食管癌的代谢标志物及其应用

摘要

本发明提供了食管癌的代谢标志物及其应用，具体的，所述的代谢标志物包括3‑Hydroxyglutaricacid、4‑(Trimethylammonio)butanoate和/或D‑Alanyl‑D‑alanine，优选地，所述的代谢标志物还包括L‑Glutamicacid和/或L‑Proline。本发明所述的代谢标志物能够用于预测或诊断食管癌，具有较好的诊断效能，对于提高食管癌患者的生存率具有重要意义。

权利要求

1.检测组织样本中代谢标志物的浓度或含量的试剂在制备预测或诊断食管鳞癌的产品中的应用，其特征在于，所述的代谢标志物包括3‑羟基戊二酸、丁基甜菜碱和D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢标志物还包括谷氨酸和/或脯氨酸。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的代谢标志物为3‑羟基戊二酸、丁基甜菜碱、D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸的组合。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的试剂包括通过核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法或其组合方法检测组织样本中所述代谢标志物浓度或含量的试剂。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的产品包括试剂盒或芯片。

6.代谢标志物在构建食管鳞癌预警模型中的应用，其特征在于，所述代谢标志物包括

3‑羟基戊二酸、丁基甜菜碱和D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸，所述的食管鳞癌预警模型以组织样本中所述的代谢标志物的含量或浓度作为输入变量。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述代谢标志物还包括谷氨酸和/或脯氨酸。

8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述代谢标志物为3‑羟基戊二酸、丁基甜菜碱、D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸、谷氨酸和脯氨酸的组合。

9.一种基于代谢组学数据的食管鳞癌预警装置，其特征在于，所述的食管鳞癌预警装置包括：模型加载模块，用于加载权利要求6‑8任一项所述的应用所构建的食管鳞癌预警模型；

指标值采集模块，用于根据所述食管鳞癌预警模型，获取待诊断受试者对应每种代谢标志物的指标值，所述代谢标志物包括3‑羟基戊二酸、丁基甜菜碱和D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸；

指标值检测模块，用于判断待诊断受试者对应每种代谢标志物的指标值是否超过预设正常取值范围；

食管鳞癌预警模块，用于根据判断结果，输出待诊断受试者的食管鳞癌预警信息。

说明书

食管癌的代谢标志物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体涉及食管癌的代谢标志物及其应用。

背景技术

[0002] 食管癌(Esophageal cancer)是发病率和死亡率均位居前十的恶性肿瘤之一，列于全部恶性肿瘤的第六位。食管癌是长期威胁我国居民健康的主要恶性肿瘤。组织学类型上，我国食管癌以鳞状细胞癌为主，占90％以上，而美国和欧洲以腺癌为主，占70％左右。在我国食管癌高发区，主要致癌危险因素是致癌性亚硝胺及其前体物和某些真菌及其毒素。而对于食管腺癌，主要的危险因素包括胃食管反流和巴雷特食管(Barrett esophagus)。

[0003] 早期食管癌的症状一般不明显，常表现为反复出现的吞咽食物时有异物感或哽咽感，或胸骨后疼痛。一旦上述症状持续出现或吞咽食物有明显的吞咽哽咽感或困难时提示食管癌已为中晚期。查体时大多数食管癌患者无明显相关阳性体征。当患者出现有头痛、恶心或其他神经系统症状和体征，骨痛、肝大、胸腹腔积液、体重明显下降、皮下结节，颈部淋巴结肿大等，提示有远处转移的可能，需要进一步检查确诊。因此，对高危人群和高发地区人群的筛查，早期发现和早期治疗阻断早期食管癌发展成为中晚期食管癌是提高食管癌生存效果和保证患者生活质量的根本出路，也是减轻我国政府和民众医疗负担的长期有效措施。

[0004] 蛋白组学和代谢组学作为两种重要的组学技术，近年来也越来越多地应用于癌症研究当中。目前代谢组学的技术主要有质子核磁共振谱(Proton Nuclear Magnetic 1
Resonance，H‑NMR)和质谱(Mass Spectrometry，MS)，两种技术各有优势。

[0005] 1H‑NMR是基于射频脉冲照射样本使被观察的核同时被激发而发生共振，以实现定量检测机体在病理生理状态下出现的微小代谢物改变。其样本预处理简单、试剂便宜；检测高度稳定、时间短、精度高、重复性好、无破坏性；单次检测可获得丰富的含氢代谢物信息；多种谱编辑技术使得代谢物检测灵活高效；磁屏蔽和低温技术的进步使核磁共振仪更精
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巧、更便宜。H‑NMR适用于临床多中心大样本及纵向研究，无论是数万样本量还是横跨多年
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的多中心样本，H‑NMR检测均稳定不弥散，是肿瘤代谢组学筛查研究的首选技术。

[0006] MS则灵敏度更高，在本发明实验中，每一种检测物质都有标准品可供精确验证，并且经由同位素内标校正，覆盖近600种代谢物的绝对定量，能检测氨基酸、苯类、碳水化合物、吲哚、有机酸、嘌呤、核苷类、固醇类、吡啶、生物胺、短链脂肪酸等种类丰富的代谢物小分子，适用于精准医学时代的精准疾病诊断。

发明内容

[0007] 本申请的目的在于通过对食管癌样本进行代谢组学分析，筛选具有较好诊断效能的代谢标志物。

[0008] 具体方案：

[0009] 第一方面，本发明提供了用于预测或诊断食管癌的代谢标志物，所述的代谢标志物包括3‑Hydroxyglutaric acid(3‑羟基戊二酸)、4‑(Trimethylammonio)butanoate(丁基甜菜碱)和/或D‑Alanyl‑D‑alanine(D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸)，

[0010] 作为一种优选的的实施方式，所述的代谢标志物还包括L‑Glutamic acid(谷氨酸)和/或L‑Proline(脯氨酸)，

[0011] 作为一种更为优选的实施方式，所述的代谢标志物为3‑Hydroxyglutaric acid(3‑羟基戊二酸)、4‑(Trimethylammonio)butanoate(丁基甜菜碱)、D‑Alanyl‑D‑alanine(D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸)、L‑Glutamic acid(谷氨酸)和L‑Proline(脯氨酸)的组合。

[0012] 第二方面，本发明提供了一种检测样本中如本发明第一方面所述的代谢标志物的浓度或含量的试剂。

[0013] 作为一种优选的实施方式，所述的试剂包括通过核磁共振法、色谱法、光谱法、质谱法或其组合方法检测样本中所述代谢物浓度或含量的试剂。

[0014] 作为一种优选的实施方式，所述的样本为组织。

[0015] 第三方面，本发明提供了本发明第二方面所述的试剂在制备预测或诊断食管癌的产品中的应用。

[0016] 作为一种优选的实施方式，所述的产品还包括处理样本的试剂。

[0017] 作为一种优选的实施方式，所述的产品包括试剂盒、芯片。

[0018] 作为一种优选的实施方式，所述的食管癌包括食管鳞癌、食管腺癌，更为优选的，所述的食管癌为食管鳞癌。

[0019] 第四方面，本发明提供了本发明第一方面所述的代谢标志物在构建食管癌预警模型中的应用。

[0020] 作为一种优选的实施方式，所述的食管癌预警模型以样本中所述的代谢标志物的含量或浓度作为输入变量。

[0021] 第五方面，本发明提供了一种基于代谢组学数据的食管癌预警装置，所述的食管癌预警装置包括：

[0022] 模型加载模块，用于加载本发明第四方面所述的食管癌预警模型；

[0023] 指标值采集模块，用于根据所述食管癌预警模型，获取待诊断受试者对应每种代谢标志物的指标值；

[0024] 指标值检测模块，用于判断待诊断受试者对应每种代谢标志物的指标值是否超过预设正常取值范围；

[0025] 食管癌预警模块，用于根据判断结果，输出待诊断受试者的食管癌预警信息。

附图说明

[0026] 图1为L‑Glutamic acid的差异表达统计图；

[0027] 图2为L‑Proline的差异表达统计图；

[0028] 图3为3‑Hydroxyglutaric acid的差异表达统计图；

[0029] 图4为4‑(Trimethylammonio)butanoate的差异表达统计图；

[0030] 图5为D‑Alanyl‑D‑alanine的差异表达统计图；

[0031] 图6是3‑Hydroxyglutaric acid用于诊断食管鳞癌的ROC图；

[0032] 图7是4‑(Trimethylammonio)butanoate用于诊断食管鳞癌的ROC图；

[0033] 图8是D‑Alanyl‑D‑alanine用于诊断食管鳞癌的ROC图；

[0034] 图9是代谢物组联合诊断早期食管鳞癌的训练集、验证集(Hold‑out data)诊断效能结果图。

具体实施方式

[0035] 本发明是基于代谢组学的发现，筛选得到可用于预测或诊断食管癌的代谢标志物。本发明发现了3‑Hydroxyglutaric acid、4‑(Trimethylammonio)butanoate、D‑Alanyl‑D‑alanine可以作为代谢标志物用于预测或诊断食管癌。而将3‑Hydroxyglutaric acid、4‑(Trimethylammonio)butanoate、D‑Alanyl‑D‑alanine、L‑Glutamic acid和L‑Proline联合应用，可以获得更好的诊断效果。

[0036] 本发明提供了用于预测或诊断食管癌的代谢标志物。

[0037] 本文使用的术语“代谢标志物”、“代谢生物标志物”或短的“生物标志物”被定义为适合作为食管癌存在和状态的指标化合物，这种化合物是哺乳动物体内的代谢过程中出现的代谢物或代谢化合物。术语“生物标志物”和“代谢生物标志物”通常在本发明的上下文中同义使用，并且通常是指一种代谢物的量或两种或更多种代谢物的含量或比率。因此，术语“代谢生物标志物”或“生物标志物”也包括两种或更多种代谢物之间的含量或比率。

[0038] 本发明中的代谢标志物的含量在食管鳞癌患者和正常对照呈显著性差异，具体的，与正常对照相比，食管鳞癌患者中3‑Hydroxyglutaric acid的水平下调、4‑(Trimethylammonio)butanoate的水平上调、D‑Alanyl‑D‑alanine的水平上调。

[0039] 本文所用术语“差异代谢物”或“显著性差异”表示与第二种样品中相同的一种或多种本发明生物标志物的表达水平比较，经测定代谢物的含量或浓度，在一个样品中本发明的一种或多种代谢标志物的含量或浓度的差异。本文所用“差异代谢物”可以用给定代谢标志物的水平相对于对照中给定代谢标志物的平均水平的比率进行测定，其中比率不等于1.0。还可以用p值测定差异。当使用p值时，当p值小于0.1时代谢标志物被鉴定为在第一和第二群体之间呈现差异。更优选p值小于0.05。甚至更优选p值小于0.01。还更优选p值小于
0.005。最优选p值小于0.001。当基于比率确定差异时，如果第一种和第二种样品中水平的比率大于或小于1.0，则代谢物是呈现差异的。举例来说，大于1.2、1.5、1.7、2、3、4、10、20的比率，或小于1的比率，例如0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05。

[0040] “水平增加”或“上调”表示代谢物相对于对照而言，代谢物水平(以代谢物的含量或浓度测定)显示增加至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％或更多；或1.1倍、1.2倍、1.4倍、1.6倍、1.8倍或更多。

[0041] “水平降低”或“下调”表示代谢物相对于对照而言，代谢物的水平(以代谢物的含量或浓度测定)显示降低至少10％或更多，例如20％、30％、40％或50％、60％、70％、80％、90％；或少于1.0倍、0.8倍、0.6倍、0.4倍、0.2倍、0.1倍或更少。

[0042] 本发明技术人员应当理解，可以利用本领域内已知的任何方法来测定代谢物的水平，例如色谱法、光谱法和质谱法。色谱可以包括GC，LC，HPLC和UHPLC；光谱可包括UV/Vis，IR和NMR；质谱分析器/光谱可以包括ESI‑QqQ，ESI‑QqTOF，MALDI‑QqQ，MALDI‑QqTOF和MALDI‑TOF‑TOF。更优选地，质量分析器/光谱分析包括四极杆质量分析器，离子阱质谱分析器，TOF(飞行时间)质量分析器、轨道阱质量分析器、磁式扇形质量分析器、静电场扇形质量分析器(Electrostatic Sector Mass Analyzer)、离子回旋共振(ICR)以及质量分析器的组合(包括单四极杆(Q)和三重四极杆(QqQ)，QqTOF，TOF‑TOF，Q轨道阱)。优选是使用FLA‑和HPLC‑串联质谱法。

[0043] 其中，GC＝气相色谱，CE＝毛细管电泳，LC＝液相色谱，HPLC＝高度液相色谱，UHPLC＝超高效液相色谱，UV‑Vis＝紫外可见，IR＝红外，NIR＝近红外，NMR＝核磁共振，ESI＝电子喷雾电离，MALDI＝基质辅助激光解吸/电离，TOF＝飞行时间，APCI＝大气压化学电离，QqQ＝三重四极杆配置(也称为Qlq2Q3(Q1和Q3四极杆是质量过滤器，q2是无质量分辨四极杆(no mass‑resolving quadrupole))。

[0044] 本发明提供了一种检测样本中如本发明第一方面所述的代谢标志物的浓度或含量的试剂。

[0045] 用于获得样本的方法为本领域熟知且可采用标准的用于获得样本的任何方法。可使用本发明的方法的样本包括但不限于血清、血液、血浆、全血和其衍生物、皮肤、毛发、毛囊、唾液、口腔粘液、阴道粘液、汗液、泪液、上皮组织、尿液、精子(semen)、精液(seminal fluid)、精浆、前列腺液、前射精液(考珀液(Cowper's fluid))、排泄物、活检组织、腹水、脑脊液、淋巴以及组织提取物的样品或活检样品。(参见，例如，Clinical Proteomics:Methods  and  Protocols,Vol.428 in  Methods in  Molecular  Biology,
Ed.AntoniaVlahou(2008).)。在一个实施方案中，本发明的样本包括食管的任何细胞或组织样品，例如，食管癌肿物。

[0046] 本发明提供了本发明前面所述的试剂在制备预测或诊断食管癌的产品中的应用。

[0047] 在一些实施方案中，预测或诊断的食管癌是食管鳞状细胞癌(SCC)。食管癌通常为产生于食管表皮或表面里层(surface lining)的癌。多数食管癌落入一种或两种类型：鳞状细胞癌，其在其表现以及与烟草和酒精消耗的相关性上与头颈癌相似，以及腺癌，其经常与胃食管返流疾病和巴雷特食管(Barrett's esophagus)病史相关。

[0048] 可使用任何合适的检测来确定癌症的组织学。这些测试和检测包括但不限于，食管癌的通常病征或症状，其包括但不限于食物通过食管和有可能口腔的反向运动(返流)、与进食无关的胸痛、固体或液体吞咽困难、烧心、吐血、声音嘶哑、慢性咳嗽、呃逆、肺炎、骨骼疼痛、进入食管内的出血和体重减轻、病史和身体检查、成像测试、胸部X射线、计算机断层扫描(CT)扫描、磁共振成像(MRI)扫描、正电子发射断层扫描(PET)扫描、骨扫描、痰细胞学、针吸活检、支气管镜检查、支气管内超声、内窥镜食管超声、纵隔镜检查及纵隔切开术、胸腔穿刺、胸腔镜检查、免疫组织化学、分子学测试、验血、吞钡、超声内镜、食道胃十二指肠镜检查(esophaogastroduodenoscopy)(EGD)和活检，或从其衍生的任何合适的方法。

[0049] 其他术语

[0050] 如本文所用，术语“包含”、“包括”、“含有”可互换使用，不仅包括封闭式定义，还包括半封闭、和开放式的定义。换言之，所述术语包括了“由……构成”、“基本上由……构成”。

[0051] 如本文中在诸如“A和/或B”的短语中使用的术语“和/或”旨在包括A和B两者；A或B；A(单独)；以及B(单独)。同样地，在诸如“A、B和/或C”的短语中使用的术语“和/或”旨在涵盖以下实施方案的每一个：A、B和C；A、B或C；A或C；A或B；B或C；A和C；A和B；B和C；A(单独)；B(单独)；以及C(单独)。

[0052] 术语“曲线下面积”或“AUC”指受试者工作特征(ROC)曲线的曲线下面积，二者是本领域中熟知的。AUC测量对于跨全部数据范围比较分类器的准确度是有用的。具有较高AUC的分类器具有在两个目标组(例如，食管癌患者的癌组织样品和食管癌患者的癌旁组织样品中)之间进行正确分类未知的更高的能力。ROC曲线对于在两个群体(例如，对食管癌患者个体和正常个体)之间进行区别时描绘特定特征(例如，本文所描述的任何生物标志物和/或另外的生物医学信息的任何条目)的性能是有用的。通常，以单个特征的值为基础以升序顺序跨越整个群体(例如，病例和对照)选出特征数据。然后，对于该特征的每个值，计算数据的真阳性和假阳性率。真阳性率通过计数高于该特征的值的病例的数目并除以病例总数而确定。假阳性率通过计数高于该特征的值的对照的数目并除以对照总数而确定。虽然该定义指与对照相比较在病例中特征是增高的情况，该定义还应用于与对照相比较在病例中特征较低的情况(在该情况中，将计数低于该特征的值的样品)。ROC曲线可关于单独特征来生成，且可关于其他单独输出来生成，例如，两个或更多个特征的组合可用数学方法结合(例如，相加、相减、相乘等)以提供单独的总和值，且该单独的总和值可绘制于ROC曲线中。另外，其中的组合源自单独的输出值的多个特征的任意组合可绘制于ROC曲线中。特征的这些组合可包括试验。ROC曲线是试验的真阳性率(敏感性)针对试验的假阳性率(1‑特异性)的图。

[0053] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0054] 实施例1早期食管鳞癌诊断相关代谢物的筛选及效能判断

[0055] 一、实验方法

[0056] 1.研究对象和研究设计

[0057] 从汕头大学医学院第二附属医院收集就诊的108份食管鳞癌患者组织(包括食管鳞癌肿物和距离癌灶边缘5cm以上的正常食管黏膜上皮组织)用于NMR代谢组学检测，另取32份早期食管鳞癌患者的组织样本用于MS靶向代谢组学绝对定量验证分析。样本收集后，经前处理、分装、液氮速冻后，储存于‑80℃冰箱，运输过程以干冰作冷链。

[0058] 纳排标准：

[0059] 1)食管鳞癌经由病理活检明确诊断；无明显下消化道症状及胃和小肠的器质性病变；无其他全身性重大疾病等；一年内未行放/化疗，无使用抗生素。

[0060] 2)本项目涉及的临床样本使用均通过伦理委员会审核，取样前均已征求受试者同意并签署知情同意书。

[0061] 2.食管鳞癌患者组织样本制备及NMR波谱检测

[0062] 2.1代谢物提取

[0063] 1)磷酸重水缓冲溶液PBS/D2O配制：pH 7.4，K2HPO4和NaH2PO4的摩尔比为4:1。组织PBS 150mM、含0.05％TSP。

[0064] 2)组织提取液制备：

[0065] 甲醇/氯仿/水以2:2:3比例配成萃取剂。称量一定量组织，切为直径1～3mm小块状置于5mL圆底离心管，加入适量萃取剂、研磨珠，60Hz研磨60‑90s。随后将匀浆液转移至新的10mL玻璃试管，加入余下所需萃取剂，盖好盖子，涡旋60s。混匀后，将匀浆液转移至新的5mL尖底离心管；冰上静置15min，4℃10000rpm离心10min，再次取上清液转移至新的标记好的
5mL尖底离心管中。开盖，置于流动的氮气下以去除甲醇(每隔10min观察标记液面的下降程度至液面不再降低为止)。得到的液体置于‑80℃冷冻，完全冰冻结实后，再冷冻干燥过夜。
将冻干处理后的组织粉末溶于550μLPBS/D2O缓冲液，充分涡旋混匀后于4℃10000rpm离心5分钟，取上清500μL移至5mm核磁管中待测。

[0066] 2.2代谢产物1H‑NMR检测

[0067] 采用Bruker 600MHz谱仪采集一维1H‑NMR谱。使用NOESYGPPR1D自旋回波脉冲序列：[RD‑90°‑t1‑90°‑tm‑90°‑ACQ]进行采样。采用标准的预饱和脉冲序列压制水峰信号，获得自由衰减信号(FID信号)。FID信号经过傅立叶变换转为一维NMR谱图，以TSP信号峰或乳1
酸峰为内标0点调整化学位移值，获得各样本相应的 H‑NMR图谱。

[0068] 2.31H‑NMR数据预处理、谱图分析

[0069] 原始NMR谱由于信号量大、噪音复杂等问题，运用MestReNova核磁谱图处理软件(V14.0版)对原始数据进行预处理，包括傅立叶转换、相位校正、基线校正、频率校准及谱峰归属。所有谱图在进行傅立叶变换时均乘以增宽因子为1Hz的指数窗函数以提高信噪比。通过内标物TSP(δ0.00ppm)确定代谢物的化学位移，将δ0～9ppm范围内的谱以每0.002ppm分段积分进行数据降维，积分之前需将4.6～5.2ppm的峰强度置为0以消除残留水峰对周围谱峰的影响，然后对谱图进行全谱归一化。

[0070] 3.早期食管鳞癌组织样本制备及MS靶向代谢组学检测

[0071] 3.1亲水性代谢物提取及检测

[0072] 1)代谢物提取

[0073] ①在干冰上称取样本(具体称样量见表)，加入2颗小钢珠，加入1000μL含内标提取液(甲醇：乙腈：水＝2：2：1)，含同位素内标)；

[0074] ②于研磨仪中40Hz，4min，冰水浴超声5min，重复步骤3遍；

[0075] ③‑40℃静置2h；

[0076] ④4℃，12000rpm(离心力13800(×g)，半径8.6cm)离心15min，取上清800μL至新EP管，离心浓缩至干燥；

[0077] ⑤160μL 60％乙腈复溶，涡旋30s，冰水浴超声5min，4℃，12000rpm(离[0078] 心力13800(×g)，半径8.6cm)离心15min；

[0079] ⑥取100μL上清装瓶上机。

[0080] ⑦取标准品混合溶液作为QC质控样本，上机检测。

[0081] 2)标准曲线

[0082] 配制标准品混和溶液，依次稀释为一系列浓度的标准溶液进行上机检测，以绘制标准曲线。

[0083] 3)上机检测

[0084] 本发明使用ACQUITY UPLC H‑Class(Waters)超高效液相色谱仪，通过Waters Atlantis Premier BEH Z‑HILIC Column(1.7μm,2.1mm*150mm)液相色谱柱对目标化合物进行色谱分离。液相色谱A相为超纯水：乙腈＝8：2，含10mmol/L乙酸铵，B相为乙腈：超纯水＝9：1，含10mmol/L乙酸铵；AB相均用氨水调整至pH 9。样品盘温度：8℃，进样体积：1μL。

[0085] 本发明使用装备IonDrive Turbo V ESI离子源的SCIEX 6500QTRAP+三重四极杆质谱仪，以多反应监测(MRM)模式进行质谱分析。离子源参数如下：Curtain Gas＝35psi,IonSpray Voltage＝+5000V/‑4500V,Temperature＝400℃,Ion Source Gas 1＝50psi,Ion Source Gas 2＝50psi。

[0086] 本发明中所有质谱数据采集及目标化合物定量分析工作均通过SCIEX AnalystWork Station Software(1.7.2)完成。

[0087] 4)数据处理

[0088] 样品最终测得浓度CF(Final Concentration,μmol/L)为仪器直接测得浓度CC(Calculated Concentration,μmol/L)乘以稀释因子Dil(Dilution Factor)，单位为μmol/L；样品中目标代谢物浓度CM(Metabolite Concentration,nmol/g)等于样品最终测得浓度CF乘以样品最终体积VF(Volume,μL)和样品在前处理过程中的浓缩系数CF，除以样本质量MS(Weight,mg)，单位为nmol/g：

[0089] 计算公式：

[0090] 3.2亲脂性代谢物提取及检测

[0091] 1)样本预处理

[0092] ①取样本于2mL EP管中，加入1mL纯水，涡旋10s；

[0093] ②加入钢珠，40Hz研磨仪处理4min，超声5min(冰水浴)，重复3次；

[0094] ③将样本4℃离心，5000rpm离心20min；

[0095] ④移取0.8mL上清液于2mL EP管中；

[0096] ⑤加入0.1mL 50％H2SO4，加入0.8mL提取液(含内标2‑甲基戊酸，25mg/L，甲基叔丁基醚)，涡旋10s，振荡10min，超声10min(冰水浴)

[0097] ⑥在将样本4℃离心，10000rpm离心15min；

[0098] ⑦‑20℃静置30min；

[0099] ⑧取出上清于进样瓶中，GC‑MS检测。

[0100] 2)上机检测

[0101] 岛津GC2030‑QP2020 NX气相色谱质谱联用仪配有Agilent HP‑FFAP毛细管(30m×250μm×0.25μm,J&W Scientific,Folsom,CA,USA)，GC‑MS具体分析条件如下：

[0102] 仪器参数：

[0103]

[0104]

[0105] 3)标准曲线

[0106] 保留时间指数表：

[0107]

[0108] 4)计算公式：

[0109] C(con)：样本中目标化合物的含量，μg/gCs：提取液中目标化合物浓度，mg/L[0110] V1：加入提取液溶液体积，mL

[0111] V2：取出纯水上清液体积，mL

[0112] V3：加入纯水体积，mL

[0113] M：称样量，mg

[0114] 4.潜在生物标志物筛选

[0115] 4.1多元变量统计分析

[0116] 将数据矩阵中的代谢物绝对定量数据导入SIMCA 14.1软件，进行帕莱托换算(Pareto scaling)以对数据进行标准化处理，消除变量间的量纲关系。采用正交偏最小二乘判别分析(OPLS‑DA)过滤与模型分类不相关信号及正交信号，获得OPLS‑DA模型。并进一步对模型的质量行交叉检验(Cross‑validation，CV)及排列实验(Permutation Test)以验证模型的有效性。

[0117] 4.2代谢标志物筛选

[0118] 潜在标志物根据模型的变量重要性投影值(VIP值)、组间代谢物统计学差异(校正P值<0.05)进行筛选。用SPSS 26.0进行非参数检验和受试者工作曲线(ROC)分析，结合模式识别与机器学习方法，抽提出对分类有贡献的代谢物，并确定其敏感性、特异性，结合NMR代谢组学与MS靶向绝对定量验证结果，构建早期食管鳞癌靶向代谢诊断模型。

[0119] 二、实验结果

[0120] 本次NMR代谢组与MS靶向代谢绝对定量结果相互印证，结合机器学习之支持向量机(SVM)、随机森林(RF)等方法，构建早期食管鳞癌靶向代谢诊断模型。

[0121] 早期食管鳞癌诊断模型代谢标志物包括L‑Glutamic acid(谷氨酸)、L‑Proline(脯氨酸)、3‑Hydroxyglutaric acid(3‑羟基戊二酸)、4‑(Trimethylammonio)butanoate(丁基甜菜碱)、D‑Alanyl‑D‑alanine(D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸)中的一种或几种组合，或代谢物两两比值。每个代谢物的表达差异如图1‑5所示、3‑Hydroxyglutaric acid(3‑羟基戊二酸)、4‑(Trimethylammonio)butanoate(丁基甜菜碱)、D‑Alanyl‑D‑alanine(D‑丙氨酰‑D‑丙氨酸)的诊断效能数据如图6‑8所示，该代谢物组联合诊断早期食管鳞癌的训练集、验证集(Hold‑out data)诊断效能如图9，该代谢物组联合诊断食管鳞癌的诊断效果优于单个代谢物。

[0122] 尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公开的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部范围由所附权利要求及其任何等同物给出。