一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪

摘要

本发明提供了一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，属于阻抗流式细胞仪技术领域；解决了现有阻抗流式细胞仪检测精度低、集成度低的问题；包括微流控系统、锁相放大器和PC端，微流控系统包括集成在PCB板上的微流体器件、第一信号产生电路、第二信号产生电路、数据读出电路，微流体器件包括微流体通道、有机电化学晶体管，微流体通道的样品入口处设置有聚焦区域电极，第一信号产生电路、第二信号产生电路分别连接至聚焦区域电极的上下两端；锁相放大器产生交流信号通过第一信号产生电路、第二信号产生电路传输至聚焦区域电极上，通过读出两个有机电化学晶体管的漏极电流实现细胞阻抗测量；本发明应用于阻抗流式细胞仪。

权利要求

1.一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，其特征在于：包括微流控系统、锁相放大器和PC端，所述微流控系统包括集成在PCB板上的微流体器件、第一信号产生电路、第二信号产生电路、数据读出电路，所述微流体器件包括使细胞进入微流控系统的微流体通道、用于测量细胞阻抗的有机电化学晶体管，所述微流体通道的样品入口处设置有聚焦区域电极，所述第一信号产生电路、第二信号产生电路分别连接至聚焦区域电极的上下两端，产生作用于细胞上的介电泳力；

所述锁相放大器产生交流信号通过第一信号产生电路、第二信号产生电路传输至聚焦区域电极上，所述数据读出电路通过读出有机电化学晶体管的漏极电流实现差分测量细胞阻抗，并将上述测量的细胞阻抗通过锁相放大器传输至PC端进行分析，得到细胞的浓度、数量、活性和大小；

所述第一信号产生电路具体采用波形发生器，所述第二信号产生电路具体采用功率放大器，所述数据读出电路具体采用跨阻放大器；

所述有机电化学晶体管具体设置两个，两个所述有机电化学晶体管放置时采用上下对称的结构放置，并将两个有机电化学晶体管的漏极并联接入数据读出电路的输入端，两个栅极通过信号产生电路产生相位相反的交流电压，源极接地，通过读出漏极附近相同位置的电位差从而形成差分电路。

2.根据权利要求1所述的一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，其特征在于：所述微流体通道采用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、Flexdym或聚偏二氟乙烯材料的弹性体制作形成。

3.根据权利要求1所述的一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，其特征在于：所述有机电化学晶体管的金属栅极在弹性聚合物高分子材料上加工制造，有机电化学晶体管的金属源极与金属漏极在高分子热可塑性聚合体高分子材料上加工制造，采用导电高分子材料实现有机电化学晶体管的源极和漏极之间的导通，导电高分子材料的图案化工艺在派瑞林上或通过JRP纳米镀膜技术完成。

4.根据权利要求1所述的一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，其特征在于：所述聚焦区域电极具体采用锥形形状的电极实现细胞检测。

5.根据权利要求1所述的一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，其特征在于：所述有机电化学晶体管对细胞阻抗的测量是基于细胞的介电特性进行检测的。

6.根据权利要求1所述的一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，其特征在于：所述微流体器件上的测量电极均垂直于微流体通道中流体流动的方向。

7.根据权利要求1所述的一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，其特征在于：所述有机电化学晶体管在低频时读出漏极电流，高频时读出栅极电流。

说明书

一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪

技术领域

[0001] 本发明提供了一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，属于阻抗流式细胞仪技术领域。

背景技术

[0002] 与典型的流式细胞仪通道尺寸相比，微型化的尺寸允许微流控系统分析单个细胞，以识别基因表达的细胞变异性，或细胞群中的药物反应。基于OECT的细胞仪相比传统的台式仪器具有更低的尺寸和成本，更加便携。此外，阻抗流式细胞仪具有非标记、低污染和检测速度快等显著优势，可大大减少时间消耗并降低制造成本。

[0003] 流式细胞术是对处于液流中悬浮状态的细胞及亚细胞结构等生物颗粒和非生物颗粒进行多参数分析、快速准确定量分析及分选的技术。传统的流式细胞仪通常采用细胞标记方法对其进行分析，但是对于细胞的荧光标记会有极大的概率损伤细胞表面结构，降低细胞活力，标记后的细胞由于受到了损伤，难以进行后续的生物化学分析。相比于传统的流式细胞仪，阻抗分析为评估普通标记方法无法实现的细胞特征提供了可能性，就像荧光光谱一样，细胞的阻抗谱可以揭示细胞的特性。因此，多参数分析也可以用阻抗细胞术进行，这种无标记的方法可以保护细胞免受标记制备所产生的不良影响。

[0004] 阻抗流式细胞仪是基于细胞介电特性进行检测的，通过介电特性进行细胞表征不需要免疫标记。细胞具有膜电容、膜电阻、细胞液电阻、核电容、核电阻、电导率等参数，膜电容和电导率等介电特性反映了膜的形态和功能，而膜的形态和功能又与细胞之间的生理差异或细胞随时间的病理变化相关。例如，当不同大小和活性的细胞随悬浮液流经广频交流电场时将产生不同的电阻抗信号，经解析可获得细胞的浓度、数量、活性及大小等信息。这种阻抗流式细胞仪相对于传统的流式细胞仪，可以揭示更全面的细胞特性。

[0005] 场效应晶体管应用于阻抗测量时，栅极上的激励电压UG（ω）将产生两路电流响应，即源‑漏极电流（ID）与栅‑源极电流（IG）。其中，U（G ω）与IG（ω）的商等效为两电极体系阻抗Z（ω），而I（D ω）与U（G ω）的商是场效应晶体管的跨导响应（g（m ω））。由于晶体管的放大特性，中低频ID（ω）通常是I（G ω）的数个数量级。因此，晶体管中低频跨导响应与高频栅极阻抗互补偿技术可解决电极微型化过程中激增界面阻抗衰减电流频率响应的问题。

[0006] 有机电化学晶体管（OECT）是以可进行离子三维掺杂的导电聚合物作为半导体层，并以水溶液为介质层的一种场效应晶体管，其稳态跨导值可达数百毫西门子，可以有效地将生物系统中的低水平离子通量转导和放大为电子输出信号。基于OECT的信号放大能力是常规有机晶体管的近百倍，采用OECT作为阻抗流式细胞仪电极将极大改善检测精度，促进其集成化、微型化发展。

发明内容

[0007] 本发明为了解决现有阻抗流式细胞仪检测精度低、集成度低和微型化难的问题，提出了一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪。

[0008] 为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，包括微流控系统、锁相放大器和PC端，所述微流控系统包括集成在PCB板上的微流体器件、第一信号产生电路、第二信号产生电路、数据读出电路，所述微流体器件包括使细胞进入微流控系统的微流体通道、用于测量细胞阻抗的至少两个有机电化学晶体管，所述微流体通道的样品入口处设置有聚焦区域电极，所述第一信号产生电路、第二信号产生电路分别连接至聚焦区域电极的上下两端，产生作用于细胞上的介电泳力；

[0009] 所述锁相放大器产生交流信号通过第一信号产生电路、第二信号产生电路传输至聚焦区域电极上，所述数据读出电路通过读出有机电化学晶体管的漏极电流实现差分测量细胞阻抗，并将上述测量的细胞阻抗通过锁相放大器传输至PC端进行分析，得到细胞的浓度、数量、活性和大小。

[0010] 所述微流体通道采用聚二甲基硅氧烷、聚甲基丙烯酸甲酯、Flexdym或聚偏二氟乙烯材料的弹性体制作形成。

[0011] 所述有机电化学晶体管具体设置两个，两个所述有机电化学晶体管放置时采用上下对称的结构放置，并将两个有机电化学晶体管的漏极并联接入数据读出电路的输入端。

[0012] 所述有机电化学晶体管的金属栅极在弹性聚合物高分子材料上加工制造，有机电化学晶体管的金属源极与金属漏极在高分子热可塑性聚合体高分子材料上加工制造，采用导电高分子材料实现有机电化学晶体管的源极和漏极之间的导通，导电高分子材料的图案化工艺在派瑞林上或通过JRP纳米镀膜技术完成。

[0013] 所述第一信号产生电路具体采用波形发生器，所述第二信号产生电路具体采用功率放大器，所述数据读出电路具体采用跨阻放大器。

[0014] 所述聚焦区域电极具体采用锥形形状的电极实现细胞检测。

[0015] 所述有机电化学晶体管对细胞阻抗的测量是基于细胞的介电特性进行检测的。

[0016] 所述微流体器件上的测量电极均垂直于微流体通道中流体流动的方向。

[0017] 所述有机电化学晶体管在低频时读出漏极电流，高频时读出栅极电流。

[0018] 本发明相对于现有技术具备的有益效果为：本发明提供的基于有机半导体的阻抗流式细胞仪通过信号产生电路接至聚焦区域电极产生介电泳力作用于细胞，通过有机电化学晶体管测量细胞的阻抗信号，由数据读出电路将细胞的电阻抗信号发送至锁相放大器，并通过与锁相放大器匹配的软件对电阻抗信号进行分析，得到了细胞的浓度、数量、活性及大小等信息；本发明可通过对单个细胞的阻抗进行分析，揭示更全面的细胞特性。

附图说明

[0019] 下面结合附图对本发明做进一步说明：

[0020] 图1为本发明基于有机半导体的阻抗流式细胞仪的结构示意图；

[0021] 图2为本发明样品入口处用于介电泳聚焦的入口聚焦区域电极的结构示意图；

[0022] 图3为本发明单个细胞经过电极时的简化电路模型图；

[0023] 图4为本发明两个有机电化学晶体管放置的结构示意图；

[0024] 图5为使用PDMS的微流体通道制作过程示意图；

[0025] 图6为本发明采用对称有机电化学晶体管进行细胞阻抗测量的电路原理图；

[0026] 图中：1为PCB板、2为锁相放大器、3为PC端、4为微流体器件、5为微流体通道、6为细胞、7为有机电化学晶体管、8为第一信号产生电路、9为第二信号产生电路、10为数据读出电路、11为聚焦区域电极、12为培养基电容、13为细胞膜、14为细胞膜电容、15为细胞质电阻、16为培养基电阻、17为细胞质、18为双电层电容、19为栅极、20为源极、21为漏极、22为带有图案光刻胶的硅片、23为超厚光刻胶、24为PDMS预聚体、25为试剂导入入口。

具体实施方式

[0027] 如图1至图6所示，本发明提供了一种基于有机半导体的阻抗流式细胞仪，包括微流控系统和数字锁相放大器，其中数字锁相放大器包括锁相放大器2和PC端3，其中PC端3上设置有与锁相放大器2配套的软件对信号进行分析处理，本发明采用MFLI数字锁相放大器及其配套软件。

[0028] 本发明的微流控系统包括焊接到PCB板1上的微流体器件4、第一信号产生电路8、第二信号产生电路9和数据读出电路10，微流体器件4上设置有微流体通道5和有机电化学晶体管7，细胞6通过微流体通道5进入微流控系统，由有机电化学晶体管7对细胞阻抗进行放大处理，且至少采用两个有机电化学晶体管7通过差分方式对细胞阻抗进行测量。

[0029] 本发明微流体通道5的入口处设置有如图2所示的锥形的聚焦区域电极11，第一信号产生电路8、第二信号产生电路9接至聚焦区域电极11的上下两端产生介电泳力作用于细胞6；锁相放大器2连接第一信号产生电路8、第二信号产生电路9和数据读出电路10，其中，锁相放大器2的内部处理模块对信号进行处理；对所获得的信号读取在PC端3进行，在其中，PC端3上的配套软件对锁相放大器2收集的信号进行分析，通过分析细胞流经交流电场产生的阻抗信号可获得细胞的浓度、数量、活性及大小等信息。

[0030] 本发明的第一信号产生电路8为波形发生器，第二信号产生电路9为功率放大器，交流信号由锁相放大器2产生，通过波形发生器进一步生成并由功率放大器进行放大。数据读出电路10为跨阻放大器，跨阻放大器以差分方式测量来自底部电极的响应电流，即读出两个有机电化学晶体管7的漏极21电流，并将其转换为电压，由锁相放大器2连接PC端3进行分析。

[0031] 本发明的微流体通道5可用聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、Flexdym、聚偏二氟乙烯（PVDF）等弹性体制造。

[0032] 本发明采用有机电化学晶体管7对细胞阻抗的测量是基于细胞介电特性进行检测。有机电化学晶体管7对不同频率的电流响应可用于细胞的不同参数测量。

[0033] 本发明的两个有机电化学晶体管7的源极20、漏极21和栅极19的放置结构上下对称，如图4和6所示，两个栅极通过信号产生电路产生相位相反的交流电压，源极接地，通过读出漏极附近相同位置的电位差从而形成差分电路，两个有机电化学晶体管7对称放置可以形成理想的差分输出，同时抑制有害的共模信号。

[0034] 本发明的有机电化学晶体管7的金属栅极在弹性聚合物高分子材料上加工制造；导电高分子材料用于源极和漏极之间的导通，导电高分子材料的图案化工艺需在派瑞林上或通过JRP纳米镀膜技术完成，金属源极与金属漏极在热可塑性聚合体高分子材料上加工制造。

[0035] 本发明的微流体器件4的测量电极都垂直于微流体通道5中流体流动的方向。

[0036] 图1为本发明基于有机半导体的阻抗流式细胞仪的结构示意图，将阻抗谱与微流控流式细胞仪相结合，形成了芯片实验室设备，能够对单细胞进行无标记阻抗表征。细胞6或颗粒分散在液体中，通常是电解质，例如磷酸盐缓冲盐水（PBS），并通过微流体通道5泵送。微流控系统由锁相放大器2和波形发生器产生交流信号，通过功率放大器对信号进行放大处理，导致电流在电极之间流动。跨阻放大器以差分方式测量来自底部电极的响应电流，并将其转换为电压。微流控系统中测量电极为有机电化学晶体管7。

[0037] 本发明实施例中各器件采用的型号分别为：波形发生器AD5930、功率放大器AD8132、跨阻放大器MAX4416，其中波形发生器AD5930、功率放大器AD8132、跨阻放大器MAX4416和微流体器件4都安装在专用的PCB板1上，如图1所示。这样可以保持组件之间的连接较短，从而最大限度地减少信号反射和耦合到系统中的噪声。因为微流体通道5的频率相关阻抗与数模转换器（DAC）的输出阻抗不匹配，所以功率放大器是必需的。它与微流体器件4的紧密放置确保了在整个频率范围内保持信号完整性。跨阻放大器的目的是将差分响应电流转换为电压，该电压可以通过模数转换器（ADC）测量。

[0038] 介电泳聚焦的聚焦区域电极11为锥形，如图2所示。锥形电极可以以所需的角度引导细胞6向储层移动，是一种有效的分离技术。上下两个电极分别连接至第一信号发生器8和第二信号发生器9。利用锁相放大器2、第一信号发生器8和第二信号发生器9产生的交流电电场，形成介电泳力，沿电场强度梯度作用于细胞6，介电介质中具有一定介电特性的细胞6与微流体通道5中分布不均匀的外电场相互作用所产生的力称为介电泳力。锥形通道的中心有一个最小强度的电场，介电泳力将粒子加速到这一点，因此，将它们集中在通道中心的单一流中。这种方法与其他的例如水动力聚焦相比的优点是，它允许细胞6在三维中聚焦，因为聚焦力作用在细胞6上而不是流体上。此外，当电极被设计成小间隙时，可以聚焦直径10μm的细胞6，甚至可以聚焦更小直径的细胞6。

[0039] 本发明提出的阻抗流式细胞仪对不同频率的电流响应可用于细胞6的不同参数测量。在低频时，细胞膜对电流流动提供了显著的屏障，阻抗振幅决定了细胞6的大小。检测体积的电导率仅取决于细胞6的相对体积。在中频，细胞膜极化降低，阻抗测量提供有关膜特性的信息。在高频率下，细胞膜极化最小，测量提供了细胞内结构和细胞内部的信息。

[0040] 图3为本发明单个细胞经过电极时的简化电路模型图，测量细胞膜13内部的细胞膜电容14、细胞质17内部的细胞质电阻15，以及培养基电阻16和培养基电容12、共面微电极表面与介质之间的双电层电容18。微流控系统的阻抗在低频范围由双电层电容18主导。因此，在阻抗通道中灵敏度是非常低的检测一个单元。随着频率的增加，电极‑电解质界面的双电层电容18逐渐减小。同时，当信号的绝对振幅受单元大小的影响时，微流控系统的灵敏度提高。在1MHz‑100MHz频率范围内，细胞6与悬浮介质界面的极化导致电场增大是阻抗变化的主要因素。频率ω增加到更高的范围即ω＞100MHz时，细胞膜电容14有效短路，阻抗则取决于细胞质电阻15。

[0041] 悬浮介质的电导率在决定检测原理的灵敏度方面起着重要作用。只有当细胞质17的电导率与悬浮介质的电导率显著不同时，才能检测到细胞6，这是因为本发明使用的测量方法只能检测到电极之间介电特性的变化。其次，介质导电性越高，通道电阻越小，谐振峰的锐度就越低，灵敏度也就越低。为了结果的简单性和重现性，采用去离子水悬浮介质。

[0042] 用于制造微流体通道5的材料必须具有生物相容性和形状设计上的灵活性，使微流体通道5中的细胞6保持其生物学特性。弹性体材料如聚二甲基硅氧烷（PDMS）、聚甲基丙烯酸甲酯（PMMA）、Flexdym或聚偏二氟乙烯（PVDF）等具有生物相容性，形状灵活，易于与玻璃衬底或硅衬底结合。它与微电子制造工艺兼容，可以制造几微米大小的结构。具有通道结构的弹性体层可以通过电极连接到玻璃/硅芯片上，形成封装的微流体器件4。在大多数情况下，弹性体中形成了微流体通道5，可以抵抗大部分电极与流体的接触，从而提高电极的灵敏度。

[0043] 图4为本发明两个有机电化学晶体管放置的结构示意图，两个有机电化学晶体管7并联连接可完成对信号的差分测量。有机电化学晶体管7能够将生物信号转换为具有高增益的电信号。有机电化学晶体管7作为阻抗传感器的灵敏度可以通过根据广泛的组织电阻范围调整通道面积来提高。有机电化学晶体管7在低频时读出漏极电流，高频时读出栅极电流，通过读出不同的电流可以测量全频率范围的响应，克服了传统芯片在低频噪声大的问题。有机电化学晶体管7对不同频率的电流响应可用于细胞6的不同参数测量。如低频可获得细胞尺寸，中频可研究细胞膜参数，高频反应细胞质信息。采用有机电化学晶体管7作为电极时，分析跨导曲线可优化中低频电流响应的信噪比。

[0044] 图5为使用PDMS的微流体通道制作过程示意图，PDMS微芯片可以通过微尺度成型工艺制造。在实验室使用时，带有图案光刻胶的硅片22可以用作模具母片。为了拥有相对较厚的微流体通道5和微室结构，用于试剂和样品的运输，采用了SU‑8型号的超厚光刻胶23。模压成型后，将PDMS预聚体24倒入模具母模中。然后将固化的PDMS预聚体24从母版上剥下来贴在平板上，在平板上事先钻好试剂导入入口25，平板使用玻璃。PDMS预聚体24可以复制到亚微米特征尺寸的精细结构。通过图5所示的简单的成型工艺，可以获得表面光滑的微流体通道5结构。

[0045] 图6为本发明采用对称有机电化学晶体管进行细胞阻抗测量的电路原理图，微型正弦信号产生电路由基于DDS技术的波形发生器AD5930生成。数据读出电路由跨组放大器MAX4416和MFLI锁相放大器构成。

[0046] 阻抗所需的正弦电压信号（从100kHz到1MHz）是由基于巩固直接数字合成（DDS）技术的专用现货组件（AD5930）生成的。差分输出电流通过全差分跨阻级功率放大器AD8132转换为电压。电流流过通道，在电源和传感电极之间，被放大并通过跨阻放大器MAX4416转换成电压。为了避免任何法拉第电流的贡献，由于电化学反应在电极上，所有电极偏压在相同的直流电位，如图中的VCM，设置为电源动态的中间级（1.75V相对于电源地）。这是输入虚地的电位和正弦信号的基线。

[0047] 波形发生器AD5930是基于巩固直接数字合成（DDS）技术的专用现货组件，是一款具有可编程频率扫描和输出突发能力的波形发生器。利用嵌入式数字处理，可以增强频率控制，该设备生成合成的模拟或数字频率步进波形。波形从一个已知的相位开始，并不断地增加相位，这使得相移很容易确定。AD5930仅消耗8mA，为波形生成提供了方便的低功耗解决方案。AD5930可在多种模式下工作。在连续输出模式下，设备在定义的时间长度内输出所需的频率，然后切换到下一个频率。在突发模式下，设备输出其频率一段时间，然后在进入下一个频率之前返回到中频，继续预定义的时间长度。

[0048] 功率放大器AD8132是一种低成本的差分或单端输入差分输出放大器，具有电阻设置增益。差分信号处理减少了困扰地面参考系统的地面噪声的影响。AD8132可用于整个信号链的差分信号处理（增益和滤波），轻松简化差分和单端组件之间的转换。

[0049] 跨组放大器MAX4416结合了高速性能、低失真和超低供电电流。跨组放大器MAX4416为双运放单位增益稳定，带宽为400MHz‑3dB，转换速率为200V/µs。

[0050] 关于本发明具体结构需要说明的是，本发明采用的各部件模块相互之间的连接关系是确定的、可实现的，除实施例中特殊说明的以外，其特定的连接关系可以带来相应的技术效果，并基于不依赖相应软件程序执行的前提下，解决本发明提出的技术问题，本发明中出现的部件、模块、具体元器件的型号、相互间连接方式以及，由上述技术特征带来的常规使用方法、可预期技术效果，除具体说明的以外，均属于本领域技术人员在申请日前可以获取到的专利、期刊论文、技术手册、技术词典、教科书中已公开内容，或属于本领域常规技术、公知常识等现有技术，无需赘述，使得本案提供的技术方案是清楚、完整、可实现的，并能根据该技术手段重现或获得相应的实体产品。

[0051] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。