一种用于检测水牛奶中掺假普通牛乳的单克隆抗体及其制备方法和用途

摘要

本发明公开一种用于检测水牛奶中掺假普通牛乳的单克隆抗体及其制备方法和用途。其次，本发明公开一种定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条，包括依次相连接并固定于PVC底板上的样品垫、释放垫、反应膜、吸水垫，释放垫上包被有可被检测的标记物标记的抗牛IgG单克隆抗体；反应膜上设置T线和C线，T线上包被有牛IgG抗原，C线上包被有羊抗鼠IgG抗体。采用所述试纸条检测水牛奶中掺假普通牛乳的方法具有准确度高，精密度好，检测时间短，操作简便的特点，且对操作人员要求低，不需要大型检验设备支持，非常适用于基层现场快速检验。

权利要求

1.一种用于检测水牛奶中掺假普通牛乳的单克隆抗体，所述单克隆抗体为抗牛IgG单克隆抗体，所述抗牛IgG单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。

2.一种定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条，所述试纸条包括依次相连接并固定于PVC底板上的样品垫、释放垫、反应膜、吸水垫，释放垫上包被有可被检测的标记物标记的权利要求1所述的抗牛IgG单克隆抗体；反应膜上设置有检测线（T线）和质控线（C线），所述检测线（T线）上包被有牛IgG抗原，质控线（C线）上包被有羊抗鼠IgG抗体。

3.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述可被检测的标记物选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金属颗粒、荧光素中的一种。

4.根据权利要求3所述的试纸条，其特征在于，可被检测的标记物选自荧光微球，进一步的，荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体浓度为2‑3 mg/mL。

5.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述反应膜由如下任意一种材料制得：

硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素酯膜、聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜。

6.根据权利要求2所述的试纸条，其特征在于，所述试纸条通过如下方法组装得到：将样品垫、释放垫、反应膜、吸水垫依次粘PVC底板上，底板一端端头为吸水垫，另一端端头为样品垫，反应膜两端分别与吸水垫和释放垫相互交叠连接，在释放垫上压有样品垫，用切割机切成3.5‑4.0mm宽度的试纸条，得到可定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条。

7.一种定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的方法，所述方法包括如下步骤：

（1）绘制标准曲线

a：取水牛奶阴性样品，向其中添加不同体积百分比或质量百分比的普通牛乳制备检测样本；

b：取适量检测样本滴加至权利要求2‑6任一所述的试纸条的样品垫上，恒温孵育，使用荧光免疫定量分析仪检测，激发波长360‑365nm，检测波长610‑615nm，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值，每个浓度重复检测5次，取平均值；

c：以添加的普通牛乳百分比为X轴，检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值（T/C）为Y轴，获得标准曲线；

（2）取适量待检样本滴加至试纸条的样品垫上，恒温孵育，使用荧光免疫定量分析仪检测，激发波长360‑365nm，检测波长610‑615nm，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值，将T线荧光信号值与C线荧光信号值的比值代入标准曲线中，得到待检样本中普通牛乳百分含量。

说明书

一种用于检测水牛奶中掺假普通牛乳的单克隆抗体及其制备

方法和用途

技术领域

[0001] 本发明属于食品质量安全检测领域，具体涉及一种用于检测水牛奶中掺假普通牛乳的单克隆抗体及其制备方法和用途。

背景技术

[0002] 本发明是CN202210965744.1的分案申请。

[0003] 水牛奶具有较高的营养价值，在民间素有“乳中珍品”的美誉，普遍受到消费者的欢迎。但是水牛奶的产量相对较低，导致其价格也比普通牛乳更高，市场上生水牛奶价格大约是普通牛乳的3倍。由于长期缺乏有效的监管手段和检测方法，在利益驱动下，养殖端频繁出现在水牛乳中掺入其他牛属乳，或以价格较低的荷斯坦牛乳或黄牛乳源冒充水牛乳的现象，严重影响水牛乳奶源收购质量及加工端的品牌信誉，扰乱市场秩序，侵害消费者利益，不利于全产业链健康发展。。因此，需要一种简单、易操作且适用于现场执法的技术手段对水牛奶掺假的现象进行监管。

[0004] 现有检测普通牛乳成分的检测技术可分为免疫学方法(免疫层析、酶联免疫吸附、免疫斑点等)和非免疫学方法(聚丙烯凝胶电泳或等电聚焦电泳，PCR、红外光谱学、色谱学、质谱学等)。其中，等电聚焦电泳是欧盟检测普通牛乳成分的参考方法，而PCR方法也写入了我国食品安全地方标准《DBS45/023‑2015水牛乳及其制品中掺入牛属乳的定性检测PCR法》。

[0005] 然而，非免疫方法以及酶联免疫吸附、免疫斑点等均涉及繁琐的专业操作及设备，不适用大范围推广使用。其次，多数乳制品掺假的免疫学检测方法是利用抗体来检测α‑酪蛋白、β‑酪蛋白、γ‑酪蛋白，以及β球蛋白和其它乳清蛋白等，但是这些蛋白难以区分某些种属乳品，如普通牛乳和水牛乳。因此，开发一种简单、易操作且适用于现场执法的快速检测试纸条用于检测水牛奶中是否掺假普通牛奶非常有必要。

[0006] 专利文献CN202010661984.3公开了一种用于检测水牛奶中掺入牛奶的特征肽及检测方法，所述方法通过高分辨质谱筛选得到水牛奶和牛奶的特异性肽段，可以实现对水牛奶中牛奶掺假的检测。虽然检测方法灵敏度较高，但对仪器设备及操作人员的要求较高，不符合快速检测的要求。

发明内容

[0007] 为了改善现有技术的不足，本发明以牛IgG为靶标，制备并纯化获得牛IgG Fc片段，并将其作为免疫原免疫小鼠制备抗牛IgG单克隆抗体；或者，本发明以牛α‑S1为免疫原，免疫小鼠制备抗牛α‑S1单克隆抗体。进一步，基于抗牛IgG单克隆抗体和/或抗牛α‑S1单克隆抗体建立一种适于基层现场使用的免疫层析检测方法，并将所述方法应用于水牛奶掺假普通牛乳的检测，该方法具有较好的准确度和精密度。

[0008] 本发明包括如下技术方案：

[0009] 第一方面，本发明提供一种用于检测水牛奶中掺假普通牛乳的单克隆抗体，所述单克隆抗体为抗牛IgG单克隆抗体、抗牛α‑S1单克隆抗体中的一种。抗牛IgG单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，重链可变区具有如SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列；抗牛α‑S1单克隆抗体的轻链可变区具有如SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列，重链可变区具有如SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列。

[0010] 第二方面，本发明提供一种制备用于检测水牛奶中掺假普通牛乳的单克隆抗体的方法，包括如下步骤：

[0011] (1)制备牛IgG抗原或者牛α‑S1抗原；

[0012] (2)免疫小鼠

[0013] 以牛IgG抗原或者牛α‑S1抗原定期皮下或腹腔注射免疫Balb/c小鼠，免疫后取血并分离血清，用ELISA方法检测血清中多抗效价；

[0014] (3)杂交瘤细胞株融合

[0015] 取血清效价高、灵敏度高的免疫小鼠的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，加入饲养细胞进行培养；

[0016] 所述骨髓瘤细胞为SP2/0细胞，所述细胞融合方法为PEG法。

[0017] (4)亚克隆及筛选

[0018] 吸出杂交瘤细胞上清液，以牛IgG Fc或者牛α‑S1多肽抗原为包被原采用间接ELISA方法筛选效价高的培养孔进行亚克隆，重复亚克隆直至孔中细胞株阳性率100％，将阳性杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存；

[0019] (5)单克隆抗体获取及纯化

[0020] 获得单克隆细胞株，腹部注射免疫小鼠获得腹水，产生的腹水用Protein A/G亲和柱纯化，获得牛IgG单克隆抗体或者牛α‑S1单克隆抗体。

[0021] 优选的，步骤(1)中所述的牛IgG抗原为牛IgG Fc片段，牛α‑S1抗原为牛α‑S1多肽抗原。

[0022] 所述牛IgG Fc片段通过如下方法制备得到：

[0023] (1)使用木瓜蛋白酶酶解牛IgG，超滤获得牛IgG Fab片段与Fc片段的混合物；

[0024] (2)混合物使用Protein A亲和柱纯化，得到牛IgG Fc片段。

[0025] 所述牛α‑S1多肽抗原通过如下方法制备得到：

[0026] (1)参照牛α‑S1全序列合成氨基酸序列为NQELAYFYPEL(SEQ ID NO:5)的α‑S1多肽片段；

[0027] (2)将α‑S1多肽片段与载体蛋白偶联，纯化，得到牛α‑S1多肽抗原。

[0028] 所述载体蛋白选自牛血清蛋白、卵清蛋白、血蓝蛋白、白喉类毒素、白喉毒素的无毒突变体、破伤风类毒素和细菌表达的蛋白中的任意一种载体蛋白或两种以上载体蛋白形成的融合蛋白。

[0029] 第三方面，本发明提供一种定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条，所述试纸条包括依次相连接并固定于PVC底板上的样品垫、释放垫、反应膜、吸水垫，释放垫上包被有可被检测的标记物标记的抗牛IgG单克隆抗体或者抗牛α‑S1单克隆抗体；反应膜上设置有检测线(T线)和质控线(C线)，所述检测线(T线)上包被有牛IgG抗原或牛α‑S1抗原，质控线(C线)上包被有羊抗鼠IgG抗体。

[0030] 所述可被检测的标记物选自荧光微球、乳胶微球、树脂微球、磁性微球、胶体金属颗粒、荧光素、量子点中的一种。

[0031] 在本发明的优选实施方式中，所述可被检测的标记物选自荧光微球，具体为荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体，或者，荧光微球标记的抗牛α‑S1单克隆抗。

[0032] 更优选的，所述荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体浓度为2‑3mg/mL，具体为2.0、2.1、2.2、2.3、2.4、2.5、2.6、2.7、2.8、2.9、3.0mg/mL；荧光微球标记的抗牛α‑S1单克隆抗浓度为3‑4mg/mL，具体为3.0、3.1、3.2、3.3、3.4、3.5、3.6、3.7、3.8、3.9、4.0mg/mL。

[0033] 在本发明的最优选实施方式中，所述荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体浓度为2.3mg/mL；荧光微球标记的抗牛α‑S1单克隆抗浓度为3.7mg/mL。

[0034] 所述反应膜由如下任意一种材料制得：硝酸纤维素膜、醋酸纤维素膜、混合纤维素酯膜、聚偏二氟乙烯膜、尼龙膜。

[0035] 在本发明的优选实施方式中，所述反应膜材料为硝酸纤维素膜，使用划膜仪包被T线(0.8μL/cm)和C线(0.8μL/cm)，牛IgG抗原包被浓度为1.6mg/mL，牛α‑S1抗原包被浓度为1.4mg/mL，羊抗鼠IgG抗体浓度为0.75mg/mL(0.7μL/cm)。

[0036] 本发明所述的试纸条通过如下方法组装得到：将样品垫、释放垫、反应膜、吸水垫依次粘PVC底板上，底板一端端头为吸水垫，另一端端头为样品垫，反应膜两端分别与吸水垫和释放垫相互交叠(1～3mm)连接，在释放垫上压有样品垫(交叠1～3mm)，用切割机切成3.5‑4.0mm宽度的试纸条，得到可定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条。

[0037] 第四方面，本发明提供一种定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的方法，所述方法包括如下步骤：

[0038] (1)绘制标准曲线

[0039] a：取水牛奶阴性样品，向其中添加不同体积百分比或质量百分比的普通牛乳制备检测样本；

[0040] b：取适量检测样本滴加至上述试纸条的样品垫上，恒温孵育，使用荧光免疫定量分析仪检测，激发波长360‑365nm，检测波长600‑610nm，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值，每个浓度重复检测5次，取平均值；

[0041] c：以添加的普通牛乳百分比为X轴，检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T/C)为Y轴，获得标准曲线；

[0042] (2)取适量待检样本滴加至上述试纸条的样品垫上，40℃恒温孵育5min，使用荧光免疫定量分析仪检测，激发波长360‑365nm，检测波长610‑615nm，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值，将T线荧光信号值与C线荧光信号值的比值代入标准曲线中，得到待检样本中普通牛乳百分含量。

[0043] 本发明提供的可定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条检测原理为：以抗牛IgG单克隆抗体为例，将水牛奶样本滴加在样品垫，样本中的牛IgG(存在掺假普通牛乳时)与释放垫中荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体结合，层析到反应膜时，T线上固定的牛IgG(只能)与游离的(即未结合样本中牛IgG)荧光标记抗体结合，而结合了样本中牛IgG的荧光标记抗体继续向下层析，在C线处与羊抗鼠IgG抗体结合。所以，T线上聚集的荧光微球标记抗体量与样品中牛IgG的浓度成反比，即：水牛奶掺假普通牛乳的比例越高，T线上的荧光信号越弱，反之则越强。

[0044] 本发明提供的可定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条，以及采用所述试纸条定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的方法具有准确度高，精密度好的特点，检测方法可靠。此外，还具有操作简便、检测时间短的优点，对操作人员要求较低，且不需要大型检验设备支持，步骤简单，非常适用于基层现场检验，是一款实用性非常强的快速检测试纸条。

附图说明

[0045] 图1定量检测水牛奶中掺假普通牛乳试纸条示意图；

[0046] 图2实施例5水牛奶掺假普通牛乳检测方法的标准曲线；

[0047] 图3实施例6水牛奶掺假普通牛乳检测方法的标准曲线。

具体实施方式

[0048] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅是本发明的部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0049] 实施例1牛IgG单克隆抗体的制备

[0050] 1、获得牛IgG抗原

[0051] S1：将牛IgG粉末(sigma，I5506)溶解于0.01M PBS(pH 7.4)中，浓度约5mg/mL，置于2L 0.01M PBS(pH 7.4)中透析3h，调整终浓度为1.0mg/mL；

[0052] S2：使用0.01M PBS(pH 7.4，含0.2M EDTA和0.01M半胱氨酸)溶解木瓜蛋白酶(sigma，P4762)，浓度为1.0mg/mL，于37℃活化30min；

[0053] S3：将上述透析后牛IgG溶液和活化后木瓜蛋白酶溶液按照10:1的比例充分混合，37℃水浴中反应6h；

[0054] S4：使用10KD超滤管，4000rpm超滤上述IgG和木瓜蛋白酶反应溶液，除去木瓜蛋白酶，同时替换溶液为0.01M PBS(pH 7.4)，溶解后的溶液即为牛IgG Fab片段与Fc片段的混合物；使用0.22μm滤器过滤上述牛IgG Fab片段与Fc片段的混合溶液，待进一步纯化Fc片段；

[0055] S5：使用20mL 0.01M PBS(pH 7.4)平衡Protein A亲和柱，控制流速0.5mL/min‑1.0mL/min；

[0056] S6：将过滤后的牛IgG Fab片段与Fc片段的混合溶液过平衡后的Protein A柱，控制流速0.5mL/min‑1.0mL/min，然后用20mL 0.01M PBS(pH 7.4)过柱，除去吸附在柱料上杂蛋白；

[0057] S7：取多个1.5mL离心管，编号后分别加入0.3mL 1M Tris‑HCL(pH9.0)，使用0.1M柠檬酸钠溶液(pH 3.0)洗脱Fc片段，每个离心管收集洗脱液0.9mL，用Nanodrop测每管中Fc的浓度，合并浓度大于0.1mg/mL管中的溶液；

[0058] S8：使用2L 0.01M PBS(pH 7.4)透析3次，每次3h，调至Fc终浓度2‑3mg/mL，‑20℃保存备用。

[0059] 2、免疫小鼠

[0060] 将上述制备的牛IgG Fc片段作为抗原用无菌生理盐水稀释至1mg/mL，首次免疫加入等量的弗氏完全佐剂(sigma，F5881)，完全乳化后(混合物滴入水中不会分散即视为充分乳化)，采用颈背部皮下、多点注射的方式免疫10只8周龄的健康Balb/c雌性小鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司的产品)，免疫剂量为100μg/只。共免疫6次，每次免疫间隔时间均为2周，具体免疫程序见表1。

[0061] 表1单克隆抗体(小鼠)的免疫程序

[0062]免疫次数 免疫原 剂量 免疫方式
首次免疫 免疫原+FCA 100μg/只 颈背部皮下多点注射
二免 免疫原+FICA 100μg/只 同上
三免 同上 同上 同上
四免 同上 同上 同上
五免 同上 同上 同上
六免(加强免疫) 免疫原 同上 腹腔注射

[0063] 注：FCA，弗氏完全佐剂(sigma，F5881)；FICA，弗氏不完全佐剂(sigma，F5506)[0064] 四免一周后，对小鼠进行眼眶采血，室温放置2h，4000rpm离心10min后取血清检测；采用间接ELISA方阵滴定法确定包被原(牛IgG Fc)、抗体(血清)的最佳工作浓度，再采用间接竞争ELISA方法检测抗体的灵敏度。

[0065] 3、杂交瘤细胞株融合

[0066] 取血清效价高、灵敏度高的免疫小鼠的脾细胞与处于对数生长期的小鼠骨髓瘤细胞(SP2/0)混合，然后用50％PEG进行免疫融合，用HAT培养基悬浮均匀，再加入适量的饲养细胞，培养于96孔培养板，于37℃，5％CO2培养箱中培养，5天后用HAT培养基半换液，9天时候进行全换液。

[0067] 4、亚克隆及筛选

[0068] 细胞融合后，待细胞长到培养孔面积的1/4时，吸出杂交瘤细胞上清液，以牛IgG Fc为包被原采用间接ELISA方法筛选效价高的培养孔，进行亚克隆。数次亚克隆直至孔中细胞株阳性率100％，将阳性杂交瘤细胞扩大培养，收集上清液用间接ELISA测定效价，冻存。

[0069] 5、抗体获取

[0070] 取8‑10周龄Balb/c小鼠腹腔注射0.3mL/只含1.3×106个细胞的单克隆细胞悬液。6天后观察小鼠，当小鼠腹部膨大时，抽取腹水，每隔2天观察小鼠，及时抽取腹水；将抽取的腹水10000r/min离心5min，收集上清，分装保存于‑20℃冰箱。

[0071] 6、抗体的纯化及可变区测序

[0072] S1：使用20mL 0.01M PBS(pH 7.4)平衡Protein A亲和柱，控制流速0.5mL/min‑1.0mL/min；

[0073] S2：将步骤(3)产生的腹水过平衡后的Protein A柱，控制流速0.5mL/min‑1.0mL/min，然后用20mL 0.01M PBS(pH 7.4)过柱，除去吸附在柱料上杂蛋白；

[0074] S3：取多个1.5mL离心管，编号后分别加入0.3mL 1M Tris‑HCL(pH9.0)，使用0.1M柠檬酸钠溶液(pH 3.0)洗脱，每个离心管收集洗脱液0.9mL，用Nanodrop测每管中单抗的浓度，合并浓度大于0.1mg/mL管中的溶液；

[0075] S4：使用2L 0.01M PBS(pH 7.4)透析3次，每次3h，调至单抗终浓度2‑3mg/mL，‑20℃保存备用。

[0076] 提取所制备单克隆抗体所用杂交瘤细胞中的总RNA，通过反转录获得cDNA，然后利用轻链可变区引物VL‑F和VL‑R及重链可变区引物VH‑F和VH‑R进行PCR扩增(表2)，进一步对扩增产物进行TA克隆筛选，将筛选得到的阳性克隆送往北京博迈德生物技术有限公司进行基因测序，依据基因测序结果得到：抗牛IgG单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，抗牛IgG单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0077] 表2鼠单克隆抗体可变区基因扩增引物

[0078]

[0079]

[0080] 注：兼并引物：S：C/G；M：A/C；R：A/G；W：A/T

[0081] SEQ ID NO:1抗牛IgG单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列

[0082] Gly Thr Lys Leu Glu Ile Tyr Pro Cys Gln Ala Asp Gly Phe Thr Phe Glu Asp Ala Tyr MetSer Ile Val Arg Gln Thr Pro Glu Lys Arg Leu Glu Trp Val Asp Thr Ile Ser Asp Gly Arg Asp TyrThr Lys Val Pro Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr LeuTyr Leu Val Phe Ser Asp Leu Ile Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Trp Cys Phe Arg His Phe GluTyr Leu Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Thr Glu Ser Pro

[0083] SEQ ID NO:2抗牛IgG单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列

[0084] Leu Gly Pro Arg Asp His Gly His Arg Leu Leu Val Leu Ser Pro Glu Glu Thr Gly Thr SerAla Ile Val Ala Gln Gly Pro Thr Leu Ala Ala Pro Ser Glu Gly Ala Val Gly Gly Ala Cys Arg ProSer Ala Gly Ala Val Ala Ile Pro Asn Tyr Glu Asn Trp Val Gln Gly Lys Ser Asp His Leu Phe AlaGly Leu Ile Glu Ile Ala Asn Asn Arg Thr Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe Pro Glu Ser Leu Ile GluAsp Lys Thr Ile Leu Ala Ile Ala Gly Thr Gln Ala Gly Asp Gly Thr Ile Tyr Phe Cys Arg Ser AsnCys Thr Val Arg

[0085] 实施例2抗牛α‑S1单克隆抗体的制备

[0086] 1、获得牛α‑S1抗原

[0087] S1：参照牛源α‑S1全序列(GenBank:ACG63494.1)，委托南京金斯瑞生物科技有限公司合成其截断多肽序列NQELAYFYPEL，分子量1386.5Da；

[0088] S2：使用0.1M碳酸盐缓冲液(含0.15M NaCl，pH 8.5)溶解载体蛋白KLH(钥孔血蓝蛋白)，终浓度2.0mg/mL；

[0089] S3：向KLH溶液中加入合成的α‑S1多肽片段，终浓度10μg/mL，α‑S1：KLH摩尔比约30:1；

[0090] S4：在上述溶液中加入新鲜的戊二醛至终浓度1％，4℃磁力搅拌器上反应4h；

[0091] S5：向上述溶液中加入硼氢化钠至终浓度为10mg/mL，4℃磁力搅拌器上反应1h；

[0092] S6：将上述反应产物置于2L 0.01M PBS(pH 7.4)透析6次，每次3h，调至终浓度2‑3mg/mL，‑20℃保存备用。

[0093] 步骤2免疫小鼠、步骤3杂交瘤细胞株融合、步骤4亚克隆及筛选、步骤5抗体获取、步骤6抗体的纯化操作均同实施例1，获得纯化的抗牛α‑S1单克隆抗体。

[0094] 提取所制备单克隆抗体所用杂交瘤细胞中的总RNA，通过反转录获得cDNA，然后利用轻链可变区引物VL‑F和VL‑R及重链可变区引物VH‑F和VH‑R进行PCR扩增(表3)，进一步对扩增产物进行TA克隆筛选，将筛选得到的阳性克隆送往北京博迈德生物技术有限公司进行基因测序，依据基因测序结果得到：抗牛α‑S1单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，抗牛α‑S1单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示。

[0095] 表3鼠单克隆抗体可变区基因扩增引物

[0096]

[0097] 注：兼并引物：S：C/G；M：A/C；R：A/G；W：A/T

[0098] SEQ ID NO:3抗牛α‑S1单克隆抗体轻链可变区的氨基酸序列

[0099] Gly Thr Lys Leu Glu Ile Tyr Pro Cys Gln Ala Asp Gly Phe Thr Phe Glu Asp Ala Tyr MetSer Ile Lys Tyr Val Met Asp Lys Asn Phe Ile His Ser Val Asp Thr Ile Ser Asp Gly Arg Asp TyrThr Lys Val Pro Asp Ser Phe Glu Ala Ile Tyr Val Met Ser Arg Asp Asp Ala Lys Asn Thr LeuTyr Leu Val Phe Ser Asp Leu Ile Asp Glu Asp Thr Ala Met Tyr Trp Cys Phe Arg His Phe GluPhe Gly Ala Pro Glu His Ile Leu Trp Gly Gln Asp Ile Gln Leu Thr Glu Ser Pro

[0100] SEQ ID NO:4抗牛α‑S1单克隆抗体重链可变区的氨基酸序列

[0101] Leu Gly Pro Arg Asp His Gly His Arg Leu Leu Val Leu Ser Pro Glu Glu Thr Gly Thr SerAla Ile Val Ala Gln Gly Pro Thr Leu Asn Arg Glu Ile Ser Gly Ala Val Gly Thr Ala Cys Arg ProSer Ala Gly Ala Val Ala Tyr Ser Asn Tyr Phe Arg Asp Val Ser Arg Lys Pro Asp His Leu LysAla Gly Leu Ile Glu Ile Ala Asn Phe Arg Thr Ser Gly Val Ser Thr Arg Phe Pro Glu Ser Leu IleGlu Asp Lys Thr Ile Leu Ala Ile Ala Arg Val Glu Lys Leu Asp Asn His Ile Tyr Phe Cys Arg SerAsn Cys Arg Val Arg

[0102] 实施例3荧光微球的抗体标记

[0103] S1：将50μL荧光微球加入450μL MES(0.05M，pH5.0)活化缓冲液中，超声5min；然后，向微球溶液中依次加入EDC和NHS溶液使其终浓度均为1mmol/L，室温振荡反应0.5h；

[0104] S2：12000g离心5min，弃上清；沉淀用500μL PB(0.04M，pH 8.0)复溶，超声5min，加入适量体积(5μL)的2.3mg/mL抗牛IgG单克隆抗体或3.7mg/mL抗牛α‑S1单克隆抗体，室温振荡反应2h，15000g离心5min；

[0105] S3：向沉淀中加入500μL封闭缓冲液(0.01M PB，2％ BSA，pH 8.0)，4℃振荡反应过夜；

[0106] S4：将反应液15000g离心5min，弃上清，再次使用50μL 20mM PB复溶微球，超声2min，4℃避光保存备用，得到荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体或荧光微球标记的抗牛α‑S1单克隆抗体。

[0107] 实施例4定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条的制备

[0108] 用划膜仪将实施例1得到的牛IgG抗原(1.6mg/mL，0.8μL/cm)或牛α‑S1抗原(1.4mg/mL，0.8μL/cm)与羊抗鼠IgG(0.75mg/mL，0.7μL/cm)包被于硝酸纤维素膜(NC膜)上分别作为检测线(T线)和质控线(C线)。

[0109] 将实施例3制备的荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体或荧光微球标记的抗牛α‑S1单克隆抗体喷于释放垫上，喷量分别为2.2μL/cm和2.8μL/cm，置于37℃烘箱中干燥2h，得到含有荧光微球标记的抗牛IgG单克隆抗体或抗牛α‑S1单克隆抗体的释放垫。

[0110] 将样品垫、含有荧光微球标记的抗体的释放垫、含有检测线T和质控线C的硝酸纤维素膜、吸水垫依次粘PVC底板上，底板一端端头为吸水垫，另一端端头为样品垫，硝酸纤维素膜两端分别与吸水垫和荧光微球标记抗体的释放垫相互交叠(1～3mm)连接，在荧光微球标记抗体的释放垫上压有样品垫(交叠1～3mm)，用切割机切成3.90mm宽度的试纸条，得到检测水牛奶掺假普通牛乳检的试纸条。

[0111] 本实验根据释放垫中单克隆抗体和T线上包被抗原的种类不同，分别得到试纸条1(抗牛IgG单克隆抗体)和试纸条2(抗牛α‑S1单克隆抗体)。

[0112] 实施例5定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的方法

[0113] (1)标准曲线的绘制

[0114] S1：取阴性水牛奶样品(PCR检测不含有普通牛乳)，向其中分别添加普通牛乳，使普通牛乳的体积百分比分别为：0.0％、0.05％、0.15％、0.45％、1.35％和4.05％；

[0115] S2：将上述各个样本分别取100μL滴加至试纸条2的样品垫上，40℃恒温孵育5min，使用荧光免疫定量分析仪检测，激发波长365nm，检测波长610nm，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值；

[0116] S3：每个浓度重复测试5次，取平均值，以样本中添加的普通牛乳百分比为X轴，检测线T荧光信号值与质控线C荧光信号值的比值(T/C)为Y轴，用origin8.0做四参数非线性1.4134
拟合分析得到标准曲线:Y＝0.1354+1.9649/(1+(x/0.3023) )。

[0117] 结果如图2所示，通过测试数据的拟合表明，所建立的水牛奶掺假普通牛乳检测方2
法理论检测限(IC20)为0.113％，IC50 0.325％，R为0.9991。

[0118] (2)待测样本检测

[0119] 取100μL样本液滴加至水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条2的样本垫上，40℃检测卡恒温孵育器中准确反应5min后，取出并使用荧光免疫定量分析仪检测，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值；将上述T线荧光信号值与C线荧光信号值的比值代入标准曲线中，得到各个样本中普通牛乳百分比含量。

[0120] 方法学验证

[0121] (1)试纸条的最低检出限和定量限

[0122] 按照上述“待测样本检测”中描述的方法，使用水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条1检测20份水阴性牛奶样品(PCR检测阴性)，分别计算普通牛乳百分比含量的平均值和标准差：平均值加上3倍标准差，即为检出限；平均值加上10倍标准差，即为定量限。

[0123] 表4水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条检出限验证(％)

[0124]样品 平均值 标准差 检出限 定量限
水牛奶 0.064 0.011 0.097 0.174

[0125] 结果如表4所示，可以看出，以普通牛乳为对照物建立标准曲线得出的普通牛乳最低检出限为0.097％、定量限为0.174％。为了保证结果的准确和可靠，将水牛奶中普通牛乳的检出限定为0.10％、定量限定为0.20％。

[0126] (2)方法准确度和精密度

[0127] 水牛奶阴性样品20份，分别加入普通牛乳，样品添加药物浓度为对应的定量限和2倍定量限，每个浓度梯度添加5个平行，计算样品添加回收率和批内、批间变异系数。

[0128] 依据添加回收数据对所建立荧光免疫层析分析方法的准确度和精密度进行分析。

[0129] 表5水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条的准确度和精密度

[0130]

[0131] 回收率＝(平均值/添加浓度)×100％

[0132] 变异系数＝(标准差/平均值)×100％；

[0133] 结果如表5所示，本发明对水牛奶中普通牛乳的添加回收率为94.30‑107.77％，批内、批间变异系数均小于10％，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

[0134] (3)试纸条与PCR检测结果比较

[0135] 采用本发明提供的可用于定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的试纸条以及检测方法对水牛奶样本(共50份)进行检测，再分别于PCR检测结果进行确证比较。结果见表6。

[0136] 表6水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条与PCR检测结果比较

[0137]

[0138] 注：“ND”表示未检测到普通牛乳

[0139] 结果表明，采用本发明提供的试纸检测水牛奶掺假普通牛乳含量和PCR结果基本一致，说明本发明提供的检测试纸条检测水牛奶掺假普通牛乳具有较高的准确性。

[0140] 实施例6定量检测水牛奶中掺假普通牛乳的方法

[0141] 按照实施例5公开的方法配制普通牛乳百分比含量分别为0.0％、0.05％、0.15％、0.45％、1.35％和4.05％的样品，将样品滴加至试纸条1的样品垫上，得到T线荧光信号值与C线荧光信号值，绘制标准曲线，并验证试纸条最低检出限和定量限、准确度和精密度以及与PCR方法的比较。

[0142] 拟合得到标准曲线：Y＝0.1148+1.8875/(1+(x/0.2921)1.5814)，结果如图3所示，通过测试数据的拟合表明，所建立的水牛奶掺假普通牛乳检测方法的理论检测限为0.12％，2
IC500.308％，R为0.9991。

[0143] (1)试纸条的最低检出限和定量限

[0144] 表7水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条检出限验证(％)

[0145] 样品 平均值 标准差 检出限 定量限水牛奶 0.049 0.015 0.094 0.199

[0146] 结果如表7所示，可以看出，以普通牛乳为对照物建立标准曲线得出的普通牛乳最低检出限为0.094％、定量限为0.199％。为了保证结果的准确和可靠，将水牛奶中普通牛乳的检出限定为0.10％、定量限定为0.20％。

[0147] (2)方法准确度和精密度

[0148] 表8水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条的准确度和精密度

[0149]

[0150]

[0151] 结果如表8所示，本实施例对水牛奶中普通牛乳的添加回收率为89.30‑110.37％，批内变异系数小于10％，批间变异系数小于15％，表明该方法具有较好的准确度和精密度。

[0152] (3)试纸条与PCR检测结果比较

[0153] 表9水牛奶掺假普通牛乳检测试纸条与PCR检测结果比较

[0154]

[0155] 注：“ND”表示未检测到普通牛乳

[0156] 结果表明，采用本发明提供的试纸检测水牛奶掺假普通牛乳含量和PCR结果基本一致，说明本发明提供的检测试纸条检测水牛奶掺假普通牛乳具有较高的准确性。

[0157] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。