一种用于调控mRNA高表达的UTR及其应用

摘要

本发明提供一种用于调控mRNA高表达的5’‑UTR及其应用。本发明涉及生物技术领域。本发明对编码人α珠蛋白的HBA1基因的5’‑UTR序列进行改造，筛选获得具有优异效果的两种5’‑UTR。本发明进一步提供了包含所述5’‑UTR的表达盒、重组载体、细胞、重组菌、载体的构建方法，以及“AGGAAATA”核酸和5’‑UTR的用途等。本发明提供的两种5’‑UTR体外转录效率高，通用性强，可用于目标基因mRNA的高效表达、制备，适用于工业化大规模mRNA体外转录以及mRNA生产。

权利要求

1. 一种5’‑UTR，其特征在于，所述5’‑UTR的核酸序列如SEQ ID NO.5所示。

2.一种表达盒，其特征在于，包含权利要求1所述5’‑UTR。

3. 根据权利要求2所述的表达盒，其特征在于，进一步地，所述表达盒还包含启动子、目标基因、3’‑UTR和Poly A元件中的一种或多种；其中，所述启动子为T7启动子。

4. 根据权利要求3所述的表达盒，其特征在于，所述T7启动子的序列如SEQ ID NO.6所示，所述3’‑UTR的序列如SEQ ID NO.8所示，所述Poly A的序列如SEQ ID NO.9所示。

5.一种重组载体，其特征在于，包含权利要求1所述5’‑UTR或权利要求2‑4任一项所述表达盒。

6. 根据权利要求5所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体按照T7启动子、5’‑UTR、目标基因、3’‑UTR和Poly A顺序，通过基因合成方式得到组合的表达框，再通过无缝克隆方式构建至pTNT质粒载体。

7.一种宿主细胞，其特征在于，包含权利要求1所述5’‑UTR，或权利要求2‑4任一项所述表达盒，或权利要求5或6所述重组载体。

8.一种重组菌，其特征在于，包含权利要求1所述5’‑UTR，或权利要求2‑4任一项所述表达盒，或权利要求5或6所述重组载体。

9.一种用于mRNA体外转录的重组质粒的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：（1）质粒线性化，所述质粒为pTNT质粒；

（2）通过基因合成方式组合启动子序列、权利要求1所述5’‑UTR的序列、ORF序列、3’‑UTR的序列、Poly A的序列，得到表达框；

（3）通过无缝克隆方式将所述表达框构建至步骤（1）得到的线性化质粒，获得包含所述

5’‑UTR的用于mRNA体外转录的重组质粒。

10.根据权利要求9所述的构建方法，其特征在于，进一步地，所述方法还包含下述一个或多个步骤：步骤（4）获得线性化的所述重组质粒：采用Xba I限制性酶切位点酶切实现所述重组质粒线性化，用于后续mRNA体外转录；

步骤（5）以线性化的所述重组质粒为模板进行体外转录；

步骤（6）对体外转录得到的mRNA进行纯化；

步骤（7）对纯化的mRNA进行细胞转染；

步骤（8）对转染细胞进行荧光观察；

步骤（9）对转染细胞进行细胞裂解和Western Blot检测。

11.权利要求1所述5’‑UTR，或权利要求2‑4任一项所述表达盒，或权利要求5或6所述重组载体，或权利要求7所述宿主细胞，或权利要求8所述重组菌用于mRNA体外转录的用途。

说明书

一种用于调控mRNA高表达的UTR及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种用于目的基因高表达的人工核酸分子5’‑UTR。

背景技术

[0002] 转录而成的信使RNA（mRNA）序列除去编码生成多肽的编码序列（coding squence），在5’端和3’端还有一些不翻译的序列，可能参与了mRNA表达调控。UTR
（Untranslated Regions)即非翻译区，是mRNA分子两端的非编码片段。 5’‑UTR从mRNA起点
的甲基化鸟嘌呤核苷酸帽延伸至AUG起始密码子，3’‑UTR从编码区末端的终止密码子延伸
至多聚A尾（Poly A）的末端。

[0003] 随着全球mRNA疫苗需求的剧增，疫苗生产供应链出现挑战：急需优化mRNA工艺来突破产能限制。其中，在上游制备环节，体外转录法获得mRNA是最为高效的方式。用于体外
转录mRNA的模板必须包含T7启动子序列、5’‑UTR序列、ORF序列、3’‑UTR序列、Poly A序列。
研究表明5’‑UTR在mRNA翻译过程中至关重要，包括核糖体募集，扫描和起始密码子选择。另
外5’‑UTR对于mRNA的稳定性也有重要影响。

[0004] 与3’‑UTR序列相比，5’‑UTR序列要更短，长度一般在100‑200核苷酸。mRNA 5’‑UTR序列中包含能够被细胞特异性的RNA结合蛋白识别的结构元件，介导mRNA的翻译起始过程。
在合成外源mRNA时加入修饰核苷酸，可以减轻mRNA转染细胞后触发的天然免疫反应。但修
饰核苷酸的加入亦反过来影响mRNA的二级结构，从而对mRNA在细胞中的翻译效率造成影
响。在过往研究中使用到用于调控翻译表达的UTR序列包括：来自CMV（Cytomegalovirus，人
类巨噬细胞病毒 )的增强子序列，人alpha‑globin （α‑珠蛋白）5’‑UTR、人生长激素UTR序
列、非洲爪蟾蜍beta‑globin（β‑珠蛋白） UTR等。

[0005] 本领域已知用于调控目的基因表达的UTR。例如，CN101617048B（公告日2012年11月07日）公开了具有优化的5’端前导功能(5’‑UTR)的人工DNA序列用以改进异源蛋白质在
植物内的表达，5’‑UTR核苷酸前导序列，其包含有利于基因表达的元件，如重复的CAA三核
苷酸元件，其与重复的CT二核苷酸元件组合。CN106480035A（公开日2017年03月08日）公开
了一种5’‑UTR元件及其在生产中的应用，获得高效增强基因表达的核酸序列，以及在L‑丙
氨酸发酵生产中的应用。CN104321432A（公开日2015年01月28日）公开了一种人工核酸分
子，所述人工核酸分子包含至少一个源自TOP基因的5’‑UTR元件，至少一个可读框和任选地
至少一个3’‑UTR元件，所述3’‑UTR元件包含优选源自提供稳定mRNA的基因诸如白蛋白基因
的3’‑UTR，或源自提供稳定mRNA的基因的3’‑UTR的变体的核酸序列。CN106148344A（公开日
2016年11月23日）公开了一种具有增强基因表达能力的马铃薯花粉特异表达基因SBgLR的
5’‑UTR序列及其应用，SBgLR基因的5’‑UTR序列可以提高不同类型启动子的表达活性，可在
基因工程和基因功能研究中用于提高目标基因的表达。

[0006] 虽然现有技术已有一些用于调控目的基因表达的UTR，但在提高目标基因表达量以及通用性上仍有待提高，且鉴于目前体外生产mRNA的大量需求，mRNA生产领域亟需可调
控目的基因高效表达、具有通用性的用于mRNA生产的5’‑UTR。

发明内容

[0007] 针对现有UTR的不足，本发明提供一种用于调控mRNA高表达的5’‑UTR，其是对编码人α珠蛋白的HBA1基因的5’‑UTR序列进行改造，筛选获得具有优异效果的两种5’‑UTR。本发
明的5’‑UTR具有通用性，适于调控不同目的基因的高表达，可广泛应用于mRNA体外转录以
及工业化大规模mRNA生产。本发明进一步提供了包含所述5’‑UTR的表达盒、重组载体、细
胞、重组菌、载体的构建方法，以及5’‑UTR的用途等。

[0008] 本发明的一方面提供一种5’‑UTR，其特征在于，包含人α珠蛋白的HBA1基因的5’‑UTR的截短序列，且在所述截短序列的5’端添加“AGGAAATA”核酸。

[0009] 进一步地，在所述截短序列中插入“AGTATT”核酸。

[0010] 进一步地，所述截短序列的核酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0011] 进一步地，在所述截短序列的3’端，添加Kozak序列；优选地，所述Kozak序列如SEQ ID NO.2所示。

[0012] 进一步地，所述5’‑UTR的核酸序列如SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5所示。

[0013] 本发明的另一方面提供一种表达盒，其特征在于，包含所述5’‑UTR。

[0014] 进一步地，所述表达盒还包含启动子、目标基因、3’‑UTR和Poly A元件中的一种或多种；优选地，所述启动子为T7启动子。

[0015] 进一步地，所述T7启动子的序列如SEQ ID NO.6所示，所述3’‑UTR的序列如SEQ ID NO.8所示，所述Poly A的序列如SEQ ID NO.9所示。

[0016] 本发明的另一方面提供一种重组载体，其特征在于，包含所述5’‑UTR或所述表达盒。

[0017] 进一步地，所述重组载体按照T7启动子、5’‑UTR、目标基因、3’‑UTR和Poly A顺序，通过基因合成方式得到组合的表达框，再通过无缝克隆方式构建至pTNT质粒载体。

[0018] 本发明的另一方面提供一种细胞，其特征在于，包含所述5’‑UTR，或所述表达盒，或所述重组载体。

[0019] 本发明的另一方面提供一种重组菌，其特征在于，包含所述5’‑UTR，或所述表达盒，或所述重组载体。

[0020] 本发明的另一方面提供一种用于mRNA体外转录的重组质粒的构建方法，其特征在于，包含如下步骤：

[0021] （1）质粒线性化；所述质粒为pTNT质粒；

[0022] （2）通过基因合成方式组合启动子序列、所述5’‑UTR的序列、ORF序列、3’‑UTR的序列、Poly A序列，得到表达框；

[0023] （3）通过无缝克隆方式将所述表达框构建至步骤（1）得到的线性化质粒，获得包含所述5’‑UTR的用于mRNA体外转录的重组质粒。

[0024] 进一步地，所述构建方法还包含下述一个或多个步骤：

[0025] 步骤（4）获得线性化的所述重组质粒；优选地，采用Xba I限制性酶切位点酶切实现所述重组质粒线性化，用于后续mRNA体外转录；

[0026] 步骤（5）以线性化的所述重组质粒为模板进行体外转录；

[0027] 步骤（6）对体外转录得到的mRNA进行纯化；

[0028] 步骤（7）对纯化的mRNA进行细胞转染；

[0029] 步骤（8）对转染细胞进行荧光观察；

[0030] 步骤（9）对转染细胞进行细胞裂解和Western Blot检测。

[0031] 本发明的另一方面提供“AGGAAATA”核酸用于制备所述5’‑UTR的用途。

[0032] 本发明的另一方面提供所述5’‑UTR，或所述表达盒，或所述重组载体，或所述细胞，或所述重组菌用于mRNA体外转录或mRNA生产的用途。

[0033] 本发明的5’‑UTR具有如下有益的技术效果：

[0034] 1. 选取人α珠蛋白的HBA1基因的5’‑UTR前34nt序列作为基本骨架，在其5’端添加“AGGAAATA” ，结合3’端添加Kozak序列，或进一步在34nt序列5’端的“ACT”后，插入
“AGTATT”核酸，对编码人α珠蛋白的HBA1基因的5’‑UTR序列进行改造，筛选获得具有优异效
果的两种5’‑UTR，即5’‑UTR 序列2（AGGAAATAACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCA
CCATGG（SEQ ID NO.4）），以及5’‑UTR 序列3（AGGAAATAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCA
GAGAGAACCCGCCACCATGG（SEQ ID NO.5））。

[0035] 2. 验证了本发明的两种5’‑UTR对于目标基因的高表达调控作用，使用示例性的报告基因EGFP（EGFP是广泛用于研究基因表达调控的报告基因），本发明的两种5’‑UTR对不
同目标基因的高表达调控具有一定的普适性。相对于其他改造的5’‑UTR（即5’‑UTR 序列1，
AGGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGG（SEQ ID NO.3）），Western Blot结
果从条带灰度来看，使用5’‑UTR序列3的目标蛋白EGFP表达蛋白量和使用5’‑UTR序列2的目
标蛋白EGFP表达蛋白量，大于使用5’‑UTR序列1的目标蛋白EGFP表达蛋白量。

[0036] 3. 使用不同5’‑UTR的 EGFP mRNA转染细胞 24h、48h的EGFP翻译蛋白表达荧光显微镜检测照片表明，从荧光强度来看，使用5’‑UTR序列3表达EGFP绿色荧光蛋白＞使用5’‑
UTR序列2表达EGFP绿色荧光蛋白＞使用5’‑UTR序列1表达EGFP绿色荧光蛋白，即使用5’‑
UTR序列3、5’‑UTR序列2可调控目的基因高表达。

[0037] 4. 使用不同5’‑UTR的 EGFP翻译蛋白表达荧光细胞计数结果表明，从GFP+%（成功表达EGFP荧光的细胞占总细胞的百分比）来看，使用5’‑UTR序列3表达EGFP绿色荧光蛋白
GFP+%为69.07%，使用5’‑UTR序列2表达EGFP绿色荧光蛋白GFP+%为62.27%，使用5’‑UTR序列
1表达EGFP绿色荧光蛋白GFP+%为52.53%，即使用5’‑UTR序列3调控目的基因高表达效果最
好，5’‑UTR序列2其次，均显著优于其他改造的5’‑UTR（即5’‑UTR 序列1）。

[0038] 5. 本发明提供的两种5’‑UTR体外转录效率高，通用性强，可用于目标基因mRNA的高效表达、制备，适用于工业化大规模mRNA体外转录以及mRNA生产。

附图说明

[0039] 图1为本发明pTNTR‑EGFP 质粒图谱。

[0040] 图2A‑图2B，其中图2A为使用本发明5’‑UTR序列1、5’‑UTR序列2、5’‑UTR序列3的EGFP mRNA目的蛋白Western Blot结果；图2B为使用本发明5’‑UTR序列1、5’‑UTR序列2、5’‑
UTR序列3的内参GAPDH mRNA目的蛋白Western Blot结果。

[0041] 图3为本发明使用不同5’‑UTR的EGFP mRNA转染细胞 24h、48h的EGFP翻译蛋白表达荧光显微镜检测照片。

[0042] 图4为本发明使用不同5’‑UTR的EGFP翻译蛋白表达荧光细胞计数柱状图。

具体实施方式

[0043] 实施例1：5’‑UTR以及包含该元件的质粒载体的构建

[0044] 对编码人α珠蛋白的HBA1基因的5’‑UTR序列进行改造，选取前34nt序列作为基本骨架，该34nt 序列为ACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCC（SEQ ID NO.1），筛选改造获
得以下3种5’‑UTR序列。

[0045] 5’‑UTR序列1：在34nt序列的5’端，添加“AGG”（下划线）3个碱基，在3’端添加Kozak序列GCCACCATGG（SEQ ID NO.2）（下划线），5’‑UTR序列1的具体序列如下：

[0046] AGGACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGG（SEQ ID NO.3）。

[0047] 5’‑UTR序列2：在34nt序列的5’端，添加“AGGAAATA”（下划线）8个碱基，在3’端添加Kozak序列GCCACCATGG（SEQ ID NO.2）（下划线），5’‑UTR序列2的具体序列如下：

[0048] AGGAAATAACTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGG（SEQ ID NO.4）。

[0049] 5’‑UTR序列3：在34nt序列的5’端，添加“AGGAAATA”（下划线）8个碱基，在34nt序列5’端的“ACT”后，插入“AGTATT”（下划线），在3’端添加Kozak序列GCCACCATGG（SEQ ID NO.2）
（下划线），5’‑UTR序列3的具体序列如下：

[0050] AGGAAATAACTAGTATTCTTCTGGTCCCCACAGACTCAGAGAGAACCCGCCACCATGG（SEQ ID NO.5）。

[0051] mRNA体外转录的质粒pTNTR‑EGFP的构建方法，包含如下步骤：

[0052] （1）pTNT质粒（厂家Promega公司，货号：L5610）载体线性化。

[0053] （2）通过基因合成方式组合T7启动子序列、5’‑UTR序列、ORF序列（以EGFP基因作为示例，并不仅限于该基因，同样适用于其他目的基因ORF序列）、3’‑UTR序列、Poly A序列。其
中，T7启动子序列如SEQ ID NO.6所示；所述5’‑UTR序列的核苷酸序列为SEQ ID NO.3，或
SEQ ID NO.4，或SEQ ID NO.5所示；所述EGFP基因序列如SEQ ID NO.7所示；所述3’‑UTR序
列的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示；所述PolyA序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示。

[0054] 表1 载体中元件的序列

[0055] 元件名称 序列T7启动子 TAATACGACTCACTATA（SEQ ID NO.6）
EGFP ATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGG
ACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCAC
CTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGG
CCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACC
ACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCG
CACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAG
GGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCA
ACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGC
CGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGAC
GGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCG
TGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAA
CGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTC
GGCATGGACGAGCTGTACAAGTGA（SEQ ID NO.7）
3’‑UTR CTCGAGCTGGTACTGCATGCACGCAATGCTAGCTGCCCCTTTCCCGTCCTGGGTACCC
CGAGTCTCCCCCGACCTCGGGTCCCAGGTATGCTCCCACCTCCACCTGCCCCACTCAC
CACCTCTGCTAGTTCCAGACACCTCCCAAGCACGCAGCAATGCAGCTCAAAACGCTTA
GCCTAGCCACACCCCCACGGGAAACAGCAGTGATTAACCTTTAGCAATAAACGAAAGT
TTAACTAAGCTATACTAACCCCAGGGTTGGTCAATTTCGTGCCAGCCACACCCTGGAG
CTAGC（SEQ ID NO.8）
Poly A AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAGCATATGACTAAAAAAAAAAAAAAAAAA
AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA（SEQ ID
NO.9）

[0056] （3）通过无缝克隆方式将上述基因合成的元件构建至线性化pTNT质粒载体，获得pTNTR‑EGFP 质粒，其质粒图谱如图1所示。针对上述3种不同的5’‑UTR序列，获得pTNTR‑
EGFP‑1（使用5’‑UTR为SEQ ID NO.3），pTNTR‑EGFP‑2（使用5’‑UTR为SEQ ID NO.4），pTNTR‑
EGFP‑3（使用5’‑UTR为SEQ ID NO.5）。

[0057] 实施例2：Western Blot检测使用不同5’‑UTR的目标蛋白的表达

[0058] 将实施例1获得的pTNTR‑EGFP‑1、pTNTR‑EGFP‑2、pTNTR‑EGFP‑3分别线性化，获得线性化的pTNTR‑EGFP质粒载体。

[0059] 以线性化的pTNTR‑EGFP‑1、pTNTR‑EGFP‑2、pTNTR‑EGFP‑3质粒载体为模板进行体外转录。对体外转录得到的目标蛋白EGFP mRNA进行纯化。

[0060] 对纯化的EGFP mRNA进行293T细胞转染，转染过程包含如下步骤：

[0061] 1)转染前一天进行细胞铺板，使其在转染时汇合度为70% 80%；~

[0062] 2)A液：25μl的opti‑MEM +1μg质粒/mRNA，轻轻吹打5次混匀；

[0063] 3)B液：25μl的opti‑MEM+2μl p3000，轻轻吹打5次混匀；

[0064] 4)Mixture1: 将25μl的B液缓慢加入A液中，轻轻吹打5次混匀，室温放置5min；

[0065] 5)C液：50μl的opti‑MEM+3μl Lipofectamine3000，轻轻吹打5次混匀；

[0066] 6)Mixture2: 将50μl的C液缓慢加入Mixture1液中，轻轻吹打5次混匀，室温放置15min；

[0067] 7)将400μl的opti‑MEM加入到上述混合物中，轻轻吹打5次混匀；

[0068] 8)取出细胞，移去培养基，取480μl的转染混合物加入到细胞孔中，轻轻摇晃3次，使得细胞均匀覆盖上转染液；

[0069] 9)6h后更换为完全培养基；24h 、48h或者对应时间收取细胞或者细胞上清进行后续实验。

[0070] 对转染细胞进行荧光观察，以及对转染细胞进行细胞裂解和Western Blot检测。

[0071] Western Blot检测包含如下步骤：

[0072] （1）样品处理：

[0073] 样品蛋白浓度检测：裂解物离心取上清用PBS稀释10倍，BCA检测蛋白浓度，上样量按照10µg/孔上样。

[0074] （2）电泳：

[0075] 采用SDS‑PAGE胶，先80V电泳1h，样品溴酚蓝跑至分离胶后增至120V电泳1h，电泳至溴酚蓝刚跑出即可停止电泳，进行转膜。

[0076] （3）转膜：

[0077] 先将滤纸浸没在无水甲醇中3min，再将膜转移至电转液中平衡5min。小心剥离电泳胶， 将膜盖于胶上并除气泡，在膜上盖2张滤纸并除去气泡。

[0078] 电转移：用300mA转移60min。

[0079] 封闭：将膜用TBST从下向上浸湿后，移至含有封闭液的平皿中，室温下脱色摇床封闭1h，4℃过夜封闭，第二天再室温孵育1h，封闭结束用TBST洗三次，每次10min。根据蛋白
marker，用小刀裁剪PVDF膜至合适的条带。

[0080] 其中，1x TBST（1L）配比为：20 mM Tris ，150mM NaCl，5mM KCl，0.2％Tween‑20 ，用浓盐酸调节PH至7.4，加水定容至1L。

[0081] 封闭液：5％脱脂奶粉加入 TBST，磁力搅拌20min；

[0082] 一抗：将一抗（厂家：武汉三鹰，eGFP货号：66002‑1‑lg，GAPDH货号：10494‑1‑AP）用TBST稀释(1:5000), 添加1%的脱脂奶粉, 室温，脱色摇床孵育2小时。

[0083] TBST洗涤：用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min。

[0084] 二抗：将二抗（厂家：武汉三鹰，GAPDH二抗 货号：SA00001‑2）用TBST稀释(1:5000), 添加1%的脱脂奶粉, 室温，脱色摇床孵育2小时

[0085] TBST洗涤：用TBST在室温下脱色摇床上洗3次，每次10min。

[0086] 显色：使用ECL试剂显色，曝光，使用凝胶成像程序lmage Lab成像。

[0087] Western Blot检测使用GAPDH基因作为内参基因，保证实验结果的准确性和可信性。

[0088] 实验结果：使用本发明5’‑UTR序列1、5’‑UTR序列2、5’‑UTR序列3的EGFP mRNA目的蛋白Western Blot结果如图2A所示，其中泳道从左到右为Marker，5’‑UTR序列1，5’‑UTR序
列2，5’‑UTR序列3。Western Blot结果可知，从条带灰度来看，使用5’‑UTR序列3的目标蛋白
EGFP表达蛋白量＞使用5’‑UTR序列2的目标蛋白EGFP表达蛋白量＞使用5’‑UTR序列1的目
标蛋白EGFP表达蛋白量。

[0089] 使用本发明5’‑UTR序列1、5’‑UTR序列2、5’‑UTR序列3的内参GAPDH mRNA目的蛋白Western Blot结果如图2B所示，其中泳道从左到右为Marker，5’‑UTR序列1，5’‑UTR序列2，
5’‑UTR序列3。Western Blot结果可知，从条带灰度来看，使用5’‑UTR序列3的内参GAPDH表
达蛋白量＞使用5’‑UTR序列2的内参GAPDH表达蛋白量＞使用5’‑UTR序列1的内参GAPDH表
达蛋白量。

[0090] 实施例3：荧光显微镜检测使用不同5’‑UTR的 EGFP翻译蛋白的表达

[0091] 步骤1：采用荧光显微镜拍照，采用12孔板，按照每个孔3个点，每个点按10倍、20倍明场暗场分别拍照，共12张，同一批次细胞各孔曝光时间及增益不得改变。

[0092] 步骤2：根据荧光强弱，强荧光按照步骤1执行，弱荧光可以按照每个孔3个点，每个点10倍明场、暗场。

[0093] 步骤3：有阳性对照，先拍阳性对照，若阳性对照无荧光则重新转染，有荧光正常进行后续拍照。阳性对照拍3个点，每个点10倍明场、暗场。

[0094] 步骤4：阴性对照只拍10倍一个点明场、暗场。

[0095] 实验结果：使用不同5’‑UTR的 EGFP mRNA转染293T细胞24h、48h的EGFP翻译蛋白表达荧光显微镜检测照片如图3所示。其中，图3从左至右，分别使用5’‑UTR序列1，5’‑UTR序
列2，5’‑UTR序列3。转染48h，荧光强度来看，使用5’‑UTR序列3表达EGFP绿色荧光蛋白＞使
用5’‑UTR序列2表达EGFP绿色荧光蛋白＞使用5’‑UTR序列1表达EGFP绿色荧光蛋白，即使用
5’‑UTR序列3、5’‑UTR序列2可调控目的基因高表达。

[0096] 实施例4：使用不同5’‑UTR的 EGFP翻译蛋白表达荧光细胞计数

[0097] 对于实施例3转染48h的细胞，弃去原细胞培养基（完全培养基：90%DMEM+10%FBS；其中DMEM 厂家：上海源培生物科技股份有限公司，货号：L110KJ；FBS 厂家：Gibco，货号：
10099141C），用1mL的PBS洗去残留的原培养基。往细胞瓶中加入适量商品化胰酶（Gibco，货
号2186958），静置大约20秒，于倒置显微镜下观察到细胞收缩突起变圆时，加入1mL含血清
的新鲜培养基终止消化，用巴氏管反复吹打细胞使其脱壁并分散制成细胞悬液。室温
1500rpm离心5min，完全弃去上清液，一个孔的细胞约用1mL PBS重悬细胞，加20µl到细胞计
数板上。荧光细胞需要提前用空白细胞进行归零校准。程序选择细胞计数仪单色1程序，分
别对每个孔进行命名。计数结束需拷excel数据做柱状图分析。

[0098] 实验结果：检测结果如表2。使用不同5’‑UTR的 EGFP翻译蛋白表达荧光细胞计数柱状图如图4所示。结果表明，从GFP+%（成功表达EGFP荧光的细胞占总细胞的百分比）来看，
使用5’‑UTR序列3表达EGFP绿色荧光蛋白GFP+%（69.07%）＞使用5’‑UTR序列2表达EGFP绿色
荧光蛋白GFP+%（62.27%）＞使用5’‑UTR序列1表达EGFP绿色荧光蛋白GFP+%（52.53%），即使
用5’‑UTR序列3、5’‑UTR序列2可调控目的基因高表达。

[0099] 表2 使用不同5’‑UTR 的 EGFP翻译蛋白表达荧光细胞计数结果

[0100] 样品ID 细胞类型 GFP+（%）GFP+细胞（cell/mL） 总细胞个数 总细胞浓度（cell/mL） 平均直径（µm） 结团率（%） 稀释比例5’‑UTR序列1 293 52.53 1.71E+05 437 3.28E+05 16.95 8.32 原始浓度
5’‑UTR序列2 293 62.27 2.18E+05 468 3.51E+05 16.74 8.49 原始浓度
5’‑UTR序列3 293 69.07 2.53E+05 495 3.71E+05 16.63 4.22 原始浓度

[0101] 本公开的上述实施例仅是为清楚地说明本公开所作的举例，而并非是对本公开的实施方式的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其
他不同形式的变化或变动。这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本公开的精
神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本公开权利要求的保护范
围之内。