一种抗肿瘤阳离子两亲肽及其应用转让专利
申请号 : CN202310744379.6
文献号 : CN116514926B
文献日 : 2023-08-29
发明人 : 徐梅霞 , 李亚平 , 李强 , 刘聪 , 陆杰 , 谭圆
申请人 : 烟台药物研究所
摘要 :
本发明属于生物医药技术领域，涉及一种抗肿瘤阳离子两亲肽及其应用，所述抗肿瘤阳离子两亲肽氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的抗肿瘤阳离子两多肽含有15个氨基酸，分子相对较小，仅带有50%的疏水性氨基酸以及一定数量的碱性氨基酸，在生理条件下带正电荷，在水溶液里呈松散结构，具有一定折叠形状的两亲二级结构特征；所述抗肿瘤阳离子两亲肽可通过人工合成的方式大量制备，其对正常细胞无毒，半衰期长，能有效抑制肿瘤细胞活性，为肿瘤的治疗及预防提供了新的思路与方法。
权利要求 :
1.一种抗肿瘤阳离子两亲肽，其特征在于，氨基酸序列如SEQ ID NO.1：Pro‑Arg‑Trp‑Lys‑Arg‑Trp‑Ala‑Trp‑ His‑Trp‑Lys‑Lys‑Ala‑Trp‑Trp所示。
2.一种编码如权利要求1所述的抗肿瘤阳离子两亲肽的核酸分子。
3.根据权利要求2所述的核酸分子，其特征在于，包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
4.一种包含如权利要求2或3所述的核酸分子的载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，包括质粒或病毒。
6.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，包括噬菌体。
7.一种包含如权利要求2或3所述的核酸分子或如权利要求4所述的载体的宿主细胞。
8.如权利要求1所述的抗肿瘤阳离子两亲肽在制备抗肿瘤药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
说明书 :
一种抗肿瘤阳离子两亲肽及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药技术领域，尤其涉及一种抗肿瘤阳离子两亲肽及其应用。
背景技术
[0002] 恶性肿瘤（癌症）是一种严重威胁人类健康的疾病，其在发生进展的过程中形成了特殊的生物学功能，包括无限增殖、对生长抑制基因的逃避、细胞凋亡抑制、诱导血管生成及激活侵袭与转移等，因此难以被彻底治愈。目前传统的化疗药物依然是主要的抗癌药物，但这些化疗药物在杀死癌细胞的同时对正常细胞也会造成不同程度的杀伤，存在发烧、呕吐、脱发、腹痛、抑制骨髓造血功能等多种问题。因此，寻找新型高效、低毒的抗肿瘤药物尤为重要。
[0003] 抗肿瘤多肽是一类由十几至几十个氨基酸残基组成、具有两亲性并带正电荷的短肽，具有杀伤肿瘤细胞的活性。因其可以与细胞表面携带负电荷的癌细胞有特异结合能力，对正常细胞的毒性较低，因此具有毒副作用小、不易产生耐药和免疫反应低等显著的优点，目前已成为抗肿瘤药物研究的热点之一。
[0004] 中国发明专利申请CN202110866068.8公开了一种抗肿瘤多肽，其包括MDX1VDQSAVGFEYQGX2TEX3HASQX4GX5TX6X7VQX8EPAPGAPMGX9VTAT或与其具有至少90%序列同一性的氨基酸序列；该多肽可抑制人肺癌、肝癌、胶质瘤、乳腺癌、结肠癌细胞增殖，并且具有抑制肿瘤细胞克隆形成能力和抑制肿瘤细胞迁移能力，同时抑制小鼠成瘤模型的生长。中国发明专利CN202111321426.3则公开了一种抗肿瘤多肽，包括32个氨基酸残基，GILSSIKGVAKGVAKNVAAQLLDTLKCKITGC，其对A549、MCF7、Hela肿瘤细胞均有明显抑制作用，易选择性杀伤A549，具有良好的安全性，可作为肺癌候选药物。虽然上述抗肿瘤多肽有诸多优点，但也存在一些缺点，抗肿瘤多肽因分子相对过大，存在一定的免疫原性，导致血浆半衰期短的问题；容易与血清成分如带负电荷蛋白发生结合，从而影响抗肿瘤能力，药效低。
[0005] 因此，亟需提供一种活性更好、安全无毒的抗肿瘤多肽。
发明内容
[0006] 本发明针对上述现有技术存在的不足，提供一种抗肿瘤阳离子两亲肽及其应用，具体的技术方案如下：
[0007] 本发明提供一种抗肿瘤阳离子两亲肽，其氨基酸序列（N端至C端）如SEQ ID NO.1：Pro‑Arg‑Trp‑Lys‑Arg‑Trp‑Ala‑Trp‑ His‑Trp‑Lys‑Lys‑Ala‑Trp‑Trp所示。
[0008] Pro表示脯氨酸，Arg表示精氨酸，Trp表示色氨酸，Lys表示赖氨酸，Ala表示丙氨酸，His表示组氨酸。
[0009] 本发明提供的抗肿瘤阳离子两多肽含有15个氨基酸，分子相对较小，仅带有50%的疏水性氨基酸以及一定数量的碱性氨基酸，在生理条件下带正电荷，在水溶液里呈松散结构，具有一定折叠形状的两亲二级结构特征；所述抗肿瘤阳离子两亲肽可通过人工合成的方式大量制备，其对正常细胞无毒，半衰期长，能有效抑制肿瘤细胞活性，为肿瘤的治疗及预防提供了新的思路与方法。
[0010] 进一步地，所述抗肿瘤阳离子两亲肽采用固相合成方法制备而成，成本较低且可以高通量标准化生产。
[0011] 具体地，所述抗肿瘤阳离子两亲肽的等电点为12.55，理论分子量为：2468.91。
[0012] 本发明还提供一种编码上述抗肿瘤阳离子两亲肽的核酸分子。
[0013] 具体地，所述的核酸分子包含一种或多种经密码子优化的核酸分子。
[0014] 本发明还提供一种包含上述核酸分子的载体。
[0015] 具体地，所述载体包括但不限于质粒、病毒或噬菌体。
[0016] 本发明还提供一种包含上述核酸分子或上述载体的宿主细胞。
[0017] 具体地，所述宿主细胞包括但不限于微生物、植物或动物细胞，可通过电穿孔、lipofectine转染或lipofectamin转染等方法将本发明所述的核酸分子或者载体引入所述宿主细胞中。
[0018] 本发明还提供上述抗肿瘤阳离子两亲肽、核酸分子、载体或宿主细胞在制备抗肿瘤药物中的应用。
[0019] 具体地，所述药物还包括药学上可接受的载体。
[0020] 进一步地，所述药学上可接受的载体为缓释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、吸收促进剂、吸附载体、表面活性剂或润滑剂中的任意一种或多种。
[0021] 具体地，所述药物的剂型包括但不限于注射剂、片剂、胶囊剂或合剂，优选为注射剂。
[0022] 进一步地，所述注射剂的给药方式为静脉、皮下或肌肉注射。
[0023] 具体地，所述药物的给药部位包括全身给药和局部给药；所述全身给药为静脉注射或滴注、皮下注射或肌肉注射，所述局部给药为肿瘤组织内注射、肿瘤周边组织注射。
[0024] 具体地，所述肿瘤包括但不限于乳腺癌、肺癌、膀胱癌、胃癌、结肠癌、直肠癌、食道癌、淋巴瘤、胰腺癌或睾丸癌。
[0025] 进一步地，所述肿瘤为乳腺癌或肺癌。
[0026] 本发明的有益效果为：
[0027] （1）安全无毒：本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽分子量小，由15个氨基酸残基组成，免疫原性低；在生理条件下带正电荷，对正常细胞安全无毒。
[0028] （2）制备方便：本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽可以由固相合成而得，成本较低且可以高通量标准化生产。
[0029] （3）高效多能：本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽在体外可以有效抑制乳腺癌细胞和肺癌细胞活性。
[0030] （4）本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽体内代谢具有可预测性，体内半衰期较长，具有高选择性和高活性，具有良好的临床应用潜力，为肿瘤的治疗及预防提供了新的思路与方法。
附图说明
[0031] 图1为本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对乳腺癌细胞MCF‑7的杀伤效果图；
[0032] 图2为本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对肺癌细胞A549的杀伤效果图；
[0033] 图3为本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对乳腺癌细胞MCF‑7的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤重量结果图；
[0034] 图4为本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对乳腺癌细胞MCF‑7的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤体积结果图；
[0035] 图5为本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对肺癌细胞A549的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤重量结果图；
[0036] 图6为本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对肺癌细胞A549的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤体积结果图。
具体实施方式
[0037] 以下结合实施例对本发明的原理和特征进行描述，所举实例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。
[0038] 实施例中未注明具体技术或条件的，均按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。
[0039] 实施例：
[0040] 1.抗肿瘤阳离子两亲肽的合成
[0041] 所述抗肿瘤阳离子两亲肽的氨基酸序列（N端至C端）如SEQ ID NO.1：Pro‑Arg‑Trp‑Lys‑Arg‑Trp‑Ala‑Trp‑ His‑Trp‑Lys‑Lys‑Ala‑Trp‑Trp所示。
[0042] 本实施例的抗肿瘤阳离子两亲肽采用固相合成方式进行制备，包括如下步骤：
[0043] 将多肽的C端羧基以共价键形式与一个不溶性的高分子树脂相连，然后以这个氨基酸的氨基作为起点，与另一分子氨基酸的羧基作用形成肽键，不断重复这一过程，得到含保护基的抗肿瘤阳离子两亲肽肽链；合成反应完成后，去除保护基，将肽链与树脂分离，得粗肽。粗肽使用Waters制备液相进行纯化至纯度大于97%，再经过Thermo电喷雾质谱测定，其序列与目标序列完全一致，后经冷冻干燥，制备成冻干粉末。
[0044] 2.抗肿瘤阳离子两亲肽的抗肿瘤体外活性测定
[0045] 将乳腺癌细胞MCF‑7和肺癌细胞A549，使用含10%胎牛血清DMEM低糖培养基，于37℃，5%浓度的CO2细胞培养箱内恒温培养。待MCF‑7、A549细胞生长密度在80%左右时，加入胰酶，摇晃细胞皿并转移至培养箱进行消化并进行传代。将MCF‑7、A549细胞用培养基配置成5000个/mL细胞悬液，接种至96孔板中，每孔接种200μL，于37℃恒温CO2培养箱中培养24h。
设置对照组（只加细胞和培养基，不加药物）以及六个浓度多肽溶液的实验组。其中实验组分别加入100μL终浓度为1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL的阳离子两亲肽溶液，空白对照组和细胞对照组分别加入等体积的培养基溶液，于37℃恒温CO2培养箱中培养48h。弃去上清，每孔加入200μL含0.2mg/mL MTT无血清培养，于37℃恒温CO2培养箱中继续培养4h后，在酶标仪上以570nm作为试验波长，450nm作为参比波长，测定光密度值并计算细胞存活率，MCF‑7结果如图1所示，A549结果如图2所示。
设置对照组（只加细胞和培养基，不加药物）以及六个浓度多肽溶液的实验组。其中实验组分别加入100μL终浓度为1μg/mL、2.5μg/mL、5μg/mL、10μg/mL、20μg/mL和30μg/mL的阳离子两亲肽溶液，空白对照组和细胞对照组分别加入等体积的培养基溶液，于37℃恒温CO2培养箱中培养48h。弃去上清，每孔加入200μL含0.2mg/mL MTT无血清培养，于37℃恒温CO2培养箱中继续培养4h后，在酶标仪上以570nm作为试验波长，450nm作为参比波长，测定光密度值并计算细胞存活率，MCF‑7结果如图1所示，A549结果如图2所示。
[0046] 结果显示，本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽对乳腺癌细胞和肺癌细胞有明显的毒性作用，可有效抑制其活性，其中对于乳腺癌细胞MCF‑7，抗肿瘤阳离子两亲肽的IC50=6.5μg/mL；对于肺癌细胞A549，抗肿瘤阳离子两亲肽的IC50=8.5 μg/mL。
[0047] 3.抗肿瘤阳离子两亲肽的抗肿瘤体内活性测定（MCF‑7乳腺癌细胞）
[0048] 构建裸鼠荷瘤模型，研究阳离子两亲肽对肿瘤的体内抑制活性。6‑7周大小雌性裸6
鼠 (购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)，于每只裸鼠背部皮下注射3×10个MCF‑7乳腺癌细胞，注射体积200μL。一周后将上述裸鼠随机分为四组，分别尾静脉注射200μL PBS(空白对照)、阳离子两亲肽1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，每4天注射一次，连续注射20天后，处死小鼠，称量肿瘤的重量并测量肿瘤体积，肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2
2
×a×b ，其中a、b分别表示长和宽。抗肿瘤阳离子两亲肽对乳腺癌细胞MCF‑7的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤重量结果如图3所示，肿瘤体积结果如图4所示。
鼠 (购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)，于每只裸鼠背部皮下注射3×10个MCF‑7乳腺癌细胞，注射体积200μL。一周后将上述裸鼠随机分为四组，分别尾静脉注射200μL PBS(空白对照)、阳离子两亲肽1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，每4天注射一次，连续注射20天后，处死小鼠，称量肿瘤的重量并测量肿瘤体积，肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2
2
×a×b ，其中a、b分别表示长和宽。抗肿瘤阳离子两亲肽对乳腺癌细胞MCF‑7的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤重量结果如图3所示，肿瘤体积结果如图4所示。
[0049] 结果显示，本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽对乳腺癌细胞MCF‑7的体内成瘤抑制作用明显，和PBS空白对照组相比，使用抗肿瘤阳离子两亲肽的肿瘤体积明显缩小，且呈现剂量依赖性，剂量越大，肿瘤抑制效果越明显。
[0050] 4.抗肿瘤阳离子两亲肽的抗肿瘤体内活性测定（A549肺癌细胞）
[0051] 构建裸鼠荷瘤模型，研究阳离子两亲肽对肿瘤的体内抑制活性。6‑7周大小雌性裸6
鼠 (购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)，于每只裸鼠背部皮下注射3×10个A549肺癌细胞，注射体积200μL。一周后将上述裸鼠随机分为四组，分别尾静脉注射200μL PBS(空白对照)、阳离子两亲肽1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，每4天注射一次，连续注射20天后，处死小鼠，称量肿瘤的重量并测量肿瘤体积，肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a
2
×b ，其中a、b分别表示长和宽。本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对肺癌细胞A549的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤重量结果如图5所示，肿瘤体积结果如图6所示。
鼠 (购自济南朋悦实验动物繁育有限公司)，于每只裸鼠背部皮下注射3×10个A549肺癌细胞，注射体积200μL。一周后将上述裸鼠随机分为四组，分别尾静脉注射200μL PBS(空白对照)、阳离子两亲肽1mg/mL、2mg/mL、4mg/mL，每4天注射一次，连续注射20天后，处死小鼠，称量肿瘤的重量并测量肿瘤体积，肿瘤体积(Tumor volume，TV)的计算公式为：TV＝1/2×a
2
×b ，其中a、b分别表示长和宽。本发明抗肿瘤阳离子两亲肽对肺癌细胞A549的体内成瘤抑制作用检测的肿瘤重量结果如图5所示，肿瘤体积结果如图6所示。
[0052] 结果显示，本发明提供的抗肿瘤阳离子两亲肽对肺癌细A549的体内成瘤抑制作用明显，和PBS空白对照组相比，使用抗肿瘤阳离子两亲肽的肿瘤体积明显缩小，且呈现剂量依赖性，剂量越大，肿瘤抑制效果越明显。
[0053] 综上，本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽可以由固相合成而得，成本较低且可以高通量标准化生产。本发明的抗肿瘤阳离子两亲肽在体外可以有效抑制乳腺癌细胞和肺癌细胞活性，高效多能；本发明的多肽体内代谢具有可预测性，体内半衰期较长，具有高选择性和高活性，具有良好的临床应用潜力，为肿瘤的治疗及预防提供了新的思路与方法。
[0054] 以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。