一种抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽及其制备方法

摘要

本发明涉及牡丹肽技术领域，具体涉及一种抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽及其制备方法。该牡丹肽，选自如SEQ ID NO.1～2任一所述的肽。该牡丹肽1～2能够阻止H2O2诱导线粒体产生ROS，减缓H2O2诱导的糖原和ATP下降，改善细胞线粒体膜电位和分支长度受到的损伤，从而提示本发明提供的肽1～2具有明显抵抗疲劳作用，具有应用于抗疲劳领域的应用前景。

权利要求

1.抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽，选自如SEQ ID NO.1 2任一所述的肽。

~

2.抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽胶囊，其包含如SEQ ID NO.1 2任一所述的肽。

~

3.权利要求1所述的牡丹肽的制备方法，其特征在于，包括：制备凤丹叶提取粗品；

根据所述凤丹叶粗品制备牡丹蛋白品；

将所述牡丹蛋白品分别进行胃蛋白酶解、胰蛋白酶酶解和蜗牛酶酶解的步骤，得到酶解液，从所述酶解液中分离得到所述牡丹肽。

4.根据权利要求3所述的制备方法，其特征在于，“根据所述凤丹叶粗品制备牡丹蛋白品”的步骤包括：将所述凤丹叶粗品用PVPP和二氧化碳的混合物于液氮预冷的研钵中研磨成粉末；

将所述粉末加入BPP提取缓冲液中震荡提取，进行第一离心；

取所述第一离心的上清液与BPP提取缓冲液混合震荡提取，进行第二离心；

取所述第二离心的上清液与预冷的15%的聚丙烯酰胺水溶液混合，‑20℃冰箱中沉淀

12h以上，进行第三离心；

取所述第三离心的沉淀物加入植物蛋白提取裂解液，放置于22℃恒温裂解2h以上，冷冻干燥，即可得到所述牡丹蛋白品。

5.根据权利要求4所述的制备方法，其特征在于，“胃蛋白酶酶解”的步骤包括：将所述牡丹蛋白品混入至10倍重量的去离子水中，匀浆，调节pH至2.0，加入所述牡丹蛋白品重量1%的胃蛋白酶，于37℃酶解2h；迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液4000rpm离心10min，取上清液。

6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，“胰蛋白酶酶解”的步骤包括：将权利要求5所得的上清液用0.05M的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，加入牡丹蛋白品重量1%的胰蛋白酶，于40℃酶解4h后，迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液

4000rpm离心10min，取上清液，滤纸滤过，微滤，滤液浓缩后，冷冻干燥。

7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，“蜗牛酶酶解”的步骤包括：将权利要求6所得的冻干品混入至10倍质量的去离子水中，1000rpm匀浆1min后，用

0.05M的盐酸溶液调节pH至6.2，加入牡丹蛋白品质量2.6%的蜗牛酶，于49℃酶解28h，迅速放入100℃水浴10min，使酶失活；所得酶解液8000rpm离心20min，上清液经0.45μm滤膜微滤后，收集滤液，依次过5kD、3kD和1kD的超滤膜，收集5kD 3kD、3kD 1kD和1kD的3个部分的滤~ ~液，进行浓缩，冷冻干燥，即得不同分子量段的牡丹肽。

8.权利要求2所述的牡丹肽胶囊的制备方法，其特征在于，包括：分别用pH为7.0的Tris‑HCl缓冲液配制权利要求2所述的牡丹肽溶液；

分别取所述牡丹肽溶液溶液100mL，与40mg/mL的海藻酸钠溶液混合，40℃、120rpm震荡水浴20min后，用5mL注射器吸取5mL混合溶液，滴入100mL、3.5mg/mL的氯化钙溶液中，恒温固化30min，固化结束后抽滤，沉淀置于45℃烘箱烘干，即为牡丹肽胶囊。

9.权利要求1所述的牡丹肽在制备抗氧化抗疲劳的固体饮料及制剂中的应用。

说明书

一种抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及牡丹肽技术领域，具体涉及一种抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽及其制备方法。

背景技术

[0002] 牡丹芍药科芍药属植物，素有“百花之王”的美称。作为国花，牡丹已在中国栽培了1500多年，具有极其重要的观赏价值。随着牡丹栽培面积的扩大，不仅在菏泽、洛阳、亳州等地区种植，如今已广泛遍布于中国各地。牡丹除观赏、食用价值外，还具有活血化瘀和清热凉血等药用功效，于中国古代发现医学记载数十处。油用牡丹作为新兴的木本油料作物之一在我国被大力的推广和种植，截止2019年全国种植面积达230多万亩。其中，凤丹(Paeonia ostii“Feng Dan”)是油用牡丹品种中种植面积最广且油脂品质最好的品种。

[0003] 牡丹籽多肽是牡丹籽蛋白酶解后的产物。研究表明，牡丹籽多肽具有抗氧化、降血压和降血糖等生物活性，在功能性产品开发及食品营养添加剂中具有重要的应用价值。牡丹籽多肽物能够作为牡丹籽蛋白的替代品，拥有更好的功能特性。然而，现有技术仅仅对牡丹籽多肽进行开发，对该材料的资源开放不够全面。

发明内容

[0004] 有鉴于此，通过对牡丹的一个品种，凤丹叶进行充分开发，提供了一种一种抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽及其制备方法。

[0005] 本发明的目的是提供一种抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽，选自如SEQ ID NO.1～3任一所述的肽。

[0006] 本发明的目的是还提供抗疲劳抗氧化功效的牡丹肽胶囊，其包含如SEQ ID NO.1～3任一所述的肽。

[0007] 本发明的目的是还所述的牡丹肽的制备方法，包括：

[0008] 制备凤丹叶提取粗品；

[0009] 根据所述凤丹叶粗品制备牡丹蛋白品；

[0010] 将所述牡丹蛋白品分别进行胃蛋白酶解、胰蛋白酶酶解和蜗牛酶酶解的步骤，得到酶解液，从所述酶解液中分离得到所述牡丹肽。

[0011] 进一步地，“根据所述凤丹叶粗品制备牡丹蛋白品”的步骤包括：

[0012] 将所述凤丹叶粗品用PVPP和二氧化碳的混合物于液氮预冷的研钵中研磨成粉末；

[0013] 将所述粉末加入BPP提取缓冲液中震荡提取，进行第一离心；

[0014] 取所述第一离心的上清液与BPP提取缓冲液混合震荡提取，进行第二离心；

[0015] 取所述第二离心的上清液与预冷的15％的聚丙烯酰胺水溶液混合，‑20℃冰箱中沉淀12h以上，进行第三离心；

[0016] 取所述第三离心的沉淀物加入植物蛋白提取裂解液，放置于22℃恒温裂解2h以上，冷冻干燥，即可得到所述牡丹蛋白品。

[0017] 进一步地，“胃蛋白酶酶解”的步骤包括：

[0018] 将所述牡丹蛋白品混入至10倍重量的去离子水中，匀浆，调节pH至2.0，加入所述牡丹蛋白品重量1％的胃蛋白酶，于37℃酶解2h；迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液4000rpm离心10min，取上清液。

[0019] 进一步地，“胰蛋白酶酶解”的步骤包括：

[0020] 将权利要求5所得的上清液用0.05M的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，加入牡丹蛋白品重量1％的胰蛋白酶，于40℃酶解4h后，迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液4000rpm离心10min，取上清液，滤纸滤过，微滤，滤液浓缩后，冷冻干燥。

[0021] 进一步地，“蜗牛酶酶解”的步骤包括：

[0022] 将权利要求6所得的冻干品混入至10倍质量的去离子水中，1000rpm匀浆1min后，用0.05M的盐酸溶液调节pH至6.2，加入牡丹蛋白品质量2.6％的蜗牛酶，于49℃酶解28h，迅速放入100℃水浴10min，使酶失活；所得酶解液8000rpm离心20min，上清液经0.45μm滤膜微滤后，收集滤液，依次过5kD、3kD和1kD的超滤膜，收集5kD～3kD、3kD～1kD和1kD的3个部分的滤液，适当浓缩，冷冻干燥，即得不同分子量段的牡丹肽。

[0023] 进一步地，包括：

[0024] 分别用pH为7.0的Tris‑HCl缓冲液配制权利要求2所述的牡丹肽溶液；

[0025] 分别取所述牡丹肽溶液溶液100mL，与40mg/mL的海藻酸钠溶液混合，40℃、120rpm震荡水浴20min后，用5mL注射器吸取5mL混合溶液，滴入100mL、3.5mg/mL的氯化钙溶液中，恒温固化30min，固化结束后抽滤，沉淀置于45℃烘箱烘干，即为牡丹肽胶囊。

[0026] 本发明的目的是还所述的牡丹肽在制备抗氧化抗疲劳的固体饮料及制剂中的应用。

[0027] 与现有技术相比，本发明至少具有以下有益效果之一：

[0028] 本发明以凤丹油用牡丹苗叶为原材料，通过预处理和提取步骤，得到其中的初蛋白，再经进一步提取得到其蛋白品，最后经过酶解得到牡丹肽的固体粉末。并且分析得到这些牡丹肽的氨基酸序列。

[0029] 另外，本发明还对这些牡丹肽的固体粉末的溶解性、乳化活性和乳液稳定性进行了研究发现，本发明提供的肽1～3具有更高的溶解性，更好的乳化活性和乳液稳定性。

[0030] 另外，本发明还对这些牡丹肽细胞生物活性进行研究，发现含肽1～5的供试品溶液对C2C12细胞无细胞毒性；肽1～3能够恢复小鼠成肌细胞的体外抗氧化损伤，表明其具有抗氧化性能。肽1～3能够明显阻止H2O2诱导的C2C12细胞糖原和ATP含量下降，并且呈现明显的剂量效应。本发明提供的肽1～3能够提高肌肉的能量代谢，增强机体运动能力。由此表明，本发明提供的肽1～3能够阻止H2O2诱导线粒体产生ROS，减缓H2O2诱导的糖原和ATP下降，改善细胞线粒体膜电位和分支长度受到的损伤，从而提示本发明提供的肽1～3具有明显抵抗疲劳作用，具有应用于抗疲劳领域的应用前景。

[0031] 另外，本发明还将这些牡丹肽的固体粉末制备成牡丹肽胶囊，测试了其在人工胃液和人工肠液中的释放效果。结果发现，肽1～3在牡丹肽胶囊中的释放较为持续，能够持续起到释放作用，这对于将牡丹肽胶囊作为一种抗氧化抗疲劳的制剂在体内持续起到生物活性具有极大的动力学作用。

附图说明

[0032] 图1为肽1～5的溶解性结果图。

[0033] 图2为不同浓度肽1～5的EA1结果图。

[0034] 图3为不同浓度肽1～5的ESI结果图。

[0035] 图4为不同浓度肽1～5以及模型组对C2C12细胞活力结果图。

[0036] 图5为不同浓度肽1～5以及模型组对H2O2诱导的C2C12细胞活力结果图。

[0037] 图6为不同浓度肽1～5以及模型组对H2O2诱导的C2C12细胞内ROS水平结果图。

[0038] 图7为不同浓度肽1～5以及模型组对H2O2诱导的C2C12细胞内糖原含量结果图。

[0039] 图8为不同浓度肽1～5以及模型组对H2O2诱导的C2C12细胞内ATP含量结果图。

[0040] 图9为不同浓度肽1～5以及模型组对H2O2诱导的C2C12细胞内ΔΨm值结果图。

[0041] 图10为不同浓度肽1～5以及模型组对H2O2诱导的C2C12细胞内线粒体分支长度结果图。

[0042] 图11为含肽1～5的牡丹肽胶囊人工胃液中肽释放结果图。

[0043] 图12为含肽1～5的牡丹肽胶囊人工肠液中肽释放结果图。

具体实施方式

[0044] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。本发明中未详细单独说明的试剂均为常规试剂，均可从商业途径获得；未详细特别说明的方法均为常规实验方法，可从现有技术中获知。

[0045] 1、材料来源

[0046] 凤丹油用牡丹苗(Paeonia ostii“Feng Dan”)购自菏泽市润龙航天育种有限公司。

[0047] 2、材料预处理

[0048] 用高速粉碎机粉碎凤丹油用牡丹苗叶，以1:5(m/v)加入正己烷进行脱脂处理。室温下搅拌40min、抽滤，该操作重复两次，合并滤液，减压蒸馏回收正己烷，于室温过夜风干以除去多余的正己烷，4℃保存，即可得到凤丹叶提取粗品。

[0049] 3、牡丹蛋白品

[0050] 实施例1：从凤丹叶提取粗品中提取蛋白的步骤为：

[0051] (1)称量3g凤丹叶提取粗品于用液氮预冷的研钵中，加入0.3g的PVPP(交联聚乙烯基吡咯烷酮，CAS：25249‑54‑1，上海诚裕生物科技有限公司)和0.3g二氧化硅粉末研磨；

[0052] (2)转移到10mL离心管中，加入10mL BPP提取缓冲液充分涡旋震荡10min；再加入10mLTris饱和酚，涡旋10min，16000g、4℃离心15min；

[0053] (3)移取上层清液转移至干净离心管中，加入5mLBPP提取缓冲液，涡旋震荡10min后16000g、4℃离心15min；

[0054] (4)再移取3mL上清液转移至干净离心管中，加入15mL预冷的15％的聚丙烯酰胺水溶液，置于‑20℃冰箱中沉淀12h以上，从冰箱中取出离心管，16000g、4℃离心15min弃去上清液；重复2次转移及离心步骤；

[0055] (5)风干样品(约3h)再加入植物蛋白提取裂解液(尚宝生物)，放置于22℃恒温裂解2h以上；12000g、4℃离心15min后转移上清液于10mL离心管中，冷冻干燥，即可得到牡丹蛋白品。

[0056] 实施例2：上述步骤(1)中加入的PVPP为0.5g，二氧化硅为0.5g；步骤(2)中加入20mLTris饱和酚；其他与实施例1相同。

[0057] 实施例3：上述步骤(4)中加入20mL预冷的15％的聚丙烯酰胺水溶液；其他与实施例1相同。

[0058] 实施例4：上述步骤(4)中加入15mL预冷的17％的聚丙烯酰胺水溶液；其他与实施例1相同。

[0059] 对比例1：准确称取凤丹叶提取粗品50g，加入500mL去离子水混匀后，用1mol/L氢氧化钠调节至pH＝10.5。在室温下连续搅拌4小时后，以5000rpm的速度离心10min并收集上清液。随后用1mol/L盐酸将上清液调至pH为4.0，于4℃静置2h。8000rpm转速下离心10min收集下沉淀，再用1mol/L氢氧化钠调节至中性后冷冻干燥，得牡丹蛋白品。

[0060] 对比例2：上述步骤(1)中加入的PVPP为0.1g，二氧化硅为0.1g；步骤(2)中加入20mLTris饱和酚；其他与实施例1相同。

[0061] 采用Bradford法测定上述实施例1～4和对比例1～2分别值得的牡丹蛋白品的蛋白浓度。结果可知，实施例1～4得到的牡丹蛋白品中蛋白含量分别为16.5％、18.2％、17.4％和21.3％，对比例1～2得到的牡丹蛋白品中蛋白含量分别为3.8％和8.7％，说明实施例1～4能够得到的牡丹蛋白品中蛋白含量更高。

[0062] 上述实施例和对比例中，BPP提取缓冲液包含100mM EDTA、50mM硼砂、50mM维生素C、1％PVPP、1％Triton X‑100、0.1％β‑巯基乙醇、25％蔗糖和10mM tris碱，pH7.8。

[0063] 上述实施例和对比例中，Tris饱和酚的配置步骤包括：冰箱取出重蒸酚，室温放置20min后，68℃水浴溶化；加入8‑羟基喹啉至终浓度为0.1％和β‑巯基乙醇至终浓度为
0.2％，得到的原液中酚浓度为14.4M，混匀，溶液呈现黄色，倒入分液漏斗中(也可在烧杯中进行)；加入等体积的1.0M的pH8.0的Tris溶液，反复混匀后，静至分层；放出下层黄色酚液，弃上层；加固体Tris约1g/100ml酚，摇匀，去水相；加0.1M的pH8.0的Tris溶液平衡数次，至pH为8.0，于棕色瓶中4度保存。

[0064] 4、酶解

[0065] 分别取实施例1～4或对比例1～2任一制得的牡丹蛋白品，加10倍重量的去离子水，1000rpm匀浆1min后，0.05M的盐酸溶液调节pH至2.0，加入牡丹蛋白品重量1％的胃蛋白酶(CAS：9001‑75‑6，纯度：99％，南京松冠生物科技有限公司)，于37℃酶解2h；迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液4000rpm离心10min，取上清液。

[0066] 取上清液用0.05M的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，加入牡丹蛋白品重量1％的胰蛋白酶(CAS：9002‑07‑7，纯度：99％；北京诺其雅盛生物科技有限公司)，于40℃酶解4h后，迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液4000rpm离心10min，取上清液，滤纸滤过，微滤(1.2μm→0.80μm→0.45μm)，滤液浓缩后，冷冻干燥。继续将干燥样品加入至10倍质量的去离子水中，1000rpm匀浆1min后，用0.05M的盐酸溶液调节pH至6.2，加入牡丹蛋白品质量2.6％的蜗牛酶(MB2574，大连美仑生物技术有限公司)，于49℃酶解28h，迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液8000rpm离心20min，上清液经0.45μm滤膜微滤后，收集滤液，依次过5kD、3kD和1kD的超滤膜，收集5kD～3kD、3kD～1kD和1kD的3个部分的滤液，适当浓缩，冷冻干燥(‑50℃，4～5Pa)，即得不同分子量段的牡丹肽，称重，记录并计算总重，以总重为100％。实施例1所得的3个部分牡丹肽质量占比分别为21.5％、36.8％和41.7％。实施例2所得的3个部分牡丹肽质量占比分别为17.2％、32.7％和50.1％。实施例3所得的3个部分牡丹肽质量占比分别为13.9％、30.5％和55.6％。实施例4所得的3个部分牡丹肽质量占比分别为12.6％、29.9％和57.5％。对比例1所得的3个部分牡丹肽质量占比21.4％、35.8％和42.8％。对比例2所得的3个部分牡丹肽质量占比20.6％、33.2％和46.2％。

[0067] 对比例3：取实施例1制得的牡丹蛋白品，加10倍重量的去离子水，1000rpm匀浆1min后，0.05M的盐酸溶液调节pH至2.0，加入底物重量1％的胃蛋白酶(CAS：9001‑75‑6，纯度：99％，南京松冠生物科技有限公司)，于37℃酶解2h；再用，0.05M的氢氧化钠溶液调节pH至8.0，加入底物量1％的胰蛋白酶(CAS：9002‑07‑7，纯度：99％；北京诺其雅盛生物科技有限公司)，于40℃酶解4h后，迅速放入100℃水浴10min，使酶失活。所得酶解液4000rpm离心
10min，取上清液，滤纸滤过，微滤(1.2μm→0.80μm→0.45μm)，依次过5kD、3kD和1kD的超滤膜，收集5kD～3kD和3kD～1kD的2个部分的滤液，适当浓缩，冷冻干燥(‑50℃，4～5Pa)，滤液浓缩后，冷冻干燥。对比例3仅得到的2个部分牡丹肽质量占比89.4％和10.6％。

[0068] 由此可知，实施例1～4和对比例1～2分别得到的牡丹肽中分子量3kD～1kD和1kD的肽组分含量更高，而对比例3得到的牡丹肽并未得到分子量低于1kD的肽组分。

[0069] 5、牡丹肽组分分析

[0070] 使用RP‑HPLC对实施例1～4和对比例1～2分别得到的牡丹肽组分(3kD～1kD和1kDTM的肽组分)进行分离纯化。色谱柱为Syncronis C18 HPLC色谱柱(5.0μm，25×250mm，97105‑
259270XL，Thermo Scientific)，紫外检测器检测波长为214nm，流动相A为含0.1％三氟乙酸(TFA)的超纯水，流动相B为含有0.1％TFA的乙腈。流动相均需通过0.22μm滤膜过滤并且使用超声脱气处理。多肽样品以50mg/mL的浓度进样200μL，洗脱条件为5～60min，5～65％B(梯度洗脱)，流速为5.0mL/min。收集峰尖位置，将所得溶液减压蒸馏后除去有机溶剂，产物冷冻干燥，置于‑80℃以备后续实验。结果实施例1～4和对比例1～2分别提供的3kD～1kD的肽组分在33.6～36.3min出现相同的色谱峰，实施例1～4和对比例1～2分别提供的1kD的肽组分在42.6～44.2min以及43.7～45.6min分别出现相同的色谱峰。对比例3提供的3kD～
1kD的肽组分在37.5～39.3min，1kD的肽组分在46.1～48.3min。

[0071] 选取RP‑HPLC中33.6～36.3min(肽1)、42.6～44.2min(肽2)、43.7～45.6min(肽3)、37.5～39.3min(肽4)和46.1～48.3min(肽5)分别对应的组分进行NanoLC‑ESI‑MS/MS鉴定多肽序列。将肽4～3分别溶解于Nano‑RPLC缓冲液A(含0.1％甲酸的超纯水)中，在C‑18分析柱(2μm,50×150mm)上分离：1min，流动相B(含有0.1％甲酸的乙腈)2％‑8％，23min，8‑
30％B，1min，30‑100％，并在100％B的条件下保持8min。通过配置有纳米喷雾的QExactivePlus系统(ThermoFisher)采集数据，质谱(MS)以阳离子模式进行检测，质量范围：350‑1800m/z，完全MS扫描分辨率设置为70K，高能碰撞解离(HCD)MS/MS扫描分辨率设置为17.5K，动态排除30s，自动增益控制(AGC)目标值为105，质量分辨率为70000，隔离窗口为
1.6m/z。电荷状态≥20个的最强峰被碎片化，归一化碰撞能量为28％。通过Xcalibur2.2(ThermoFisherScientific)检测原始数据。使用PeaksStudio(versionX)软件的denovo模块对NanoLC‑ESI‑MS/MS的数据进行从头测序分析，主要参数设置如下：平均局部置信度(ALC)>90，母体质量误差公差(ParentMassErrorTolerance)。

[0072] 对肽4～5，将质谱原始文件使用Maxquant(1.6.2.10)软件在uniprot(http://www.uniprot.org/)数据库和NCBI数据库中进行肽指纹图谱检索，寻找相关匹配的肽序列。结果可知，肽1的氨基酸序列为NQYTSNVESGSTRTEIKHWVELFFG，如SEQ ID NO.1所示，分子量为2930.166，参考序列为L2核糖体蛋白(叶绿体)[Paeonia ostii]YP_009458360.1。肽2的氨基酸序列为TFRKDIKI，如SEQ ID NO.2所示，1020.238，参考序列为细胞色素C生物发生蛋白(叶绿体)[Paeonia ostii]YP_009458348.1。肽3的氨基酸序列为NSQEHSVV，如SEQ ID NO.3所示，分子量为898.928，参考序列为S12核糖体蛋白(叶绿体)[Paeonia ostii]YP_
009458323.1。肽4的氨基酸序列为THQVPIEIGSTQGKALAIRW，如SEQ ID NO.4所示，分子量为
2205.546，参考序列为S7核糖体蛋白(叶绿体)[Paeonia ostii]YP_009458345.1。肽5的氨基酸序列为GRIVTI，如SEQ ID NO.5所示，分子量为657.82，参考序列为L2核糖体蛋白(叶绿体)[Paeonia ostii]YP_009458361.1。

[0073] 6、肽4～5的理化性能分析

[0074] (1)溶解性

[0075] 准确称取肽4～5的固体冻干样品20mg，分散于100mL用Tris‑HCl缓冲液中，配制成pH3.0、pH5.0、pH7.0和pH9.0以及钠离子强度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mol/L的溶液，30℃下振荡保温30min，3000rpm离心15min，凯氏定氮法测定上清液中的肽含量(C1)，重复3次。溶解度＝C1/C0×100％；式中：C0为短肽样品中蛋白含量/mg，20mg；C1为上清液中蛋白含量/mg。结果如图1所示，肽1在pH3.0、7.0和9.0环境中溶解性较好，肽2在pH3.0、5.0、7.0和9.0环境中溶解性较好，肽3在pH3.0、7.0和9.0环境中溶解性较好，肽4和肽5在不同的pH溶液中的溶解性均不如肽1～3。

[0076] (2)乳化活性及其稳定性

[0077] 用Tris‑HCl缓冲液分别配制含肽1～5的溶液，含肽1的样品pH值为的为9.0，含肽2的样品pH值为9.0，含肽3的样品pH值为9.0，含肽4的样品pH值为9.0，含肽5的样品pH值为9.0。

[0078] 并且，含肽1样品、含肽2样品、含肽3样品、含肽4样品和含肽5样品还分别配制了含钠离子强度为分别为0.2mol/L、0.4mol/L、0.6mol/L、0.8mol/L和1.0mol/L的平行样品。

[0079] 各取上述样品15mL放入50mL烧杯中，加入5mL玉米油后用高速电动均质机10000rpm乳化2min。从底部吸取100μL稀释到5mL的0.1％SDS溶液中，以SDS溶液作空白对照，500nm下测定吸光值(A0)。10min后再次吸取100μL，按步骤测定吸光值(A1)。

[0080] 乳化活性

[0081] 乳液稳定性ESI(min)＝10×A0/(A0－A1)；

[0082] 式中，C为蛋白质水溶液中蛋白浓度，g/mL；L为比色杯光径，cm；A0为起始500nm处吸光值；A1为10min后500nm处吸光值； 为乳化液中油相的比例；N为稀释倍数。

[0083] 图2示出了分别含肽1～5的样品在不同钠离子浓度溶液中的乳化活性EA1。由图2可知，随着钠离子浓度的不断升高，含肽1～5的样品乳化活性不断降低。在同一钠离子浓度的溶液中，含肽1～3的样品乳化活性更高。

[0084] 图3示出了分别含肽1～5的样品在不同钠离子浓度溶液中的乳液稳定性ESI。由图3可知，随着钠离子浓度的不断升高，含肽1～5的样品乳化稳定性不断降低。在同一钠离子浓度的溶液中，含肽1～3的样品乳化稳定性更高。

[0085] 由此可知，本发明提供的肽1～3具有更高的溶解性，更好的乳化活性和乳液稳定性。

[0086] 7、肽1～5的生物活性分析

[0087] 供试品：用Tris‑HCl缓冲液分别配制含肽1～5的溶液，含肽1的样品pH值为的为7.0，含肽2的样品pH值为7.0，含肽3的样品pH值为7.0，含肽4的样品pH值为7.0，含肽5的样品pH值为7.0。配制终浓度分别为0.1mg/mL、0.5mg/mL、1.0mg/mL；对含肽4和肽5的供试品溶液，添加20％v/v的甲醇。

[0088] (1)细胞毒性测定

[0089] 将C2C12细胞(货号：CL‑0044，小鼠成肌细胞，武汉普诺赛生命科技有限公司)以4
10个/孔的密度接种在96孔平底培养皿中，设置5个复孔，加入DMEM培养基(含FBS)并孵育
24h。弃去旧液，用PBS清洗后，向细胞补充0.01～2mg/mL浓度的肽1～5的供试品溶液，孵育
24h后，弃去旧液，用PBS清洗后，每孔中加入10μLCCK‑8，继续孵育1h后，用多功能酶标仪在
450nm处测量每个孔的吸光度。通过测量细胞活力确定水提物的细胞毒性。其中，以空白溶剂(肽1～3的供试品溶液为Tris‑HCl缓冲液，肽4～5的供试品溶液为含20％v/v的Tris‑HCl缓冲液)，仅以空白溶剂处理的C2C12细胞为空白对照组。体外细胞活力＝(样品的平均OD值–空白对照的平均OD值)/(空白对照的平均OD值–无细胞空白对照的平均OD值)。

[0090] 结果如图4所示，含肽1～5的供试品溶液对C2C12细胞无细胞毒性。

[0091] (2)骨骼肌细胞氧化损伤模型的建立及分组实验

[0092] 将C2C12细胞以104个/孔的密度接种在96孔平底培养皿中，加入DMEM培养基(含FBS)并孵育24h。弃去旧液，用PBS清洗后，加入不含FBS的DMEM培养基继续孵育24h。实验组：去除培养基后，将5种不同浓度的供试品溶液(0.1、0.5、1.0mg/mL)加入细胞中预处理18h，然后将H2O2(终浓度为0.5mM，该浓度的H2O2经实验证实处理后C2C12的细胞活力下降至50％以下)加入每个孔中继续孵育6h，CCK‑8测定每个孔中细胞增殖活力。以不加供试品溶液的细胞组作为模型组，未加H2O2和供试品溶液的细胞组作为空白组。体外细胞活力＝(实验组或模型组样品的平均OD值–空白照的平均OD值)/(空白对照的平均OD值–无细胞空白对照的平均OD值)。

[0093] 如图5所示，模型组细胞活力下降至45.9％左右，含不同浓度的肽1～3的供试品溶液能够对H2O2处理的C2C12细胞活力进行恢复，而含不同浓度的肽4、5的供试品溶液并不能恢复H2O2处理造成的C2C12细胞活力下降，由此说明，本发明提供的肽1～3能够恢复小鼠成肌细胞的体外抗氧化损伤，表明其具有抗氧化性能。

[0094] (4)流式细胞仪测定活性氧自由基

[0095] 使用荧光探针测定细胞中ROS的水平，将上述分组实验得到各组C2C12细胞以每孔5
5×10 个细胞的密度接种在6孔板中，收集悬浮细胞和贴壁细胞，并用PBS洗涤两次。装载
2',7'‑二氯荧光素二乙酸盐(DCFH‑DA)荧光探针，避光37℃孵育20min。为了进行流式细胞术分析，将细胞重悬于1mL PBS溶液中。根据制造商的规程通过流式细胞仪在488nm波长处测定荧光位移，Flow J软件分析结果。

[0096] 使用DCFH‑DA作为荧光探针测定细胞内ROS水平，该荧光探针通过流式细胞仪进行测定，荧光强度代表细胞中ROS水平。如图6所示，H2O2增加了模型组细胞中ROS的水平，而含不同浓度的肽1～3的供试品溶液降低了H2O2诱导的ROS的产生，含不同浓度的肽4、5的供试品溶液并不能降低H2O2诱导的ROS的产生。由此表明，本发明提供的肽1～3能够明显阻止H2O2诱导线粒体产生ROS，并且呈现明显的剂量效应。

[0097] (5)胞内糖原和ATP的测定

[0098] 为了评估化合物对肌肉生长过程中能量代谢的影响，通过使用糖原检测试剂盒，“蒽酮法”测定胞内糖原含量。将将上述分组实验得到各组C2C12细胞接种在6孔板中，加入裂解缓冲液中超声破碎，以8000g离心10min，在95℃沸水浴10min，然后25℃在12000g离心4
5min。使用酶标仪在620nm处测定吸光度值，并计算10个细胞中的糖原含量。鲁米诺发光法测定细胞中ATP含量，使用增强型ATP分析试剂盒(Beyotime)测量C2C12细胞中的ATP水平。
在SynergyMx多功能酶标仪中测量每个样品的上清液中的发光值。将数据标准化为每个样品的蛋白质浓度，然后标准化为对照的100％。

[0099] 图7示出了各组细胞的糖原含量。结果可知，H2O2氧化损伤的模型组的糖原含量显著低于空白组，而含不同浓度的肽1～3的供试品溶液减缓了H2O2诱导的糖原下降，含不同浓度的肽4、5的供试品溶液并不能减缓H2O2诱导的糖原下降。

[0100] 图8示出了各组细胞的ATP含量。结果可知，H2O2氧化损伤的模型组的ATP含量显著低于空白组，而含不同浓度的肽1～3的供试品溶液减缓了H2O2诱导的ATP下降，含不同浓度的肽4、5的供试品溶液并不能减缓H2O2诱导的ATP下降。

[0101] 由此表明，本发明提供的肽1～3能够明显阻止H2O2诱导的C2C12细胞糖原和ATP含量下降，并且呈现明显的剂量效应。而糖原含量和ATP含量是成肌细胞的储能物质，说明本发明提供的肽1～3能够提高肌肉的能量代谢，增强机体运动能力。

[0102] (6)激光共聚焦测定线粒体膜电位

[0103] 使用线粒体膜电位测定试剂盒(JC‑1)来测定H2O2诱导下C2C12细胞线粒体膜电位(ΔΨm)。在高电位下，JC‑1形成聚集体，释放红色荧光，而绿色荧光的单体则以低电位存在。红色和绿色荧光强度的比值用于测量ΔΨm的变化。将新鲜C2C12细胞用含不同浓度的肽1～5的供试品溶液预处理18h，与H2O2共同孵育6h后，加入JC‑1在37℃避光放置20min。在染色缓冲液中洗涤两次，用高分辨率共聚焦激光显微镜(LSM880)随机选择3个不同视野，测量细胞线粒体荧光：红色(激发585nm，发射590nm)和绿色(激发514nm，发射529nm)。线粒体去极化表现为红色和绿色荧光比率的降低。通过ImageJ1.8.0软件进行图像的处理和分析。

[0104] 图9示出了各组细胞的ΔΨm值，其表征了红色和绿色荧光强度的比值。结果可知，H2O2氧化损伤的模型组的ΔΨm值显著低于空白组，而含不同浓度的肽1～3的供试品溶液减缓了H2O2诱导的ΔΨm值下降，含不同浓度的肽4、5的供试品溶液并不能减缓H2O2诱导的ΔΨm值下降。由此表明，本发明提供的肽1～3能够明显阻止H2O2诱导的C2C12细胞糖原和ΔΨm值下降，并且呈现明显的剂量效应。JC‑1在线粒体中表现出ΔΨm依赖性积累；在ΔΨm高的健康C2C12细胞中，JC‑1形成发射红色荧光的复合物，而在ΔΨm低的不健康细胞中，JC‑1保持单体形态，发出绿色荧光。由此说明，本发明提供的肽1～3能够保持C2C12细胞的健康状态，免受H2O2诱导的氧化损伤。

[0105] 图10示出了各组细胞的线粒体分支长度μm。结果可知，H2O2氧化损伤的模型组的线粒体分支长度显著低于空白组，而含不同浓度的肽1～3的供试品溶液减缓了H2O2诱导的线粒体分支长度下降，含不同浓度的肽4、5的供试品溶液并不能减缓H2O2诱导的线粒体分支长度下降。由此说明，本发明提供的肽1～3能够阻止H2O2氧化损伤引起的线粒体自噬机制，保持C2C12细胞的健康状态，免受H2O2诱导的氧化损伤。

[0106] 而在运动性疲劳的状态下，肌细胞线粒体的功能发生改变，出现呼吸链电子漏水平增大、线粒体质子漏增加、H+外溢得到现象。在过度运动后，可观察到心肌、骨骼肌、肝脏组织中线粒体的氧化磷酸化加剧，ATP产生能力下降，即线粒体ATP酶活力下降，通常在低氧耗态也会产生较多自由基，增加脂质过氧化水平，进一步危害膜流动性和呼吸链酶的活性，加剧了运动性疲劳。由以上结果可知，本发明提供的肽1～3能够阻止H2O2诱导线粒体产生ROS，减缓H2O2诱导的糖原和ATP下降，改善细胞线粒体膜电位和分支长度受到的损伤，从而提示本发明提供的肽1～3具有明显抵抗疲劳作用，具有应用于抗疲劳领域的应用前景。

[0107] 8、牡丹肽胶囊

[0108] (1)胶囊的制备

[0109] 分别用pH为7.0的Tris‑HCl缓冲液配制终浓度为5.0mg/mL的肽1～3溶液；分别用pH为7.0、含20％v/v的甲醇的Tris‑HCl缓冲液配制终浓度为5.0mg/mL的肽4～5溶液。

[0110] 分别取上述肽1～5溶液100mL，与40mg/mL的海藻酸钠溶液混合，40℃、120rpm震荡水浴20min后，用5mL注射器吸取5mL混合溶液，滴入100mL、3.5mg/mL的氯化钙溶液中，恒温固化30min，固化结束后抽滤，沉淀置于45℃烘箱烘干，即为牡丹肽胶囊。

[0111] (2)肽含量测定

[0112] 用5％三氯乙酸溶液分别配制0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mg/mL的Gly－Gly－Tyr－Arg四肽(化学合成)溶液；然后按照3∶2比例与双缩脲试剂反应，静置10min后离心，在540nm处测定上清吸光值，以四肽质量浓度(x)为横坐标，以吸光值(y)为纵坐标绘制标准曲线和拟合方程。多肽含量测定:取样品按照标准曲线操作步骤测定吸光值，带入标准曲线方程中计算多肽含量。

[0113] (3)牡丹肽胶囊缓释性能分析

[0114] 人工模拟胃液的配制：取16.4mL盐酸，加入约800mL蒸馏水，调pH至2.0，并加入10g胃蛋白酶，最后加水定容至1L，得人工模拟胃液。

[0115] 人工模拟肠液的配制：准确称取6.8g磷酸二氢钾，加入500mL蒸馏水溶解，用0.4％NaOH溶液调节pH至6.8，再加入10g胰蛋白酶，充分溶解后定容至1L，得人工模拟肠液。

[0116] 将100mg牡丹肽胶囊分别加至100mL人工模拟胃液和100mL人工模拟肠液中，并置于恒温振荡培养箱中，在200r/min、37℃条件下振荡，间隔不同时间测试人工模拟胃液和人工模拟肠液中肽1～5含量，检测方法如上所述。

[0117] 结果图11所示，含肽1～3的牡丹肽胶囊在人工胃液和人工肠液中在36h内能够分别持续释放肽1～3，而含肽4～5的牡丹肽胶囊在人工胃液和人工肠液中12h内几乎达到释放极限，释放了全部肽。由此可见，肽1～3在牡丹肽胶囊中的释放较为持续，能够持续起到释放作用，这对于将牡丹肽胶囊作为一种抗氧化抗疲劳的制剂在体内持续起到生物活性具有极大的动力学作用。

[0118] 综上所述，本发明以凤丹油用牡丹苗叶为原材料，通过预处理和提取步骤，得到其中的初蛋白，再经进一步提取得到其蛋白品，最后经过酶解得到牡丹肽的固体粉末。并且分析得到这些牡丹肽的氨基酸序列。

[0119] 另外，本发明还对这些牡丹肽的固体粉末的溶解性、乳化活性和乳液稳定性进行了研究发现，本发明提供的肽1～3具有更高的溶解性，更好的乳化活性和乳液稳定性。

[0120] 另外，本发明还对这些牡丹肽细胞生物活性进行研究，发现含肽1～5的供试品溶液对C2C12细胞无细胞毒性；肽1～3能够恢复小鼠成肌细胞的体外抗氧化损伤，表明其具有抗氧化性能。肽1～3能够明显阻止H2O2诱导的C2C12细胞糖原和ATP含量下降，并且呈现明显的剂量效应。本发明提供的肽1～3能够提高肌肉的能量代谢，增强机体运动能力。由此表明，本发明提供的肽1～3能够阻止H2O2诱导线粒体产生ROS，减缓H2O2诱导的糖原和ATP下降，改善细胞线粒体膜电位和分支长度受到的损伤，从而提示本发明提供的肽1～3具有明显抵抗疲劳作用，具有应用于抗疲劳领域的应用前景。

[0121] 另外，本发明还将这些牡丹肽的固体粉末制备成牡丹肽胶囊，测试了其在人工胃液和人工肠液中的释放效果。结果发现，肽1～3在牡丹肽胶囊中的释放较为持续，能够持续起到释放作用，这对于将牡丹肽胶囊作为一种抗氧化抗疲劳的制剂在体内持续起到生物活性具有极大的动力学作用。

[0122] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。