、雄新鲜样本并利用流式细胞仪分别对其进行C值测定，每个样本三个重复，获取其基因组大小信息；同时对其进行了Hi‑C建库和illumina二代高通量测序，每个样本下机数据100Gb，用于组装基因组序列挂载染色体。

[0053] 该步骤中，由专业人士鉴定，镜检分离刺边小金发藓的雌株和雄株样本是关键，鉴定不准确造成的混样测序会加大后续组装分析的难度。

[0054] S2 DNA和RNA的提取，文库构建和转录组测序：

[0055] 将步骤S1获得的干净的刺边小金发藓的雌株和雄株材料分别放置于液氮中急冻，并研磨成粉，用CTAB法分别提取两份样本的总DNA和RNA并送到武汉未来组，对两个样本的DNA分别进行Nanopore三代文库构建和测序，获得下机长度长数据60Gb/样本、illumina二代高通量文库构建和测序，获得下机二代数据50Gb/样本，对RNA进行转录组测序，获得下机转录组数据12Gb/样本。

[0056] 本步骤中，DNA和RNA的提取、文库构建，高通量测序采用的是本领域常用的标准流程。本步骤的关键在于测序的数据量需要达到一定的基因组覆盖度，即测序深度，本项目三代测序达到了～60X的测序深度，二代测序达到了～100X的测序深度。

[0057] S3基因组的组装：

[0058] 将步骤S2获得的原始测序数据，在仙湖植物园超算平台上用NextDenovo v2.4.0软件进行组装。使用的主要参数为“seed_cutoff”，即长度大于该值的reads会被用作种子序列进行初始的纠错。该值的大小取决于两个因素：预估基因组大小G和指定的seed深度d。按长度从长到短的顺序取G×d数据量的reads，为seed序列，其最后一条read(也即为其中最短的read)的长度即为“seed_cutoff”的值。其中基因组预估大小G由前文所述基因组survey确定，深度d可人为指定，采用的值是45，平衡组装连续性和消耗的计算资源。同时通过配置文件使NextDenovo识别SGE(sun grid engine)集群环境，进行自动投递，以最大化利用集群计算资源。

[0059] 此步骤需要提前做流式细胞测定基因组大小，前期已经做了刺边小金发藓植物的C值测定，预估基因组大小为～660Mb；此外还应保证测序的深度，至少达到50X以上。

[0060] S4基因组组装结果矫正：

[0061] 将步骤S3得到的原始组装结果进行矫正。第一步是使用三代自纠错软件Racon进行校正，其作用主要为纠正基因组中结构变异(SV)和插入子(indel)。Racon的输入文件为使用minimap2将三代raw reads比对至基因组生成的SAM文件和基因组序列文件本身。minimap2比对使用适合nanopore数据的“‑ax map‑ont”模式，其他参数使用推荐的默认值。
对minimap2+Racon的自纠错过程进行3轮迭代，以获得最佳纠错效果。矫正的第二步是使用准确率更高的二代reads进行纠错。首先使用BWA工具将质控后的二代reads比对至前述Racon输出的基因组序列，比对算法选择适合短reads的“MEM”，生成BAM文件。然后使用Pilon读取BAM文件和基因组文件，运行模式选择适合短reads的“‑‑fix snps,indels”，对SNP和indel进行校正。对BWA+Pilon的纠错过程也进行3轮迭代，以获得更高的组装质量。经过3轮Racon和3轮pilon的迭代纠错，获得高准确性的基因组初步组装。

[0062] 此步骤需要用到前面测序短片段文库得到的二代reads，其测序深度应该在50‑100X。

[0063] S5基因组的Hi‑C拼接：

[0064] 对步骤S4得到的矫正好的组装结果，通过NCBI BLAST工具包的BLASTN比对藓类植物的细胞器序列数据库过滤掉细胞器序列之后，对其进行了HIC拼接，以期得到染色体水平的基因组。HIC文库的下机数据使用FastQC和Trimmomatic，采用默认的参数进行下机数据的过滤。获得高质量且不含有接头序列的数据后，使用常用的Juicer流程提取PE reads对中包含有效数据的read pair，即valid pair。Juicer的输出为经过筛选的PE reads对，其包含了染色质DNA的互作信息，作为3D‑DNA pipeline的输入。由于初步组装的质量较好，连续性强，如contig/scaffold N50达到了68Mb，因此先使用3D‑DNA的visualize模块对输入的基因组进行可视化，评估各contig/scaffold之间，以及contig/scaffold内部的Hi‑C交互情况。该模块的输出为与基因组配套的“.hic”和“.assembly”文件，此时将其作为输入文件，直接从原始组装出发，利用同为Aiden实验室开发的一款可手工调整Hi‑C热图的桌面软件Juicebox，根据Hi‑C交互热图对contigs/scaffolds进行拼接、转向和切割等操作，保存新的“.assembly”文件后导入3D‑DNA的review模块，即可生成手工调整后的染色体水平的基因组序列。刺边小金发藓的雌、雄基因组分别挂载到了8条染色体上，基因组大小为～680Mb，与预估的660Mb极为接近，contig N50和scaffold N50达到了68Mb，组装连续性极好。

[0065] 此步骤还将获得刺边小金发藓雌株(图1)和雄株的基因组HIC交互热图(图2)，热图上与其他染色体没有交联的染色体可能是苔藓植物的性染色体。因此，根据HIC热图，可以初步确定雌、雄株的性染色体。

[0066] 从图1看出，刺边小金发藓的雌性样本包括7条常染色体和1条性染色体，与文献报道一致。右下角第八条代表异染色质化的性染色体U；从图2看出，刺边小金发藓的雄性样本包括7条常染色体和1条性染色体，与文献报道一致。右下角第八条染色体代表异染色质化的性染色体V。

[0067] S6重复序列注释和基因预测：

[0068] 基因组中的重复序列(repetitive sequences)是指位于基因组不同区域的具有相似碱基序列的或者对称性的DNA片段，其中相似的碱基序列既包括同一个基因组中相似的片段，也包括不同物种间基因组中的相似片段。重复序列几乎存在于所有真核生物的基因组中，其在人类基因组中占比约为50％，而在植物基因组中一般占比更高。为了后续准确地进行基因结构的注释，需要先将基因组中的重复序列进行鉴定和屏蔽。本研究使用RepeatMasker软件(https://www.repeatmasker.org/)以RepBase作为重复序列数据库，对苔藓基因组中的重复序列进行鉴定，设置其使用的搜索引擎为NCBI BLAST工具包的RMblast，以获得较快的搜索速度和较高的准确度。

[0069] 根据重复序列注释文件中的重复序列座位信息屏蔽了基因组中的重复序列，然后采用BRAKER2流程对基因组进行了蛋白基因注释。BRAKER2调用从头(ab initio)注释工具Genemark(http://exon.gatech.edu/GeneMark/)进行从头预测，仅需指定运行模式为真核(“‑‑ES”)即可，同时结合同源蛋白证据和转录组证据。BRAKER2运行的具体参数为“‑‑etpmode‑‑prot_seq＝prot.fa‑‑bam＝accepted_hits.bam‑‑softmasking‑‑gff3”，其中“‑‑etpmode”指定了运行模式为真核(eukaryotic)、转录组(transcriptome)支持和同源蛋白(protein)支持；“prot.fa”为使用的同源蛋白序列文件；accepted_hits.bam”为Tophat2输出的BAM文件，代表了转录组证据；“‑‑softmasking”表示输入的基因组序列已经过软屏蔽；“‑‑gff3”指定额外输出为GFF3格式，方便后续处理。

[0070] 获得了基因注释结果后，用基因组完整性评估工具BUSCO以蛋白模式运行，评估蛋白集的完整度；同时用在线工具EGGNOG‑mapper(http://eggnog‑mapper.embl.de/)对蛋白集进行功能注释。

[0071] 此步骤中的重复序列注释、基因注释、基因功能预测和基因集完整度评估是基因组学领域的标准操作流程。此步骤对雌、雄基因组分别注释到了30223和30932个基因。

[0072] S7 U/V染色体和雌/雄特异基因的鉴定：

[0073] 通过步骤S5的HIC热图初步确定了性别染色体U和V。接着，通过对刺边小金发藓雌/雄株的基因组序列进行全局共线性比较，发现刺边小金发藓的雌、雄株的7条常染色体(chr1‑chr7)具有极高的共线性，而性别染色体(U/V)几乎完全没有共线性，因此可以进一步确定雌雄株的性染色体并获取其染色体编号。然后，用NCBI BLAST工具包的BLASTP对雌/雄株的蛋白集进行两两比对，e‑value阈值设置为1e‑5，获取比对文件。结合性染色体的编号，确定雌、雄株性染色体上特有的基因，即雌雄特异基因。

[0074] 此步骤中，从HIC热图证据和全局比对证据确定雌、雄株组装结果的U、V性别染色体是关键，通过比对文件，获取雌、雄性染色体上特有的基因序号。U染色体长15Mb，编码443基因，其中60基因为雌性特有；V染色体长29Mb，编码1081基因，其中158基因为雄性特有。

[0075] 实施例2雌/雄特异基因片段的引物设计：

[0076] 将通过步骤S7鉴定到的雌/雄特异基因序号投射到雌/雄刺边小金发藓的性别染色体U/V的基因序列上，选择长度>350bp的外显子区，在其外显子区内部进行引物设计。为了提高扩增效率，引物设计的原则是：扩增的目标片段长度300～700bp。同时引物长度在18～25bp，引物GC含量在40％～60％，引物3′端要避开密码子的第3位，引物3′端不能选择A，碱基要随机分布，引物自身及引物之间不应存在互补序列，扩增产物的单链不能形成二级结构。引物的命名采用的是P(引物的英文Primer首字母)+U/V(特异性片段所在的性染色体)+引物扩增得到的目标片段大小，例如PV625代表V染色体上的扩增目标长度为625bp的引物对。引物设计好后，委托金唯智公司进行引物合成，并将其溶解、稀释达到10uM浓度的工作浓度。

[0077] 此步骤中，由于性染色体含有极高的重复序列，在雌/雄特异基因的外显子区内部设计引物比较稳妥，可以保证扩增的特异性和准确性。由于大部分雌雄特异性基因的外显子都非常短，难以保证产物的长度。最初共设计了10对引物，经过预实验，发现其中4对有雌、雄特异性的扩增产物：3对来自雄性V染色体的特有基因，1对来自雌性U染色体的特有基因，可用于刺边小金发藓的雌/雄鉴定。4对有雌、雄特异性的扩增产物的序列见下表1：

[0078]

[0079] S9刺边小金发藓雌雄鉴定引物的实际应用：

[0080] 选取刺边小金发藓繁殖生长阶段的具有显著分化的雌性和雄性样本各11株，每个样本取少许叶片，采用CTAB法分别提取样本的DNA。用步骤S8得到的4对引物，对雌/雄DNA样本开展PCR扩增。PCR反应体系是25uL，包括12.5uL PCR premix(2x Vazyme Lamp Master Mix，Dye Plus，货号：挪威赞P312‑01)，1uL DNA模板，9.5uL去离子水，1uL正向引物和1uL反向引物。PCR扩增的循环设置为，95℃预变性3分钟，95℃变性1分钟，52℃退火1分钟，72℃延伸45秒，33个反应循环后，72℃进一步延伸10分钟。

[0081] 取PCR产物5uL在1％的琼脂糖凝胶上样，电泳条件为：电流80A，电压120V，电泳缓冲液为1×TAE，电泳20分钟结束后，在BIO‑RAD凝胶成像系统紫外灯下拍照，结果如图3所示，电泳胶图每行22个样本，11个雌性(F1‑F11)和11个雄性样本(M1‑M11)。L代表DNA Ladder。电泳共四行，分别是4对引物的扩增结果：3对雄性特异性扩增引物(PV625，PV430，PV389)，1对雌性特异性扩增引物(PU318)。

[0082] 从图3可得出结论：设计的刺边小金发藓的雌雄鉴定引物PV625，PV430，PV389，PU318在小金发藓雌雄样本中扩增的特异性强，扩增效率高，扩增效果好，可以用于快速、准确的鉴定刺边小金发藓的雌、雄株。

[0083] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。