一种多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法注意：申请人在申请日后补交了实验数据，但该数据并未包含在本授权公告文档中。

摘要

本发明公开了一种多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述试剂盒包括反应缓冲液、BstDNA聚合酶、dNTPs、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、SYBRGreenI、检测引物，所述检测引物序列如SEQIDNO.1和SEQIDNO.2所示。与传统检测试剂盒和检测方法相比，本发明方法具有简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好的优点，此外在检测时间与检测成本方面具有显著优势，适合于批量检测。

权利要求

1.一种多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的试剂盒包括：1）反应缓冲液；2）检测引物：正向引物PM‑F和反向引物PM‑R，所述的PM‑F和PM‑R引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示；3）Bst DNA聚合酶；4）dNTPs；5）SYBR Green I；6）甜菜碱；7）聚乙二醇甲醚；8）石墨化碳纳米管。

2.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：9）阳性对照：多杀性巴氏杆菌CVCC44801基因组DNA；10）阴性对照：灭菌生理盐水。

3.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于，所述的反应缓冲液含有Tris‑HCl、氯化钾、硫酸铵、硫酸镁和Triton X‑100。

4.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于，正向引物PM‑F和反向引物PM‑R的浓度均为10 pmol/μL。

5.根据权利要求1所述的多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒的检测反应体系为：每25μL反应液中包括10×反应缓冲液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，dNTPs 3.5μL，10×SYBR Green I 2.5μL，10 mM甜菜碱1 µL， 聚乙二醇甲醚1µL，10 ng/µL石墨化碳纳米管溶液1µL，PM‑F和PM‑R各1.5μL，待检样品DNA 3μL，其余为灭菌生理盐水。

6.权利要求1‑5任意一项所述的多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒在制备检测多杀性巴氏杆菌的试剂中的应用。

7.一种使用权利要求1‑5任意一项所述的多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板；

S2：将缓冲液、Bst DNA聚合酶、dNTPs、SYBR Green I、甜菜碱、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR 仪进行扩增反应；

S3：当反应结束后，荧光曲线起峰，即荧光值大于0.001，判定为阳性；当荧光曲线未起峰，即荧光值小于等于0.001，时判定为阴性；或采用3%琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。

说明书

一种多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测

方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子生物学检测技术领域，具体涉及一种多杀性巴氏杆菌核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。

背景技术

[0002] 多杀性巴氏杆菌(Pasteurella multocida,Pm)是一种重要的人兽共患病原菌，在细菌分类学上属于巴氏杆菌科巴氏杆菌属，由法国著名微生物学家巴斯德于1880年获得纯培养物，并于1939年被统一命名为多杀性巴氏杆菌。多杀性巴氏杆菌可感染人类和多种动物，引起各种畜禽传染病，如禽霍乱、猪肺疫、牛出血性败血症、兔出血性败血症等，对养殖业造成严重危害。根据Carter分型方法和Heddleston分型方法，分别依据荚膜抗原的不同和脂多糖抗原的不同将多杀性巴氏杆菌分为5种荚膜血清型(A、B、D、E、F)和16种菌体血清型(1‑16)，由于多杀性巴氏杆菌血清型复杂，各型之间交叉保护性不强，导致疫苗防控难度较大，只有通过病原监测，结合卫生消毒与生物安全等可有效预防本病的发生与流行。

[0003] 目前对于多杀性巴氏杆菌的检测标准都是基于临床诊断、血清学检测、病原学检测(如NYT 563‑2002禽霍乱(禽巴氏杆菌病)诊断技术、NYT 564‑2002猪巴氏杆菌病诊断技术、NYT 567‑2002兔出血性败血症诊断技术、DB63/T 776‑2009牛出血性败血症诊断技术规范等)，上述方法涉及的过程非常繁琐且费时，不能达到及时发现病原、控制传播途经，消除污染源的疫病防控要求。随着科技的发展，以PCR、LAMP等分子生物学方法在多杀性巴氏杆菌的快速检测中得到逐步应用，但上述方法仍存在诸多缺陷。例如，PCR方法灵敏度相对偏低，检测时间也相对偏长，且为提高检出率通常需要增菌后检测；LAMP方法虽灵敏度大幅提高，检测时间也缩短，但极易发生气溶胶污染，且因引物较多易造成引物二聚体，无法通过琼脂糖凝胶电泳辨别假阳性结果。

[0004] 基于上述原因，本发明提供一种新型的多杀性巴氏杆菌核酸检测方法，可有效解决传统PCR和LAMP检测中的缺陷，仅使用一对引物，就可以达到简便快捷、特异性强、灵敏度高、重复性好等优点。

发明内容

[0005] 本发明针对细菌学检测与传统核酸检测技术在多杀性巴氏杆菌检测中存在的不足，特别是如何提高检测效率、灵敏度与特异性，提供了一种特异性检测多杀性巴氏杆菌的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法。

[0006] 本发明技术方案如下：

[0007] 本发明提供了一种特异性检测多杀性巴氏杆菌的新型核酸检测试剂盒及其非诊断性检测方法，所述多杀性巴氏杆菌的核酸检测试剂盒包括反应缓冲液、DNA聚合酶、dNTPs、检测引物、甜菜碱、石墨化碳纳米管、聚乙二醇甲醚、阳性对照和阴性对照；所述检测引物为SEQ ID NO.1的引物和SEQ ID NO.2的引物的组合。

[0008] 本发明通过使用特别设计的一对检测引物，就可以实现特异性强、灵敏度高的优点。特别需要说明的是，本发明的试剂盒加入石墨化碳纳米管后的扩增条带，有单一的目的特异性条带(如图1所示)。本发明设计是在链交换扩增(使用一对引物进行等温扩增)的基础上改进的(仍使用一对引物，分两步进行扩增)。研究发现，在不加入石墨化碳纳米管的情况下，会出现类似链交换扩增的非特异性扩增现象(如图1所示，出现引物二聚体而特异性条带不清晰等)，所以通过加入石墨化碳纳米管等新型纳米材料可以最大限度的提高反应特异性。石墨化碳纳米管对基因扩增的机制不明，据推测由于表面电荷性质，可与单链DNA形成相对稳定的结构，而双链DNA由于双链间氢健作用力更稳定，所以不会石墨化碳纳米管结合。因此，石墨化碳纳米管可以吸附多余未参加反应的引物单链，以防止引物二聚体的产生，有效提高反应特异性。

[0009] 本发明的试剂盒中加入甜菜碱可帮助DNA聚合酶顺利通过DNA某些复杂二级结构，防止DNA聚合酶从模板DNA中解离。DNA局部区域因含有多个复杂碱基(Py‑G‑C)，会促使DNA聚合酶的停滞，最终导致DNA聚合酶停止有效延伸。而甜菜碱可提高DNA小沟中富含鸟嘌呤和胞嘧啶区域的鸟嘌呤和胞嘧啶的水合作用，影响DNA分子结构，改变DNA灵活性，帮助DNA聚合酶沿着DNA模板延伸。其次，甜菜碱可消除变性温度对碱基的依赖性。浓度依赖性降低高GC含量序列的Tm，并使不同引物的Tm相接近，最终降低DNATm值。此外，甜菜碱溶液可稳定DNA‑蛋白复合物。

[0010] 进一步的，所述阳性对照为多杀性巴氏杆菌CVCC44801基因组DNA，所述阴性对照为无菌生理盐水。

[0011] 进一步的，所述试剂盒检测体系的组分为：每25μL反应液中包括10×反应缓冲液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，dNTPs 3.5μL，10×SYBR Green I 2.5μL，甜菜碱(10mM)1μL，聚乙二醇甲醚1μL，石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)1μL，PM‑F和PM‑R各1.5μL，待检样品DNA 3μL，其余为灭菌生理盐水。

[0012] 进一步的，所述多杀性巴氏杆菌检测方法的反应流程为：73℃1秒，63℃1秒，循环总数45。

[0013] 进一步的，所述10×反应缓冲液含有200mM Tris‑HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％TritonX‑100，pH 8.0～8.8。

[0014] 进一步的，所述多杀性巴氏杆菌检测方法的引物序列如SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2所示。

[0015] 进一步的，所述dNTPs包括dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM。

[0016] 更进一步的，一种使用多杀性巴氏杆菌检测试剂盒进行非诊断性检测的方法，包括以下步骤：

[0017] S1：使用煮沸法或商品化试剂盒提取细菌基因组DNA，得到检测模板。

[0018] S2：扩增反应，将10×反应缓冲液、dNTPs、TaqDNA聚合酶、检测引物以及DNA模板加入灭菌反应管中，添加灭菌生理盐水至总体积25μl，同时设置阳性、阴性对照，使用荧光定量PCR仪进行扩增反应；采用3％琼脂糖凝胶电泳对扩增产物进行电泳检测并分析结果。

[0019] 相比于现有技术，本发明的有益效果为：

[0020] 本发明根据比较基因组学筛选的多杀性巴氏杆菌特异基因序列设计引物，具有灵敏度高，特异性强的优点。同时，本发明只需通过一次反应，即可对多杀性巴氏杆菌进行快速检测，相比传统的细菌学结合血清学分型的检测方法，在检测时间与检测成本方面具有较大优势，适合于批量检测。

附图说明

[0021] 图1为实施例1中琼脂糖凝胶电泳检测结果。图中：M为Takara 20bp DNALadder(Dye Plus)，泳道1为含石墨化碳纳米管体系检测多杀性巴氏杆菌CVCC44801，泳道2为不含石墨化碳纳米管检测多杀性巴氏杆菌CVCC44801，泳道3为阴性对照；

[0022] 图2为实施例3中抗干扰评价实验的检测结果。图中：1为稀释10000倍的多杀性巴氏杆菌增菌液；2为增菌液的混合物，即多杀性巴氏杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、福氏志贺氏菌和肺炎克雷伯氏菌的增菌液稀释10000倍后，按1:1:1:1:1的比例混合；3为阴性对照；

[0023] 图3为实施例4中敏感性评价的检测结果。图中：1为8.5×102copies/μl，2为8.5×1 0 ‑1 ‑2
10copies/μl，3为8.5×10copies/μl，4为8.5×10 copies/μl，5为8.5×10 copies/μl，6为阴性对照。

具体实施方式

[0024] 下面结合实施例和附图对本发明做进一步的说明，以下所述，仅是对本发明的较佳实施例而已，并非对本发明做其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更为同等变化的等效实施例。凡是未脱离本发明方案内容，依据本发明的技术实质对以下实施例所做的任何简单修改或等同变化，均落在本发明的保护范围内。

[0025] 实施例1多杀性巴氏杆菌核酸检测方法的建立

[0026] 引物的设计：根据GenBank数据库中已知的所有多杀性巴氏杆菌DNA序列及其它物种DNA序列，通过分析比对后，筛选出多杀性巴氏杆菌通用核苷酸序列，在此基础上设计、优选得到用于特异性检测多杀性巴氏杆菌的引物，如下表所示。

[0027] 表1多杀性巴氏杆菌核酸检测引物序列

[0028]

[0029] 模板制备：将多杀性巴氏杆菌CVCC44801在脑心浸液肉汤培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，作为待检模板。

[0030] 检测试剂的配制：10×反应缓冲液(其组分包括200mM Tris‑HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X‑100，pH 8.0～8.8。)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Bst DNA聚合酶(8000U/μl)、10μM检测引物、0.5μL聚乙二醇甲醚、甜菜碱(10mM)、石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)、10×SYBR Green I。此外，设置石墨化碳纳米管缺省对照组。

[0031] 检测体系及扩增程序：检测体系为25μL，具体包括：10×反应缓冲液2.5μL，Bst DNA聚合酶1μL，dNTPs 3.5μL，10×SYBR Green I 2.5μL，甜菜碱(10mM)1μL，聚乙二醇甲醚1μL，石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)1μL，PM‑F和PM‑R各1.5μL，待检样品DNA3μL，其余为灭菌生理盐水。扩增程序的步骤包括73℃1秒，63℃1秒，循环总数45。

[0032] 检测结果的判定：当反应结束后，荧光曲线起峰(荧光值大于0.0001)判定为阳性；当荧光曲线未起峰(荧光值小于等于0.0001)时判定为阴性。或取5μl扩增产物，加1μl6×Loading buffer混匀，点样于3％琼脂糖凝胶电泳板孔中，100V电压，电泳40min，于凝胶成像仪下拍照判定，可见约50bp大小的清晰条带，而缺省石墨化碳纳米管对照组条带不明显，且出现明显的引物二聚体(如图1)。

[0033] 实施例2特异性评价实验

[0034] 用实施例1的方法进行本发明检测方法的特异性评价，将24株参考菌株在脑心浸液肉汤培养基中增菌培养，将增菌液稀释10000倍后使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组DNA，按照实施例1所述方法进行检测，结果如表2所示，只有多杀性巴氏杆菌(序号1‑12)的检测结果为阳性，其它种属细菌均为阴性。

[0035] 表2本发明特异性评价试验结果

[0036]

[0037] 实施例3抗干扰评价实验

[0038] 用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。分别将多杀性巴氏杆菌CVCC44801、大肠埃希氏菌ATCC25922、沙门氏菌ATCC13076、福氏志贺氏菌CMCC51572和肺炎克雷伯氏菌ATCC700603接种脑心浸液肉汤培养基增菌培养，再将增菌液分别稀释10000倍后使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取细菌基因组。将提取的基因组分为2份，1号样品仅含多杀性巴氏杆菌CVCC44801，2号样品为多杀性巴氏杆菌、大肠埃希氏菌、沙门氏菌、志贺氏菌和肺炎克雷伯氏菌基因组按1:1:1:1:1比例混合，3号样品为阴性对照。按照实施例1所述方法进行检测，结果如图2所示，1号样品和2号样品均显示出明显的荧光曲线，3号样品无荧光曲线出现，表明本发明方法具有较好的抗干扰能力。

[0039] 实施例4灵敏度评价实验

[0040] 用实施例1的方法进行本发明检测方法的敏感性评价。将多杀性巴氏杆菌CVCC44801在脑心浸液肉汤培养基中增菌培养，使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取基因组，测定原始浓度后10倍梯度稀释，对不同稀释梯度细菌基因组DNA进行扩增。由图3‑1可知本发明方法检测多杀性巴氏杆菌的最低下限可达单拷贝(8.5×10 copies/μl)，具有较高的灵敏度和应用价值。

[0041] 实施例5稳定性评价实验

[0042] 用实施例1的方法进行本发明检测方法的重复性评价。以多杀性巴氏杆菌CVCC44801基因组DNA为模板，分别进行10次扩增测试。结果见表3，由表可见，荧光信号时间阈值(Tt)相对稳定(变异系数约为3.4％)，阴性对照无荧光信号时间阈值，表明该方法具有较好的稳定性。

[0043] 表3稳定性测试结果

[0044]

[0045] 实施例6检测试剂盒的组装

[0046] 根据实施例1表中的序列合成多杀性巴氏杆菌特异性检测引物，用灭菌生理盐水稀释为10μM浓度，等体积混合后得到检测引物；使用商品化的细菌基因组DNA抽提试剂盒提取沙门氏菌ATCC13076基因组DNA作为阳性对照；核酸扩增试剂：10×反应缓冲液(其组分包括200mM Tris‑HCl，100mM(NH4)2SO4，500mM KCl，20mM MgSO4，1％Triton X‑100，pH 8.6～8.8)、dNTPs(包含dGTP、dCTP、dATP、dTTP，各组分浓度均为2.5mM)、Bst DNA聚合酶(8000U/μl)、甜菜碱(10mM)、聚乙二醇甲醚、石墨化碳纳米管溶液(10ng/μL)检测引物、阳性对照以及阴性对照(无菌生理盐水)。

[0047] 将以上所涉试剂和产品共同包装，再配以产品使用说明书(包括产品保存条件、反应程序和结果判定方法等)，组装成本发明所述的多杀性巴氏杆菌新型核酸检测试剂盒。

[0048] 实施例7采集样品检测

[0049] 用实施例1的方法进行对临床分离的124株细菌进行检测，同时参考多杀性巴氏杆菌检验标准(NYT 563‑2002)中的方法进行多杀性巴氏杆菌分离鉴定。结果如表4所示，在124株临床分离株中，本发明提供的检测方法与国标检测方法均检测出15株多杀性巴氏杆菌分离株，2种检测方法符合率达100％，表明本发明试剂盒所建立的检测方法具有较好特异性。此外多杀性巴氏杆菌检验标准(NYT 563‑2002)鉴定多杀性巴氏杆菌需要数日时间，采用本发明试剂盒检测仅需约半小时。

[0050] 表4临床样本验证测试结果

[0051]

[0052] 尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。