一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌及应用

摘要

本发明公开了一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌，所述无特定抗性基因枯草芽孢杆菌命名为BSC6ΔA8菌，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC M 20221487。以该无特定抗性基因枯草芽孢杆菌对克林霉素、林可霉素、链霉素和螺旋霉素的抗生素浓度响应更敏感，生物安全性更高。在与小麦秸秆混合发酵48h后，能有效破坏小麦秸秆的表面形态结构，可降低小麦秸秆的纤维素结晶度约6％，降低小麦秸秆的中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)含量分别为6.6％和12.1％，具备进一步应用于生物饲料生产及动物益生菌产品开发的潜力。

权利要求

1.一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌，其特征在于，该无特定抗性基因枯草芽孢杆菌命名为BSC6ΔA8菌株，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M20221487。

2.如权利要求1所述的无特定抗性基因枯草芽孢杆菌用于降解秸秆粗纤维中的应用。

说明书

一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌及应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物基因工程技术领域，具体涉及一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌及应用。

背景技术

[0002] 21世纪以来，抗生素在畜牧行业的滥用引起了世界各国的高度重视，欧盟、日本、韩国、美国等先后出台政策禁止将抗生素作为饲料添加剂使用。我国农业农村部于2019年7月发布公告，要求自2020年7月起所有饲料生产企业不得生产含有促生长类药物饲料添加剂（中药类除外）的产品，这标志着我国开始全面禁用促生长类抗生素。2021年11月1日，我国农业农村部办公厅发布了《直接饲喂微生物和发酵制品生产菌株鉴定及其安全性评价指南》的通知（农办牧〔2021〕43号），指南规定了饲用微生物和发酵用菌株鉴定及安全性评价的基本原则、基本要求、评价方法和结果判定，对于保障我国饲料和养殖产品质量和安全、促进畜牧行业高质量发展具有重要意义。而当生产菌株是细菌时，应当开展抗菌药物敏感性评价，尤其需要关注的抗菌药物包括世界卫生组织（World Health Organization，WHO）分类的极为重要抗菌药物（Critically important antimicrobials，CIAs）和高度重要抗菌药物（Highly important antimicrobials，HIAs）；并需要结合全基因组测序分析，综合判定菌株是否具有获得性耐药。

[0003] 枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，B. subtilis）是公认的安全益生菌株（generally recognized as safe, GRAS），亦是我国《饲料添加剂品种目录（2013）》准用菌种，在畜牧业养殖“禁抗”的大背景下，常作为“益生菌替抗”技术的候选菌种。其被动物采食后可以提高粗饲料利用率，调节肠道微生物菌群平衡，增强动物免疫力，促进生长发育，在畜禽养殖业中应用广泛。但是，以往在畜禽养殖实际生产中使用的枯草芽孢杆菌多为源于自然环境的野生型菌株，遗传背景不清晰，对其基因组序列中含有的抗生素耐药性基因序列信息掌握不全面，部分菌株表现出抗生素耐药性表型，当在畜牧养殖中生产应用时，存在抗生素耐药性基因漂移风险以及饲料卫生与安全隐患，有通过食物链传播影响动物和人类健康的潜在危险。因此，获得不含有CIAs和HIAs耐药性基因的枯草芽孢杆菌，能够更加满足畜禽养殖业中饲用微生物添加的生物安全性要求。

发明内容

[0004] 为了解决上述问题，本发明的目的在于，提供一株无特定耐药性基因枯草芽孢杆菌及其在粗饲料降解中的应用。

[0005] 为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

[0006] 一种无特定抗性基因枯草芽孢杆菌，该无特定抗性基因枯草芽孢杆菌命名为BSC6ΔA8，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M20221487。

[0007] 所述无特定抗性基因枯草芽孢杆菌为菌株Bacillus subtilisC6的衍生菌株。

[0008] 上述无特定抗性基因枯草芽孢杆菌的构建方法，利用CRISPR/Cas9系统敲除所述菌株Bacillus subtilisC6的10个抗性基因获得，敲除总片段合计约7.9 kb；所述10个抗性基因包括：四环素耐药基因ykkC和ykkD，链霉素耐药基因vgbA和aadK，螺旋霉素耐药基因mph，喹诺酮类耐药基因bmr和blt，衣霉素耐药基因tmrB以及林克霉素耐药基因lmrA和lmrB。

[0009] 包括以下步骤：

[0010] 1）以pJOE8999载体作为出发载体构建CRISPR/Cas9基因敲除载体；

[0011] 2）使用CRISPROR工具进行sgRNA引物设计，并在5’端添加BsaI酶切的互补配对碱基即得到最终的sgRNA引物序列，引物退火连接至BsaI酶切的pJOE8999线性载体，各靶基因的同源臂修复序列通过无缝克隆连接至SalI和XbaI酶切位点之间；

[0012] 3）根据拟敲除的基因上下游序列信息，设计基因敲除的同源臂扩增引物分别扩增上下游同源臂修复片段并纯化回收；

[0013] 4）CRISPR/Cas9完成基因敲除以后，通过温度变化进行质粒去除，获得无抗性标记的基因敲除菌；

[0014] 5）通过依次敲除10个抗性基因，最终获得的抗性基因敲除菌命名为BSC6ΔA8。

[0015] 6）评估野生型枯草芽孢杆菌和基因敲除菌BSC6ΔA8对不同抗菌药物的敏感性。

[0016] 具体地，所述的10个抗性基因的敲除顺序依次是：同时敲除ykkC和ykkD基因共800 bp，敲除vgbA基因970bp，敲除aadK基因800 bp，敲除mph基因800bp，敲除bmr基因1200bp，敲除blt基因1200bp，敲除tmrB基因100bp，最后同时敲除lmrA和lmrB基因共2000bp。

[0017] 根据申请人的实验表明，所述的无特定耐药性基因枯草芽孢杆菌在粗饲料降解中的应用。

[0018] 按如下步骤实施：

[0019] 1）将收获期的小麦秸秆经干燥后剪成小段，用粉碎机粉碎并过1 mm筛；

[0020] 2）称取10g小麦秸秆样品，于120℃灭菌20min后，65℃烘干48h备用，同时配制浸润培养基，所述浸润培养基的w/v为：NH4NO3：0.5%，MgSO4·7H2O：0.1%，NaCl：0.1%；120℃灭菌20min后备用；

[0021] 3）将10g小麦秸秆样品和50mL浸润培养基在发酵袋中以5%的菌液接种量均匀混合，于37℃条件下培养48h后终止发酵；并以5%的无菌LB培养液等量替代菌悬液作为空白对照组；培养结束后将各组别的小麦秸秆于65℃烘干至恒重，测定中性洗涤纤维和酸性洗涤纤维含量；将过200目筛的烘干小麦秸秆样品经粘台、喷金、抽真空操作后，以场发射扫描电子显微镜测定降解前和降解后小麦秸秆的表面形态结构变化，采用X‑射线衍射仪对小麦秸秆的纤维素结晶度进行测定，并计算结晶度；

[0022] 结果显示，小麦秸秆的中性洗涤纤维含量由68.6%降至62.0%，酸性洗涤纤维含量由60.4%降至48.3%，纤维素结晶度由41.1%降低至35.3%。

[0023] 本发明得到的无特定抗性基因枯草芽孢杆菌，基于CRISPR/Cas9系统，高效、精准敲除了野生型枯草芽孢杆菌的10个耐药性基因，获得的菌株BSC6ΔA8对克林霉素、林可霉素、链霉素和螺旋霉素的浓度响应更敏感，低浓度的抗菌药物即可显著抑制该菌生长。由于菌株BSC6ΔA8基因组中不含有任何WHO规定的CIAs和HIAs耐药基因，避免了产生获得性耐药的可能性，可有效规避耐药基因漂移风险。

[0024] 本发明构建的一株无特定抗性基因枯草芽孢杆菌BSC6ΔA8，能有效破坏秸秆的纤维素表面形态结构，分别降低秸秆的NDF和ADF含量6.6%和12.1%，纤维素结晶度降低5.8%。所构建的菌株BSC6ΔA8无获得性耐药风险，能够高效降解秸秆类纤维素生物质，具备进一步应用于生物饲料生产及动物益生菌产品开发的潜力。

附图说明

[0025] 图1是枯草芽孢杆菌中CRISPR/Cas9基因敲除质粒转化和质粒去除示意图。

[0026] 图2是基于CRISPR/Cas9系统敲除枯草芽孢杆菌的10个耐药性基因，其中，（A）图是依次敲除10个耐药性基因的示意图；（B）～（I）图是通过菌落PCR验证各基因的敲除效率。

[0027] 图3是野生型枯草芽孢杆菌对14种抗菌药物的敏感性测定结果。

[0028] 图4是采用枯草芽孢杆菌BSC6ΔA8对克林霉素、林可霉素、链霉素和螺旋霉素的敏感性测定结果。

[0029] 图5是小麦秸秆被枯草芽孢杆菌BSC6ΔA8降解后纤维素表面结构的场发射扫描电镜图（放大10 000倍下观察）。其中，（A）图是未经处理的小麦秸秆样品；（B）图是菌株BSC6ΔA8降解48h后的小麦秸秆样品。

[0030] 以下结合附图和实施例对本发明作进一步地详细说明。

具体实施方式

[0031] 本实施例给出一种无特定抗性基因枯草芽孢杆菌，该无特定抗性基因枯草芽孢杆菌株命名为BSC6ΔA8，在中国典型培养物保藏中心的保藏号为CCTCC NO:M20221487。

[0032] 本实施例中，所述无特定抗性基因枯草芽孢杆菌为菌株Bacillus subtilisC6的衍生菌株。

[0033] 该菌株Bacillus subtilisC6的16SrRNA序列如下：

[0034] tcggagagtttgatcctggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatgggagcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaagactgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttcaaacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagttggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggccacactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgcaatggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttagggaagaacaagtaccgttcgaatagggcggtaccttgacggtacctaaccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcccccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagtggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggcgactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgccccttagtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttcgggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaaggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgccccttatgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggttaagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttttaggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaacaaggtagccgtatcggaaggtgcggctggatcacctccttt。

[0035] 所述无特定耐药性基因的枯草芽孢杆菌的构建方法是，利用CRISPR/Cas9系统敲除上述菌株Bacillus subtilisC6的10个抗性基因获得，敲除总片段合计约7.9kb。这10个抗性基因包括：四环素耐药基因ykkC和ykkD、链霉素耐药基因vgbA和aadK、螺旋霉素耐药基因mph、喹诺酮类耐药基因bmr和blt、衣霉素耐药基因tmrB以及林克霉素耐药基因lmrA和lmrB。

[0036] 具体实施步骤为：

[0037] 1）以pJOE8999载体（Altenbuchner J. 2016. Editing of theBacillus subtilisgenome by the CRISPR‑Cas9 System. Applied and Environmental Microbiology, 82: 5421‑5427.）作为出发载体构建CRISPR/Cas9基因敲除载体。

[0038] 2）使用CRISPROR工具进行sgRNA引物设计，退火连接至BsaI酶切的pJOE8999线性载体，各靶基因的同源臂修复序列通过无缝克隆连接至SalI和XbaI酶切位点之间。

[0039] 3）CRISPR/Cas9完成基因敲除以后可通过温度变化进行质粒去除，获得无抗性标记的基因敲除菌。

[0040] 4）通过依次敲除10个抗性基因，最终获得的抗性基因敲除菌命名为BSC6ΔA8；

[0041] 5）评估野生型枯草芽孢杆菌和基因敲除菌BSC6ΔA8对不同抗菌药物的敏感性。

[0042] 本实施例构建的基因敲除菌BSC6ΔA8，尤其对克林霉素、林可霉素、链霉素和螺旋霉素的抗生素浓度响应更敏感。能破坏小麦秸秆中的纤维结构，显著降低小麦秸秆中的NDF和ADF含量。

[0043] 根据申请人的实验表明，所述的无特定耐药性基因枯草芽孢杆菌株在粗饲料降解中的应用。

[0044] 按如下步骤实施：

[0045] 1）制备菌株BSC6ΔA8的菌悬液，以5%的菌液接种量与收获期小麦秸秆均匀混合，于37℃条件下培养48 h后终止发酵。

[0046] 2）取发酵后的小麦秸秆样品测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量。

[0047] 3）以场发射扫描电子显微镜测定降解前和降解后小麦秸秆的表面形态结构变化。

[0048] 4）利用X射线衍射法测定降解前和降解后小麦秸秆的纤维素结晶度变化。

[0049] 以下是发明人给出的具体实施例。

[0050] 需要说明的是，以下实施例是本发明较优的例子，仅用于本领域技术人员充分理解和实施本发明，本发明不限于以下的实施例。

[0051] 实施例1：CRISPR/Cas9基因敲除载体的构建

[0052] 本实施例中的CRISPR/Cas9基因敲除载体由pJOE8999载体（Altenbuchner J. 2016. Editing of theBacillus subtilisgenome by the CRISPR‑Cas9 System. Applied and Environmental Microbiology, 82: 5421‑5427.）构建获得，该载体包含sgRNA、Cas9、同源臂修复序列以及温敏型复制子pE194，共构建了8个基因敲除载体。

[0053] 使用在线设计工具CRISPROR（Concordet J, Haeussler M. 2018. CRISPOR: intuitive guide selection for CRISPR/Cas9 genome editing experiments and screens. Nucleic Acids Research, 46: W242‑W245.）进行sgRNA设计，并在5’端添加BsaI酶切的互补配对碱基即得到最终的sgRNA引物序列（表1）。引物退火连接至经过BsaI酶切的pJOE8999线性载体，然后转化感受态，涂布相应抗性平板，次日挑取单克隆以引物对“JOE‑sg‑F/‑R”（表1）进行菌落PCR鉴定，并进行Sanger测序进一步鉴定。

[0054] 表1：CRISPR/Cas9基因敲除载体的sgRNA序列

[0055]

[0056] 根据NCBI公布的B.subtilis168（taxid:224308）参考基因组信息，以上述拟敲除的基因上下游序列信息，设计基因敲除的同源臂扩增引物（表2），分别扩增上下游同源臂修复片段并纯化回收。

[0057] 将上述成功连接sgRNA的pJOE‑系列载体经SalI和XbaI双酶切回收后，与上述扩增的同源臂修复片段混合进行无缝克隆连接。转化感受态后涂布相应抗性平板，次日挑取单克隆以引物对“JOE‑TYB‑F/‑R”（表2）进行菌落PCR鉴定，并进行Sanger测序进一步确认。最终获得连接了sgRNA和对应同源臂片段的CRISPR/Cas9基因敲除载体，进行质粒去甲基化操作，可用于后续枯草芽孢杆菌中的基因敲除。

[0058] 表2：同源臂片段扩增引物

[0059]

[0060] 实施例2：枯草芽孢杆菌抗性基因的敲除及质粒去除

[0061] 将实施例1构建好的CRISPR/Cas9基因敲除载体转化枯草芽孢杆菌，涂布含卡那霉素抗性和0.2%甘露糖的筛选平板，于30℃静置培养24h后，挑取形态大小正常的单克隆进行菌落PCR鉴定；经鉴定为预期的阳性菌落置于51℃、220rpm过夜摇菌，次日在无抗平板划线，于37℃静置培养16h后，挑取形态大小正常的单克隆分别在无抗平板和卡那霉素抗性平板点接种，可在无抗平板正常生长而在卡那霉素抗性平板上不生长的即为成功去除质粒的菌株，可用于下一轮的基因编辑（图1）。

[0062] 枯草芽孢杆菌中10个抗性基因的敲除顺序依次是（图2）：同时敲除ykkC和ykkD基因共800 bp，敲除vgbA基因970bp，敲除aadK基因800 bp，敲除mph基因800bp，敲除bmr基因1200bp，敲除blt基因1200bp，敲除tmrB基因100bp，最后同时敲除lmrA和lmrB基因共
2000bp。

[0063] 在筛选平板上随机挑取10个单菌落，进行菌落PCR验证（表3），并计算基因敲除效率，除blt基因敲除效率为90%，其余基因的敲除效率均达到100%。最终获得的敲除上述全部10个抗性基因的枯草芽孢杆菌命名为BSC6ΔA8。

[0064] 该枯草芽孢杆菌BSC6ΔA8除了在学校相关的实验室保藏外，并将所述的枯草芽孢杆菌保存至中国典型培养物保藏中心（简称CCTCC），检测结果为存活，保藏号为CCTCC M 20221487，自2022年9月26日起保存30年。

[0065] 表3：菌落PCR验证基因敲除的引物

[0066]

[0067] 实施例3：枯草芽孢杆菌的抗菌药物敏感性分析

[0068] 枯草芽孢杆菌的抗菌药物敏感性分析，参照GB 4789.43‑2016《微生物源酶制剂抗菌活性的测定》中肉汤稀释法进行最低抑菌浓度（Minimal inhibitory concentration，MIC）测定。

[0069] 将庆大霉素、万古霉素、卡那霉素、红霉素、四环素、氯霉素、盐酸克林霉素和链霉素终浓度梯度设定为0、1、2、4、6、8、10、12、14和16μg/mL；

[0070] 将林可霉素、环丙沙星、利福平、达托霉素、衣霉素和螺旋霉素终浓度梯度设定为0、1、2、4、8、12、16和20μg/mL。

[0071] 将枯草芽孢杆菌BSC6ΔA8的菌液和不同浓度的抗菌药物混合液置于37℃培养箱中孵育16h～20h后，用多功能酶标仪在600nm波长下测定吸光度值。MIC定义为抑制细菌肉眼可见生长的最低抗菌药物浓度。

[0072] 测定了野生型枯草芽孢杆菌对14种抗菌药物的MIC，野生型枯草芽孢杆菌在万古霉素、庆大霉素、红霉素、卡那霉素、四环素和氯霉素中的MIC分别为1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、1μg/mL、1μg/mL和6μg/mL（图3A）；在利福平、衣霉素、达托霉素和环丙沙星中的MIC分别为1μg/mL、2μg/mL、2μg/mL和2μg/mL（图3B）。当克林霉素、林可霉素、链霉素和螺旋霉素的药物浓度≥16μg/mL时，仍不能完全抑制野生型枯草芽孢杆菌的生长（图3C），表现出一定程度的耐药性。当敲除10个抗性基因后，枯草芽孢杆菌株BSC6ΔA8对克林霉素、林可霉素、链霉素和螺旋霉素的药物浓度响应更敏感，低浓度的抗菌药物即可显著抑制该菌生长（图4）。菌株BSC6ΔA8基因组中不含有任何WHO规定的CIAs和HIAs耐药基因，因此，菌株BSC6ΔA8不具有获得性耐药。

[0073] 实施例4：BSC6ΔA8对小麦秸秆的降解效果

[0074] 将上述枯草芽孢杆菌BSC6ΔA8在2 mL LB培养液中37℃、220rpm摇菌16 h，然后以1%比例接种至50mL LB培养液，37℃、220rpm摇菌24 h获得发酵菌悬液。将收获期的小麦秸秆经干燥后剪成小段，用粉碎机粉碎并过1mm筛。称取10g±0.5g小麦秸秆样，于120℃灭菌
20min后，65℃烘干48h备用；同时配制浸润培养基（w/v）：0.5% NH4NO3、0.1% MgSO4·7H2O和
0.1% NaCl，120℃灭菌20min后备用。

[0075] 将10g小麦秸秆样品和50mL浸润培养基在发酵袋中以5%的菌液接种量均匀混合，于37℃条件下培养48h后终止发酵；以5%的无菌LB培养液等量替代菌悬液作为空白对照组。培养结束后将各组别的小麦秸秆于65℃烘干至恒重，参照ANKOM 200i型半自动纤维分析仪操作说明书测定中性洗涤纤维（NDF）和酸性洗涤纤维（ADF）含量。将过200目筛的烘干小麦秸秆样品经粘台、喷金、抽真空等操作后，以场发射扫描电子显微镜测定降解前和降解后小麦秸秆的表面形态结构变化。采用X‑射线衍射仪对小麦秸秆的纤维素结晶度进行测定，并计算结晶度。

[0076] 将菌株BSC6ΔA8与小麦秸秆混合发酵48h后，扫描电镜结果（图5）显示小麦秸秆表面粗糙，结构不完整且变得松散多孔，表面呈分离状，说明纤维素结构发生了严重破坏。小麦秸秆的NDF含量由68.6%降至62.0%，ADF含量由60.4%降至48.3%，纤维素结晶度由41.1%降低至35.3%。

[0077] 本实施例获得的无特定抗性基因枯草芽孢杆菌BSC6ΔA8，能高效降解小麦秸秆中的纤维素成分，证明了敲除枯草芽孢杆菌的多个耐药基因，不会改变其对秸秆类粗饲料的降解能力，具有生物降解秸秆类粗饲料的生产应用潜力。

[0078] 上文虽然已对本发明及其实施方式做了详尽的描述，应当指出，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以对本发明技术方案相应的技术特征做进一步的添加或者替换，这些添加或者替换也应视为本发明权利要求所限定的保护范围。