一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法

摘要

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法。包括以下步骤：S1：提取猪淋巴细胞总RNA并合成cDNA，并以所述cDNA为模板，扩增组装ScFv的基因Vκ/Vλ‑linker‑VH；S2：通过同源重组反应将ScFv的基因插入到噬菌粒中，转化感受态细胞，培养、分离纯化噬菌体，获得VH‑Vκ与VH‑Vλ免疫库；S3：筛选免疫库中的特异性抗体，获得目标ScFv；S4：对S3筛选到的目标ScFv进行ELISA鉴定，获得噬菌体阳性单克隆；S5：对S4的噬菌体阳性单克隆进行表达、验证。本发明通过构建噬菌体抗体库，筛选出了具有生物活性强、结合抗原能力强的抗ASFV单链抗体。

权利要求

1.一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体，其特征在于，所述抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体，其特征在于，所述单链抗体的制备方法，包括以下步骤：S1：提取猪淋巴细胞总RNA并合成cDNA，并以所述cDNA为模板，扩增组装ScFv的基因Vκ/Vλ‑linker‑VH；

S2：通过同源重组反应将ScFv的基因插入到噬菌粒中，转化感受态细胞，培养、分离纯化噬菌体，获得VH‑Vκ与VH‑Vλ免疫库；

S3：筛选免疫库中的特异性单链抗体，获得目标ScFv；

S4：对S3筛选到的目标ScFv进行ELISA鉴定，获得噬菌体阳性单克隆；

S5：对S4的噬菌体阳性单克隆进行表达、验证。

3.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体，其特征在于，S1中，以猪淋巴细胞来源的cDNA为模板，采用巢式PCR方法，扩增得到ScFv的基因序列。

4.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体，其特征在于，S2中，所述噬菌粒采用pComb载体，在感受态细胞培养时，待菌液OD600=0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，37℃感染30min后，继续摇菌1 h，去除培养基，等体积换成含有终浓度100μg/mL +Amp、50μg/mL Kana和0.1 mmol/mL IPTG的培养基，摇菌6 h，离心收集上清，利用PEG8000/NaCl沉淀法分离纯化噬菌体，获得免疫库。

5.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体，其特征在于，S3中采用固相筛选的方式，以ASFV的p30与p72为抗原进行特异性抗体的筛选。

6.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体，其特征在于，S4具体为：使用富集噬菌体感染宿主菌，涂布抗性平板，并随机挑取96个单克隆/库进行培养，收集过夜培养物上清，通过Phage ELISA实验鉴定噬菌体阳性单克隆。

7.根据权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体，其特征在于，S5具体为：将ELISA鉴定筛选的目的ScFv的基因通过5’HindIII和3’ EcoRI克隆至载体pcDNA3.1（+），然后将重组质粒转染293T细胞；将转染混合物缓慢加入到培养细胞的细胞瓶中，37℃ 

5% CO2培养箱培养至36h，收集上清进行Protein A/G亲和层析纯化抗体；然后对纯化抗体进行表达验证和活性验证。

8.编码权利要求1所述的一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的基因。

9.含有权利要求8所述基因的重组表达载体。

10.含有权利要求9所述重组表达载体的宿主细胞。

说明书

一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法。

背景技术

[0002] 非洲猪瘟(ASF)是由非洲猪瘟病毒(ASFV)引起的一种感染家猪和各种野猪的急性、出血性、高度接触性的烈性传染病，又称为非洲猪瘟疫或疣猪病。非洲猪瘟病毒可以感染不同年龄段的所有猪群，急性症状最为常见，3～10天致死，死亡率可以达到100％。该病的临床症状主要表现为发热、出血以及皮肤发绀，甚至出现血块。病理剖检后通常可见脾脏异常肿大和淤血，淋巴结、肝脏和肾脏出血，这些临床症状与古典猪瘟、蓝耳病、伪狂犬病等很难区分，因此一般通过实验室手段进行非洲猪瘟的诊断和确诊。目前非洲猪瘟尚且没有有效安全的商品化疫苗，国际上主要通过病原学和血清学方法进行非洲猪瘟的诊断。高致病性非洲猪瘟病毒基因II型自2018年8月传入我国以来，对我国的养猪业造成巨大的影响，我国非洲猪瘟病毒的诊断方法主要是针对分子病原的检测。目前，我国部分省份已经出现低致死率的非洲猪瘟基因II型自然变异流行株和I型非洲猪瘟病毒，临床表现具有一定的隐蔽性。因此，血清学检测诊断方法就显得尤为重要，而作为核心原材料的抗体对于整个血清学检测系统有着至关重要的作用。

[0003] 相比传统的单克隆抗体技术，抗体库技术具有库容量大、筛选种类多、更易获得针对特定抗原表位的高活性单克隆抗体，同时筛选过程更为省时、省力、高效和经济。而通过噬菌体展示技术筛选的小分子抗体因其分子量小，穿透性强，免疫原性低，成为基因工程抗体家族的主要成员，这就包括保留分子完整抗原结合位点的最小功能片段的单链抗体(ScFv)。它是将扩增的重链可变区基因(VH)与轻链可变区基因(VL)通过一段柔性的连接肽(linker)序列连接而成，相对分子质量约为27kDa，仅为完整抗体的六分之一。单链抗体因其较强穿透性，易透过血管壁与靶细胞。ScFv由于缺失Fc段的特性，使之不与非靶细胞结合，免疫原性低，有利于作为药物的导向载体而应用于临床靶向治疗，并且ScFv无需糖基化修饰即可形成有功能的抗体，因而可在原核表达系统中广泛表达且容易获得。ScFv作为一种人工合成的抗体，易于进行分子改造，可直接对靶细胞产生杀伤作用。此外，与传统单克隆抗体鼠源性强的特点，ScFv消除了抗体应用上的异源性反应，拓宽了抗体的应用范围。凭借ScFv的特性及与传统抗体相比的优势，ScFv将在疾病的治疗与诊断中发挥重大作用。

发明内容

[0004] 本发明通过构建噬菌体抗体库，筛选出了具有生物活性强、结合抗原能力强的抗ASFV单链抗体，对于ASFV血清学临床诊断方法的建立以及疫病的防控具有重要意义。

[0005] 本发明具体采用以下技术方案：

[0006] 一种抗非洲猪瘟病毒特异性单链抗体的制备方法，包括以下步骤：

[0007] S1：提取猪淋巴细胞总RNA并合成cDNA，并以所述cDNA为模板，扩增组装ScFv的基因VL(Vκ、Vλ)‑linker‑VH。

[0008] 本发明中以猪淋巴细胞来源的cDNA为模板，采用巢式PCR方法，扩增得到ScFv的基因序列，具体的，第一步扩增较长的可变区与部分恒定区；第二步是以第一步PCR扩增粗产物为模板，进行重链可变区(VH)及轻链可变区(Vκ、Vλ)的扩增；然后通过SOE‑PCR方法将重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL(Vκ、Vλ)组装成ScFv基因，形成VL‑linker‑VH。

[0009] S2：通过同源重组反应将ScFv的基因插入到噬菌粒中，转化感受态细胞，培养、分离纯化噬菌体，获得VH‑Vκ与VH‑Vλ免疫库。

[0010] 所述噬菌粒可具体采用pComb载体。

[0011] 在感受态细胞培养时，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，37℃感染+30min后，继续摇菌1h，去除培养基，等体积换成含有终浓度Amp (100μg/mL)、Kana(50μg/mL)和IPTG(0.1mmol/mL)的培养基，摇菌6h。离心收集上清，利用PEG8000/NaCl沉淀法分离纯化噬菌体，获得免疫库。

[0012] S3：筛选免疫库中的特异性单链抗体，获得目标ScFv。目标ScFv的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，具体如下：

[0013] EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFNFRRYVMTWVRQAPGKGLEWLATISSSGGATYYADSVKGRFTISRDNSRNTAYLQMNGLRAGDTARYYCAGGFWLVPRIWGRGVEVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIVLTQTPLSLSVSPGEPASISCRSSQSLEEYGGNLLSWYQQKPGQSPQLLIYGGTNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDAGVYYCQHYKESPNGFGAGTKLEIK。

[0014] 本步骤可采用使用固相筛选的方式进行特异性单链抗体的筛选。

[0015] S4：对S3筛选到的目标ScFv进行ELISA鉴定，获得噬菌体阳性单克隆。

[0016] 具体的，使用富集噬菌体感染宿主菌，涂布抗性平板，并随机挑取96个单克隆/库进行培养，收集过夜培养物上清，通过Phage ELISA实验鉴定噬菌体阳性单克隆。

[0017] S5：对S4的噬菌体阳性单克隆进行表达、验证。

[0018] 具体如下：将ELISA鉴定筛选的目的ScFv的基因通过5’HindIII和3’EcoRI克隆至载体pcDNA3.1(+)，然后将重组质粒转染293T细胞。将以上转染混合物缓慢加入到培养细胞的细胞瓶中，37℃5％ CO2培养箱培养至36h，收集上清进行Protein A/G亲和层析纯化抗体。然后对纯化抗体进行表达验证，具体采用Western Blot试验验证、间接免疫荧光试验验证，并对抗体活性进行验证。

[0019] 本发明的有益效果为：

[0020] 本发明通过分离ASFV免疫耐过猪抗凝血的淋巴细胞，提取淋巴细胞总RNA，反转录合成cDNA后通过巢式PCR扩增单链抗体并构建噬菌体抗体库，通过噬菌体阳性单克隆ELISA筛选出多条具有与非洲猪瘟病毒抗原具有反应的菌株并对单克隆测序获得序列，最后对该序列连接载体后真核表达其相应抗体(命名为B21抗体)，通过ProteinA/G进行纯化后验证表明B21抗体与非洲猪瘟病毒p72具有较强的反应性，表明了B21抗体是ASFVp72蛋白的单克隆抗体，B21抗体将作为新型原料在ASFV的检测诊断以及中发挥重要作用。

附图说明

[0021] 图1为(a)第一步PCR扩增结果；M：5000bp DNA Marker；1：VH片段；2～5：Vκ片段；6～12：Vλ片段。(b)第二步PCR扩增结果；M：5000bp DNA Marker；Vκ‑1、Vκ‑2：Vκ片段。(c)ScFv的融合；M：2000bp DNA Marker。

[0022] 图2为真核表达的B21抗体的SDS‑PAGE图。M：170KDa；Mock：PBS。

[0023] 图3为真核表达的B21抗体的间接免疫荧光试验验证图。

[0024] 图4为不同浓度B21抗体与ASFV灭活抗原反应性的验证。

[0025] 图5为不同浓度p72蛋白与B21抗体反应性的验证。

具体实施方式

[0026] 下面通过具体实施方式对本发明进行更加详细的说明，以便于对本发明技术方案的理解，但并不用于对本发明保护范围的限制。

[0027] 实施例1抗非洲猪瘟病毒ScFv抗体的制备

[0028] 1材料

[0029] 1.1试验动物

[0030] 一头非洲猪瘟病毒免疫耐过猪(5个月大，来自河南新乡某猪场)。

[0031] 1.2菌株和试剂

[0032] LTS1110猪外周血淋巴细胞分离试剂盒购自天津灏洋生物制品公司；E.coli JM109感受态、 HS DNA Polymerase、RNase‑free Water、DL2,000DNA Marker、6×Loading Buffer均购自宝生物公司；BL21(DE3)感受态购自北京全式金；Trizol、镍亲和层析树脂、DNA片段回收试剂盒和质粒提取试剂盒为OMEGA产品；分子生物学试剂来自Sigma公司。

[0033] 2方法

[0034] 2.1建库前样本的处理

[0035] 2.1.1淋巴细胞分离

[0036] 采用LTS1110猪外周血淋巴细胞分离试剂盒进行淋巴细胞的分离，具体如下：

[0037] 颈静脉采集非洲猪瘟病毒免疫耐过猪抗凝血，加入等量全血稀释液混匀，以体积比为3:4的比例先加入淋巴细胞分离液，之后慢慢加入稀释好的抗凝血，1000g室温离心20min。小心收集淋巴细胞层于新的收集管，加入10mL细胞洗涤液稀释混匀，800g室温离心
10min，弃上清后再次加入10mL洗涤液稀释混匀，800g室温离心10min后弃上清，沉淀即为分离到的淋巴细胞，取悬浮细胞上清液计数后并悬浮于RNA保存液中，置‑70℃保存备用。

[0038] 2.1.2淋巴细胞总RNA的提取

[0039] 吸取上述淋巴细胞液400μl，加入1mL TRizol，混匀，4℃静置5min；加入250μl三氯甲烷，混匀，4℃静置10min，12000r/min，4℃，离心15min；吸取450μl上清，加等量异丙醇，‑20℃静置30min，12000r/min，4℃，离心15min；轻弃上清，沉淀加1mL 75％乙醇，12000r/min，4℃，离心5min；沉淀置通风橱10min使之干燥；25μl无RNA酶的水溶解的沉淀即为收获的总mRNA。

[0040] 2.1.3 cDNA的合成

[0041] 在0.2mL的PCR管中依次加入以下组份：

[0042] 试剂材料 体积DEPC水 4.5μL
5×First strand Buffer 4μL
DTT(0.1M) 2μL
Oligo(dT) 1μL
RRI 1μL
dATP 1μL
Radom primers 0.5μL
M‑MLV逆转录(200u/ul) 1μL
mRNA 5μL
总体积 20μL

[0043] 混匀后，将PCR扩增管放置于PCR仪，反应程序为：25℃10min，37℃60min，72℃15min。得到的产物即为全基因组cDNA，置‑20℃保存备用。

[0044] 2.2免疫抗体库的构建

[0045] 2.2.1ScFv的扩增

[0046] 通过巢氏PCR方法，分两步分别扩增猪PBMC来源cDNA的VH、Vκ及Vλ。

[0047] 第一步先扩增较长的可变区与部分恒定区，其引物如下所示：

[0048]

[0049] 以第一步PCR扩增粗产物为模板，进行第二步重链可变区(VH)及轻链可变区(Vκ、Vλ)的扩增，其中VH有12对引物，Vκ有20对引物，Vλ有16对引物，第二步PCR扩增引物如下所示：

[0050]

[0051]

[0052]

[0053] 两步法巢式PCR扩增程序分别为①：98℃2min，98℃10s、52℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min；将扩增产物电泳，纯化收集300bp左右的产物，即为所扩增目的产物；②：98℃2min，98℃10s、54℃5s、72℃30s、30个循环，72℃10min。将扩增产物进行核酸电泳，纯化回收300bp左右的产物，即为所扩增目的产物。通过SOE‑PCR方法将重链可变区基因VH和轻链可变区基因VL(Vκ、Vλ)组装成ScFv基因，形成VL‑linker‑VH。

[0054] 2.2.2 ScFv与pComb载体的连接及抗体文库的构建

[0055] 将PCR产物进行胶回收纯化，通过同源重组反应将ScFv片段插入到噬菌粒pComb3MQ‑P3/WT中，将噬菌粒在2.5kV、800Ω的条件下电击转化感受态细胞。电击后加入
1mL的SOC培养基重悬，并转移到50mL离心管中，37℃、220r/min振荡培养1h，用100μL的菌液进行梯度稀释，选择适宜稀释度滴涂平板，统计抗性平板上的单克隆数目并据此计算抗体库的库容，并随机挑取12个克隆，通过单克隆PCR鉴定重组效率。剩余菌液进行扩大培养，待菌液OD600＝0.5时，加入辅助噬菌体M13K07，37℃感染30min后，继续摇菌1h，去除培养基，等体积换成含有终浓度Amp+(100μg/mL)、Kana(50μg/mL)和IPTG(0.1mmol/mL)的培养基，摇菌
6h。离心收集上清，利用PEG8000/NaCl沉淀法分离纯化噬菌体，获得免疫库。调整噬菌体浓度，分装冻存于‑80℃备用。

[0056] 2.3噬菌体抗体展示文库的筛选

[0057] 使用固相筛选的方式进行特异性抗体的筛选，具体方法如下：

[0058] (1)将p72和p30蛋白的抗原加入96孔板，100μL/孔，同时设置等孔数的对照孔，100μL/孔，4℃包被过夜。

[0059] (2)弃去96孔板里的包被液，每孔加入200μl的0.5％ BSA封闭液，室温下，在振荡器上孵育1.5h。

[0060] (3)弃去封闭液，用200μl PBST清洗4次后，往抗原孔和对照孔中加入100μl的噬菌体抗体库，室温下孵育2h。

[0061] (4)弃除抗体库液体，每孔加入200μl PBST，清洗10次。

[0062] (5)加入100mM HCl，100μl/孔，室温孵育5min，合并收集至一洁净EP管中。

[0063] (6)将上步获得的噬菌体加入到10倍体积的TG1菌中，37℃，200rpm，孵育20min。

[0064] (7)取20μl菌液进行10倍比连续梯度稀释，在含有Carb抗性的LB固体平板上进行10
滴定，置于37℃孵育过夜。剩余菌液中加入辅助噬菌体(保证终浓度为10 phage/ml)，37℃，
200rpm，孵育1h。

[0065] (8)将上述菌液转入25倍体积的2YT/Carb/Kan的培养基中，37℃，200rpm，孵育过夜。(9)次日，使用PEG/NaCl沉淀培养物上清中的Phage，使用PBT溶液进行稀释，通过OD268测12
定浓度(OD268＝1.0时，Phage的浓度约为5.0×10 phage/ml)。

[0066] (10)获得的Phage重复以上筛选过程，通过比较抗原孔与对照孔的菌落数判定富集与否。2.4噬菌体阳性单克隆ELISA的鉴定

[0067] 使用富集噬菌体感染宿主菌，涂布抗性平板，并随机挑取96个单克隆/库进行培养，收集过夜培养物上清，通过Phage ELISA实验鉴定阳性单克隆。

[0068] (1)配置2YT/Carb/Kan培养基，并加入辅助噬菌体(终浓度为1010phage/ml)。

[0069] (2)向96深孔板每孔加入450μl上述培养基，在富集后的LB/Carb或LB/Carb/Kan平板上挑取单克隆加入每孔，将96深孔板置于摇床200rpm，37℃，过夜孵育。

[0070] (3)使用包被液将抗原蛋白稀释至适宜浓度，100μl/孔加入ELISA板子，同时使用包被液单独对应包被ELISA板子做为阴性对照，4℃过夜孵育。

[0071] (4)ELISA板子倒扣弃掉上清，每孔加入200μl 0.5％BSA封闭液，室温孵育1.5h。

[0072] (5)取出96孔深孔板，4000r/min，离心10min。

[0073] (6)扣除ELISA板子液体，用PBST清洗3遍，加入50μl的来源于上述96孔深孔板的培养物上清，室温孵育2h。

[0074] (7)使用PBST清洗4遍，加入HRP‑M13抗体100μL，室温孵育1h。

[0075] (8)使用PBST清洗4遍，加入100μl TMB，置于室温或37℃下避光温育10min，观察颜色变化，直至观察到明显的显示反应。

[0076] (9)加入等体积的1M盐酸或硫酸溶液(100μl/孔)终止反应(孔中反应液由蓝色变为黄色)。

[0077] (10)终止反应后30min内，用酶标仪测量450nm处的吸光度值。

[0078] 根据ELISA阳性孔OD值的高低以及与对照孔的差异，选择单克隆进行测序。

[0079] 2.5阳性克隆的表达与验证

[0080] 2.5.1阳性克隆的转染及表达

[0081] 将单克隆ELISA鉴定筛选的目的ScFv B21抗体的基因通过5’HindIII和3’EcoRI克隆至载体pcDNA3.1(+)，然后将pcDNA3.1‑B21质粒根据jetPRIME体外转染试剂盒操作说明转染293T细胞，具体操作：使用T75细胞培养瓶进行293T细胞培养，待到细胞长满60％左右时进行转染。将10μg的pcDNA3.1‑B21质粒加入到500μl的jetPRIME缓冲液中，涡旋混合后再加入20μl的jetPRIME转染试剂，室温孵育10min。将以上转染混合物缓慢加入到培养细胞的细胞瓶中，37℃5％ CO2培养箱培养至36h，收集上清进行Protein A/G亲和层析纯化抗体。

[0082] 2.5.2Western Blot试验验证抗体的表达

[0083] 收集上述转染质粒36h的293T细胞及空细胞对照样品，置于4℃预冷的PBS洗两遍，沿着细胞底壁加入细胞裂解液，使之浸润到整个细胞层，收集细胞裂解后的产物，加入5×SDS‑PAGE Loading Buffer并混匀，每孔上样20μL，同时加入适量蛋白Marker作为参照，进行SDS‑PAGE电泳。转膜封闭后，加入HRP标记的山羊抗猪IgG H&L(ab6915)(1:5000)孵育1h，加入显色液，利用ODYSSEY近红外荧光扫描成像系统进行扫膜拍照。

[0084] 2.5.3间接免疫荧光试验验证抗体的表达

[0085] 细胞培养皿培养293T单层细胞，使用jetPRIME转染试剂盒转染pcDNA3.1‑B21质粒，37℃5％ CO2培养箱培养至36h，收集细胞，加入1mL 4％多聚甲醛室温固定30min，加入1mL 1×PBS室温轻摇洗涤5min，共洗涤3次，加入1mL 0.1％ Triton‑100室温透膜15min，吸去透膜液，加入1mL 1×PBS室温轻摇洗涤5min，共洗涤3次；加入1mL 5％ Blocker BSA室温封闭15min，弃去封闭液；加入FITC标记的山羊抗猪IgG H&L(ab6911)(1:500)于室温避光孵育1h，1mL 1×PBS洗涤三次，加入300μL DAPI(1:10000)染核10min，1mL1×PBS洗涤三次，上镜观察。

[0086] 2.6ELISA验证ScFv的抗体活性

[0087] 取ASFV灭活抗原1:2包被检测板，4℃孵育12h，封闭完成后，加入1μg的B21抗体蛋白稀释液，37℃孵育30min，PBST洗涤液洗涤4次，拍干，加入50μL 1：5000稀释的兔抗猪HIS‑HRP抗体，37℃孵育30min，PBST洗涤液洗涤4次，加入50μL TMB底物溶液，37℃下避光温育10min，加入50μL硫酸终止液，用酶标仪测量450nm处的吸光度值。

[0088] 取纯化的B21 ScFv抗体(0.2mg/mL)，按照500μg/孔的比例包被检测板，包被完成后加入50μL灭活非洲猪瘟病毒抗原，37℃孵育30min，PBST洗涤液洗涤4次，拍干，然后加入50μL 1：15000稀释的p72单抗，37℃孵育30min，PBST洗涤液洗涤4次，加入50μLTMB底物溶液，37℃下避光温育10min，加入50μL硫酸终止液，用酶标仪测量450nm处的吸光度值。

[0089] 3结果

[0090] 3.1巢式PCR扩增可变区

[0091] 以获得的淋巴细胞cDNA为模板，通过巢式PCR方法，使用多对引物分两步分别扩增VH、Vκ及Vλ，结果如图1a和图1b所示。此外，为最大限度的保证抗体多样性，将VH及Vκ、Vλ分别进行配伍形成ScFv的融合VL‑linker‑VH(图1c)。

[0092] 3.2抗体文库的构建及抗体的筛选

[0093] 3.2.1抗体文库的构建

[0094] 将ScFv与线性化的噬菌体质粒pComb3MQ‑P3/WT进行同源重组反应，电转超级感受态细胞，取适量活化后的菌液进行梯度稀释并选择适宜的稀释度滴涂平板，抗性平板上的单克隆数目经统计如表1所示。并从抗性平板中各随机挑取12个克隆，通过单克隆PCR鉴定VH‑Vκ与VH‑Vλ的重组效率分别为11/12和10/12。结果显示两个免疫库的库容均达到N×8
10，重组效率较高(≥80％)，完全满足高质量免疫库的相关指标。

[0095] 表1：免疫库相关指标统计

[0096] 组别 LB/Tet10(细菌数) LB/Carb50/Kan25(阳性克隆数＝库容) 重组效率10 8
VH‑Vκ(HK) 9.68×10 1.17×10 11/12
VH‑Vλ(Hλ) 1.03×1011 1.23×108 10/12

[0097] 3.2.2抗体筛选

[0098] 使用VH‑Vκ与VH‑Vλ两个抗体库分别对ASFV的p30与p72抗原进行固相筛选，筛选进行到第三轮时，VH‑Vκ与VH‑Vλ抗体库对p72抗原均出现明显富集现象，并在第四轮得到进一步确认。使用第三轮对应的富集噬菌体感染宿主菌，涂布抗性平板，VH‑Vκ与VH‑Vλ各随机挑取48个单克隆进行培养，收集过夜培养物上清，通过单克隆Phage ELISA实验鉴定阳性单克隆。根据阳性孔OD值的高低以及阳性/阴性的比值(≥3)，共选择10个单克隆进行测序，经测序结果显示具有完整ScFv阳性克隆1条(B21)，其氨基酸序列如下：

[0099] EVKLVESGGGLVQPGGSLRLSCVGSGFNFRRYVMTWVRQAPGKGLEWLATISSSGGATYYADSVKGRFTISRDNSRNTAYLQMNGLRAGDTARYYCAGGFWLVPRIWGRGVEVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSAIVLTQTPLSLSVSPGEPASISCRSSQSLEEYGGNLLSWYQQKPG

[0100] QSPQLLIYGGTNRASGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDAGVYYCQHYKESPNGFGAGTKLEIK。

[0101] 3.3B21抗体真核表达的验证

[0102] 将B21抗体的DNA序列连接pcDNA3.1载体后，转染至293T细胞，36h后收集细胞裂解处理后进行SDS‑PAGE，以未转染质粒的293T细胞作为空白对照，使用HRP标记的山羊抗猪IgG进行WB验证，结果显示，在28k Da处出现1条特异性反应带，而空白细胞没有出现条带，如图2所示。

[0103] 同时，间接免疫荧光试验结果显示转染pcDNA3.1‑B21质粒的细胞出现荧光，如图3所示。

[0104] 3.4B21单链抗体反应活性的验证

[0105] 为了验证B21单链抗体与ASFV的结合活性，分别以灭活的ASFV全病毒抗原和ProteinA/G纯化浓缩的B21抗体(0.2mg/ml)为包被底物进行反应活性的鉴定。结果表明包被ASFV全病毒灭活抗原，加入不同浓度B21抗体孵育，使用500ng及以上的B21抗体具有与ASFV很强的反应性，当B21的浓度降低到250ng以下时，反应性显著降低。此外，将B21抗体以
250ng/孔包被ELISA板，加入不同浓度ASFV p72蛋白孵育，结果表明使用62.5ng及以上的蛋白浓度具有与ASFV p72较强的反应性，当p72浓度降低到31.25ng以下时，反应性显著降低，综上，本发明使用噬菌体单链抗体库筛选的B21抗体是针对ASFVp72的单链抗体。

[0106] 以上所述之实施例，只是本发明的较佳实施例而已，并非限制本发明的实施范围，故凡依本发明专利范围所述的构造、特征及原理所做的等效变化或修饰，均应包括于本发明申请专利范围内。