一组用于诊断干燥综合征的分子标志物组合

摘要

本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及一组用于诊断干燥综合征的分子标志物组合。具体地，本发明提供了可以用于诊断干燥综合征的分子标志物，所述分子标志物包括HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J。

权利要求

1.一种用于诊断干燥综合征的分子标志物组合，所述分子标志物组合选自以下任意一组：（1）HADH和SCGB1D1，

（2）HADH和HIST1H4J，

（3）HADH、SCGB1D1和HIST1H4J，（4）HADH、C5、SCGB1D1和HIST1H4J。

2.检测HADH或SCGB1D1的表达水平的试剂在制备诊断干燥综合征的产品中的应用。

3.检测权利要求1所述分子标志物组合的表达水平的试剂在制备诊断干燥综合征的产品中的应用。

4.如权利要求2或3所述的应用，所述检测表达水平的试剂包括检测分子标志物蛋白表达量或分子标志物mRNA表达量的试剂。

5.如权利要求4所述的应用，所述检测分子标志物蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：苏木精‑伊红染色法、番红O‑固绿染色、蛋白质印迹、酶联免疫吸附测定、放射性免疫测定、免疫组织化学染色方法、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。

6.如权利要求4所述的应用，所述检测分子标志物mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR原理的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。

7.如权利要求4所述的应用，所述表达量是针对来自于受试者的样本进行的检测，所述样本是血液。

8.诊断干燥综合征的试剂盒在制备诊断干燥综合征的产品中的应用，所述诊断干燥综合征的试剂盒中含有检测分子标志物或分子标志物组合表达量的试剂；所述分子标志物是HADH或SCGB1D1，所述分子标志物组合选自以下任意一组：（1）HADH和SCGB1D1，

（2）HADH和HIST1H4J，

（3）HADH、SCGB1D1和HIST1H4J，（4）HADH、C5、SCGB1D1和HIST1H4J。

9.如权利要求8所述的应用，所述诊断干燥综合征的试剂盒中还包括以下任意一种或多种：（1）检测受试者的表达量所使用的仪器；

（2）检测其他疾病标志物的试剂；

（3）mRNA表达量辅助检测试剂，所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：使引物对应的扩增子可视化的反应试剂、RNA提取试剂、逆转录试剂、cDNA扩增试剂、制备标准曲线所用的标准品、阳性对照品；

（4）蛋白表达量辅助检测试剂，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括封闭液、抗体稀释液、洗涤缓冲液、显色终止液。

说明书

一组用于诊断干燥综合征的分子标志物组合

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术、生物医药领域，具体涉及一组用于诊断干燥综合征的分子标志物组合。

背景技术

[0002] 干燥综合征是一种长期的自身免疫性疾病，会影响身体产生水分的腺体(泪腺和唾液腺)，并且经常严重影响其他器官系统，例如肺、肾和神经系统。主要症状是干燥(口干和眼睛干涩)、疼痛和疲劳。其他症状可能包括皮肤干燥、阴道干燥、慢性咳嗽、手臂和腿部麻木、感觉疲倦、肌肉和关节疼痛以及甲状腺问题。虽然发病原因尚不清楚，但根据目前的研究干燥综合征的发明涉及遗传因素和环境因素的结合，例如接触病毒或细菌。它可以独立于其他健康问题(原发性干燥综合征)或由于另一种结缔组织疾病(继发性干燥综合征)而发生。

[0003] 虽然干燥综合征是最常见的自身免疫性疾病之一，但它没有特异性和非侵入性的诊断测试，往往容易误诊。

[0004] 对于诊断干燥综合征，需要有明显的临床症状。干燥综合征往往表现为反复口干眼干，牙齿片状脱落被称为猖獗牙齿。患者口干症状往往表现为吞咽干粮难以咽下，需要用水顺服。眼干主要表现为眼睛干涩明显，泪液减少，严重会出现反复角膜炎。部分患者会出现反复无痛性腮腺以及颌下腺肿大。少部分会出现间质性肺炎，肾小管酸中毒，血小板减少等。除了临床症状，血清学检查对于诊断干燥综合征尤其重要，比如自身抗体显示抗核抗体，抗SSA，SSB，RO52抗体阳性，血沉增快，免疫球蛋白升高。对于确诊干燥综合征，最重要的检查是小唇腺活检，病理显示灶性淋巴细胞浸润，病理活检是前段干燥综合征的金标准。此外，一些其他的辅助检查，比如腮腺核素显像，泪液分泌实验，唾液腺流速都是诊断干燥综合征非常重要的检查。

[0005] 目前，干燥综合征目前尚无根治的方法，治疗主要包括对症治疗和系统治疗，对症治疗则为局部对症治疗为主。虽然尚没有完全根治的办法，但是大部分干燥综合征进展比较缓慢，预后比较良好，少部分干燥综合征会出现严重的并发症，因此早期诊断以及系统治疗对于改善预后非常重要，大部分病情会得到很好的控制。

发明内容

[0006] 如本发明所述“干燥综合征”(又称sicca syndrome，SS； 综合征)是一个主要累及外分泌腺体的慢性炎症性自身免疫病，又名自身免疫性外分泌腺体上皮细胞炎或自身免疫性外分泌病。干燥综合征是一种以侵犯外分泌腺，尤其是唾液腺及泪腺为主的慢性全身性疾病，不仅可表现为干眼症，口干燥症也可伴有内脏损害，比如肺，肝脏，胰腺，血液系统，神经系统受累等而出现复杂的临床表现，重要脏器受累还可危及生命。

[0007] 目前，干燥综合征的诊断为没有特异性强、准确性高的诊断方法。

[0008] 为解决该技术问题，本发明提供以下技术方案：

[0009] 本发明提供了一种诊断干燥综合征的分子标志物组合，所述分子标志物组合中包括HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J中的两种、三种、四种。

[0010] 优选地，所述分子标志物组合选自以下任意一组：

[0011] (1)HADH、SCGB1D1，

[0012] (2)HADH、HIST1H4J，

[0013] (3)HADH、SCGB1D1、HIST1H4J，

[0014] (4)HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J。

[0015] 在一种实施方式中，所述分子标志物组合中还可以包括其他分子标志物。

[0016] 优选地，所述HADH在患者中高表达。

[0017] 优选地，所述C5在患者中高表达。

[0018] 优选地，所述SCGB1D1在患者中低表达。

[0019] 优选地，所述HIST1H4J在患者中高表达。

[0020] 如本发明所述“高表达”、“低表达”是分子标志物在干燥综合征患者体内的表达量相对于非患者的变化趋势，所述非患者是指不患有干燥综合征的受试者，同时包括了患有干眼症的受试者。如本发明所述“干眼症”是各种因素导致的泪液的质或量的异常，从而导致眼睛不适症状的一类疾病，主要就引起眼睛的不适症状，表现为干涩，少泪，异物感等。

[0021] 本发明所述HADH全称为Hydroxyacyl‑CoA Dehydrogenase，NCBI编号3033，Ensembl ID：ENSG00000138796。

[0022] 本发明所述C5全称为Complement  C5，NCBI编号727，Ensembl  ID：ENSG00000106804。

[0023] 本发明所述SCGB1D1全称为Secretoglobin Family 1D Member 1，NCBI编号10648，Ensembl ID：ENSG00000168515。

[0024] 本发明所述HIST1H4J全称为H4 Clustered Histone 11，NCBI编号8363，Ensembl ID：ENSG00000197238。

[0025] 另一方面，本发明提供了检测HADH或SCGB1D1的表达水平的试剂在制备诊断干燥综合征的产品中的应用。

[0026] 另一方面，本发明提供了检测前述分子标志物组合的表达水平的试剂在制备诊断干燥综合征的产品中的应用。

[0027] 优选地，所述检测表达水平的试剂包括检测分子标志物蛋白表达量和/或分子标志物mRNA表达量的试剂。

[0028] 优选地，所述检测分子标志物蛋白表达量的试剂包括以下方法中使用的试剂：苏木精‑伊红染色法(hematoxylin‑eosin staining，简称HE染色法)、番红O‑固绿染色、蛋白质印迹(Western Blot法)、酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射性免疫测定(RIA)、夹心测定、免疫组织化学(Immunohistochemistry)染色方法、质谱法、免疫沉淀分析法、补体结合分析法、流式细胞荧光分边技术和蛋白质芯片法。

[0029] 优选地，所述检测分子标志物mRNA表达量的试剂包括以下方法中使用到的试剂：基于PCR原理的检测方法、Southern杂交方法、Northern杂交方法、点杂交方法、荧光原位杂交方法、DNA微阵列方法、ASO法、高通量测序平台方法。

[0030] 优选地，所述基于PCR原理的检测方法包括以下至少任意一种：将提取RNA的步骤、mRNA逆转录为cDNA的步骤、测量cDNA的含量的步骤。

[0031] 优选地，所述测量cDNA的含量的方法包括但不限于PCR、NASBA、RPA、SDA、LAMP、HAD、NEAR、MDA、RCA、LCR、RAM。

[0032] 优选地，所述检测mRNA表达量的试剂包括特异性引物和/或探针。

[0033] 优选地，所述探针包括杂交型探针和水解型探针(Taqman探针)。

[0034] 术语“样本”可以是从受试者分离的任何生物样本。例如，样本可以包括但不限于体液、全血、血小板、血清、血浆、粪便、红细胞、白细胞或白血球、内皮细胞、组织活组织检查、滑液、淋巴液、腹水、间质或细胞外液、细胞间空间的液体，包括龈沟液、骨髓、脑脊液、唾液、粘液、痰、精液、汗液、尿液、鼻刷液、巴氏涂片液或任何其他体液。体液可以包括唾液、血液或血清。例如，多核苷酸可以是从体液例如血液或血清分离的无细胞DNA。

[0035] 优选地，如本发明验证分子标志物功能时所使用的数据集GSE84844中使用的样本是血液。

[0036] 另一方面，本发明提供了一种诊断干燥综合征的系统，所述系统包括计算患病风险值的计算装置。

[0037] 在一种实施方式中，所述系统包括用于输入HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J中的两种、三种、四种的表达量的输入装置。

[0038] 在一种实施方式中，所述系统还可以包括用于输出诊断结果的输出装置。

[0039] 在一种实施方式中，所述系统还可以包括检测mRNA和/或蛋白表达量的检测装置。

[0040] 在一种实施方式中，所述系统还包括评估结果发送单元，所述评估结果发送单元可以将受试者的评估结果发送到患者或医护人员可以查阅的信息通信终端装置。

[0041] 另一方面，本发明提供了一种诊断受试者是否患有干燥综合征的试剂盒，所述试剂盒包括检测HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J中的两种、三种、四种的试剂。

[0042] 在一种实施方式中，所述试剂盒还包括前述检测受试者的表达量所使用的仪器。

[0043] 在一种实施方式中，所述试剂盒还可以包括检测其他疾病标志物的试剂。

[0044] 在一种实施方式中，所述试剂盒还可以包括检测基因表达量的仪器。

[0045] 在一种实施方式中，所述表达量包括mRNA表达量、蛋白表达量。

[0046] 优选地，所述试剂盒还可以包括mRNA表达量辅助检测试剂，所述mRNA表达量辅助检测试剂包括但不限于：使所述引物对应的扩增子可视化的反应试剂，例如通过琼脂糖凝胶电泳法、酶联凝胶法、化学发光法、原位杂交法、荧光检测法等使扩增子可视化的试剂；RNA提取试剂；逆转录试剂；cDNA扩增试剂；制备标准曲线所用的标准品；阳性对照品。

[0047] 优选地，所述试剂盒还可以包括蛋白表达量辅助检测试剂，所述蛋白表达量辅助检测试剂包括但不限于：封闭液；抗体稀释液；洗涤缓冲液；显色终止液。

[0048] 另一方面本发明还提供了前述试剂盒、系统在制备诊断干燥综合征的产品中的应用。

[0049] 另一方面本发明提供诊断受试者是否患有干燥综合征的方法，所述方法包括检测受试者的HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J中的两种、三种、四种的表达量，根据分子标志物的表达量判断受试者是否患有干燥综合征。

[0050] 本发明所述的“方法、系统”的实施可包括手动地、自动地、或它们组合地来执行或完成所选任务。

[0051] 而且，根据本发明方法、系统的实施方式的实际仪器和设备，可通过硬件、通过软件、或通过固件或通过它们的组合使用操作系统来实施多个所选任务。

[0052] 优选地，所述受试者为哺乳动物，例如牛科动物、马科动物、羊科动物、猪科动物、犬科动物、猫科动物、啮齿类动物、灵长类动物。

[0053] 优选地，所述受试者为人。

附图说明

[0054] 图1是本发明参与者的体征和眼表疾病指数量表的检查信息。

[0055] 图2是HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J在干燥综合征vs健康者之间的差异表达结果图。

[0056] 图3是HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J单独诊断干燥综合征时的ROC曲线。

[0057] 图4是多个分子标志物联合后诊断干燥综合征时的ROC曲线。

[0058] 图5是HADH、C5、SCGB1D1和HIST1H4J联合诊断干燥综合征时的ROC曲线。

具体实施方式

[0059] 下面结合实施例对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

[0060] 实施例1、差异基因筛选及功能验证

[0061] 根据对体征(角膜荧光染色评分、BUT数值、schirmer数值、结膜充血评分)和眼表疾病指数量表(OSDI)的检查，确认本发明纳入的健康者均未患有眼科相关疾病。

[0062] 干燥综合征、普通干眼(干眼症患者)的确诊由临床医生根据常用诊断标准进行判断，各组样本收集自临床。

[0063] 在各组参与者之间随机挑选6位进行下一步实验，对三组共18位参与者的体征(角膜荧光染色评分、BUT数值、schirmer数值、结膜充血评分)和眼表疾病指数量表(OSDI)的检查信息汇总如附图1所示。

[0064] 针对以上18位参与者收集样本，对样本进行蛋白测序。测序完成后，成功获得原始下机数据，进行数据处理后，筛选在不同组之间具有显著差异表达的蛋白或肽段，各组之间表达量具有显著差异的蛋白或肽段的数量统计如表1所示。

[0065] 表1、组间差异蛋白或肽段数量统计

[0066]

[0067]

[0068] 为在大群体中筛选干燥症患者时，不受普通干眼患者的影响，选择在干燥综合征患者(SC)和普通干眼症患者(MC)之间、干燥综合征患者(SC)和健康对照(NC)之间都差异表达的蛋白，例如HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J。为确定准确性，使用含有30位干燥综合征和30健康者测序结果的数据(GSE84844)验证其诊断效能。ROC(receiver  operator characteristic curve)曲线，又称为受试者工作特征曲线，是反映灵敏度和特异度连续变量的综合指标，通常被用来直观地确定某一种诊断方法的最优诊断界值。ROC曲线下面的面积为AUC值(Area under Curve)，一般来说AUC的最小值为0.5，最大值为1，数值越大代表诊断越准确。

[0069] 表2、各目标基因在组间的变化趋势及诊断AUC值

[0070] 基因 SC vs NC1 SC vs MC2 AUC 差异表达附图 ROC附图HADH 上调 上调 0.75 2A 3A
C5 上调 上调 0.73 2B 3B
SCGB1D1 下调 下调 0.65 2C 3C
HIST1H4J 上调 上调 0.82 2D 3D

[0071] 备注：

[0072] 1、统计自蛋白测序结果和GSE84844中的数据。

[0073] 2、统计自蛋白测序结果。

[0074] 经分析，在干燥综合征患者vs健康者、干燥综合征患者vs普通干眼之间都存在一致性变化趋势的蛋白水平差异表达基因经mRNA表达量再次验证，基本可以实现在大量人群中准确筛选出干燥症患者的目的。

[0075] 表3、目标基因同时使用时的诊断AUC值

[0076]基因组合 AUC ROC附图
HADH_SCGB1D1 0.78 4A
HADH_HIST1H4J 0.86 4B
HADH_SCGB1D1_HIST1H4J 0.89 4C
HADH_C5_SCGB1D1_HIST1H4J 0.91 5

[0077] 为进一步尝试是否有可能提高诊断的准确性，将筛选到的基因进行组合，如以上表3中的数据表明，同时使用多个基因时，AUC数值有增长的趋势，共同使用HADH、C5、SCGB1D1、HIST1H4J进行区分时，AUC值可达到0.91左右，可实现精准的诊断功能。