熊蜂生假丝酵母诱导型启动子及其应用

摘要

本发明属于生物技术领域，公开了熊蜂生假丝酵母诱导型启动子及其应用。本发明以熊蜂生假丝酵母为研究对象，挖掘、克隆、筛选、评价诱导型启动子。利用qpcr技术检测诱导型启动子对不同碳源的响应水平，筛选到四个诱导方式不同的诱导型启动子。这些启动子与已知诱导型启动子Pgalk相比，在对应的诱导物作为唯一的碳源下具有更强的诱导性或在诱导前具有更低泄露表达量。本发明为在熊蜂生假丝酵母进行基因调控提供了强有力的工具，丰富了合成生物学元件，同时也为基因工程菌株的开发提供了帮助。

权利要求

1.熊蜂生假丝酵母中的诱导型启动子，其特征在于，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

2.包含如权利要求1所述的启动子的表达载体。

3.如权利要求1所述的启动子在表达目的基因中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，是将所述启动子与目的基因连接以用于启动目的基因的表达。

5.如权利要求1所述的启动子在熊蜂生假丝酵母遗传改造中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的应用是采用所述启动子诱导目的基因的表达。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的应用具体包括如下步骤：S1、将待整合位点的左侧同源臂及右侧同源臂、适用于大肠杆菌的ori及kana抗性的基因片段、目标基因的过表达盒，重组克隆得到整合型表达载体；

S2、将S1步骤得到整合型表达载体连接Rec/six系统得到可抗性回收的整合型表达载体；

S3、将所述启动子连接到S2中得到新的可抗性回收的整合型表达载体；

S4、将S3步骤得到的整合型表达载体转入熊蜂生假丝酵母宿主菌中，得到无抗性的过表达的熊蜂生假丝酵母重组菌。

说明书

熊蜂生假丝酵母诱导型启动子及其应用

技术领域

[0001] 发明属于生物技术领域，涉及熊蜂生假丝酵母诱导型启动子及其应用。

背景技术

[0002] 熊蜂生假丝酵母（Starmerella bombicola）属于子囊菌酵母，可以非常有效地产−1生糖脂类生物表面活性剂。由于其天然的高糖脂生产能力（>200g∙L ），熊蜂生假丝酵母已经成为最著名和研究最深入的糖脂生产酵母物种（Gao, R., et al., Production of sophorolipids with enhanced volumetric productivity by means of high cell density fermentation. Appl Microbiol Biotechnol, 2013. 97(3): p. 1103‑11.）。糖脂作为最重要的生物表面活性剂之一，以其高生产力、高表面活性、低毒性和良好的环境相容性，广泛应用于化妆品、石油开发、环境修复、制药等行业（Van Bogaert, I.N., et al., Microbial production and application of sophorolipids. Appl Microbiol 
Biotechnol, 2007. 76(1): p.23‑34.）。

[0003] 菌株的基因工程改造是实现目标特定生物基产品的高效合成的一个极其重要的手段，但到目前为止，熊蜂生假丝酵母缺乏有效的分子工具，制造基因工程菌株的基因修饰尝试非常有限。启动子原件在基因表达过程中发挥着十分重要的作用，控制着基因转录水平的高低。通常，关于一个感兴趣的基因的转录有两个主要的选择：诱导或组成型启动子。在熊蜂生假丝酵母中关于组成型的启动子可供选择的较多，如Pgap（甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶），Ppgki（3‑磷酸甘油激酶）或Ptef1（翻译延伸因子）等等（石依博, et al.,熊蜂生假丝酵母启动子的筛选及强度分析. 微生物学通报, 2021. 048(010): p. 3569‑3579.），但在转录调控中组成型启动子并不总是可取的，重组蛋白持续高表达水平对宿主产生毒性作用，因此需要在特定时间内进行诱导表达，例如Cas9蛋白，Cre或Rec重组酶。因此严谨的诱导性启动子的开发非常重要且迫切。

[0004] 诱导型启动子在外源蛋白的表达及精准转录调控中起到至关重要的作用。由于熊蜂生假丝酵母基因工程方面的研究较少，可用的诱导型启动子非常有限，目前报道可供使用的仅有半乳糖激酶基因的Pgalk启动子（张疆睿, et al., 代谢改造熊蜂生假丝酵母提高酸型槐糖脂产量. 微生物学报, 2019. 59(11):  p. 13.；Liu, J., et al., A Cumulative Effect by Multiple‑Gene Knockout Strategy Leads to a Significant Increase in the Production of Sophorolipids in Starmerella Bombicola CGMCC 1576. Front Bioeng Biotechnol, 2022. 10: p. 818445.）。例如，江南大学张疆睿（张疆睿, et al., 代谢改造熊蜂生假丝酵母提高酸型槐糖脂产量. 微生物学报, 2019. 59(11): p. 13.）等人利用Pgalk诱导性启动子调控Rec蛋白的表达，介导删除six位点之间的Rec蛋白及潮霉素抗性基因，实现潮霉的抗性基因回收。但由于Pgalk诱导水平低，严谨性不强，导致该系统编辑效率低，难以筛选到含有目标基因的工程菌株。编码半乳糖激酶的GAL1基因的遗传调控回路是酿酒酵母中研究最深入和了解最多的调节系统。酿酒酵母中GAL1基因的转录受到严格的调控，在葡萄糖培养生长的细胞中受到抑制，在半乳糖培养生长后被诱导约1000倍。熊峰生假丝酵母中GAL1受D‑半乳糖诱导的效率低，qPCR分析表明GAL1几乎不受D‑半乳糖诱导。因此，在熊峰生假丝酵母中缺乏可用的诱导型启动子工具，也进一步限制了基因工程菌株的开发速度。

发明内容

[0005] 本发明旨在在熊峰生假丝酵母中挖掘碳源依赖型诱导型启动子，并在不同碳源下检测其转录水平，找到可行的诱导型启动子，为在熊蜂生假丝酵母基因转录水平上进行诱导调控提供可用的工具，实现高效基因编辑及表达调控。具体是通过NCBI数据库将熊蜂生假丝酵母基因组信息与酿酒酵母来源碳源依赖型诱导型启动子序列进行比对，检索出对应基因序列。然后，通过qPCR分析不同碳源下基因的转录水平，评估对应的诱导物或抑制物。之后，利用本发明中的启动子构建Recsix基因编辑系统，与Pgalk调控下的Recsix进行比较并分析。找到在熊蜂生假丝酵母基因转录水平上进行诱导调控提供可用的工具，实现高效基因编辑及表达调控。

[0006] 本发明首先提供熊蜂生假丝酵母诱导型启动子，所述启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.1‑4任一所示。

[0007] 本发明的第二个目的是提供一种包含所述启动子的表达载体。

[0008] 进一步地，所述的表达载体为适用于熊蜂生假丝酵母可抗性回收的过表达的载体。

[0009] 进一步地，所述的过表达载体是以含有左右侧同源臂、基因表达盒、Pst1.3‑Recsix的可抗性回收的整合性载体。

[0010] 进一步地，所述的Pst1.3‑Recsix的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示。

[0011] 本发明的第三个目的是提供一种包含所述启动子的熊蜂生假丝酵母。

[0012] 本发明的第四个目的是提供所述启动子在熊蜂生假丝酵母遗传改造中的应用。

[0013] 进一步地，所述的应用是采用所述启动子启动组成型基因的表达。

[0014] 进一步地，所述的应用具体包括如下步骤：

[0015] S1、将待整合位点的左侧同源臂及右侧同源臂、包含来源于pUC‑kana的ori及kana抗性的基因片段、目标基因的过表达盒，重组克隆得到整合型表达载体；

[0016] S2、将S1步骤得到整合型表达载体连接Recsix系统得到可抗性回收的整合型表达载体；

[0017] S3、将所述启动子T4连接S2中Recsix得到新的可抗性回收的整合型表达载体；

[0018] S4、将S3步骤得到的整合型表达载体转入熊蜂生假丝酵母宿主菌中，得到无抗性的过表达的熊蜂生假丝酵母重组菌。

[0019] 本发明丰富了熊蜂生假丝酵母中可用的调控元件，为基因编辑和转录调控提供了新的工具。本发明中的Picl启动子比Pgalk诱导后有更高的转录水平，其活性受到葡萄糖的抑制，受到乙醇及柠檬酸钠的诱导，Picl的诱导性更强。本发明中的Pst1.3启动子相较于Pgalk启动子诱导调控更为严谨，在葡萄糖条件下活性受到抑制，转录水平仅有Pgalk的5%，在不含葡萄糖的环境下诱导表达，D‑半乳糖及乙醇可进一步诱导提高其转录水平。Padh启动子诱导前转录水平低于Pgalk，但D‑半乳糖诱导转录水平更高。Pst1.1与其他启动子不同，其受到葡萄糖的诱导，在不含有碳源的情况下被抑制。本发明解决了熊蜂生假丝酵母（Starmerella bombicola）中诱导型启动子的空白，为在熊蜂生假丝酵母中进行诱导调控提供了全新的工具。

附图说明

[0020] 图1不同培养基中各启动子的相对转录水平。

[0021] 图2 不同启动子诱导前及诱导后的相对转录水平。

[0022] 图3利用Recsix系统构建在pxa1基因座过表达A的无抗菌株。

[0023] 图4A 质粒pGAB1图谱。

[0024] 图4B 质粒pSAB1图谱。

[0025] 图5A 筛选携带Pgalk‑Recsix表达盒转化子。

[0026] 图5B筛选携带Pst1.3‑Recsix表达盒转化子。

[0027] 图6A 筛选Pgalk‑Recsix系统诱导后的无抗转化子。

[0028] 图6B 筛选Pst1.3‑Recsix系统诱导后的无抗转化子。

[0029] 图7 测序验证pxa1基因座。

具体实施方式

[0030] 下面结合实施例对本发明的方法做进一步说明。在实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按照分子生物学领域的常规实验中的条件，或按照质粒、菌株等商品化生产厂商的说明书进行操作。本领域相关的技术人员可以借助实施例更好地理解和掌握本发明。

[0031] 实施例1：碳依赖型诱导启动子的挖掘

[0032] 酿酒酵母是目前研究最深入的真核生物之一，已被报道了较多碳依赖型启动子，一般由特定碳源诱导或抑制（Weinhandl, K., et al., Carbon source dependent promoters in yeasts. Microb Cell Fact, 2014. 13: p. 5.）。本发明基于酿酒酵母来源的天然诱导性启动子，以诱导蛋白序列为母板，与熊蜂生假丝酵母基因组进行比对，检索对应的同源基因，这些基因的上游启动子区域作为潜在的诱导型启动子。本发明中比对工具网址为https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi 。

[0033] 检索到4个来自熊蜂生假丝酵母中的同源蛋白，乙醇脱氢酶2型，与酿酒酵母中ADH2（乙醇脱氢酶2型）蛋白同源性为37.92%；异柠檬酸裂解酶1型，与酿酒酵母中ICL1（异柠檬酸裂解酶1型）同源性为63.84%；ST1.1与ST1.3，与酿酒酵母中Hxt1p（糖转运体）同源性分别为28.88%及31.58%。

[0034] 表1  Blast检索比对同源蛋白

[0035]

[0036] 在酿酒酵母中，这些启动子的诱导物有些是明确的。GAL1基因启动子由D‑半乳糖诱导，在葡萄糖为碳源下被抑制。ADH2基因启动子受到葡萄糖的抑制，ADH2基因启动子在大部分菌种中不受诱导，但在毕赤酵母中分离出一个特异性的ADH2启动子，它不受到葡萄糖调控，而是氧依赖的（低O2水平诱导）。ICL1基因启动子被葡萄糖所抑制，并被乙醇或醋酸盐强烈诱导。ST1.1及ST1.3与酿酒酵母中的己糖转运体高度相似，这些启动子一般在高葡萄糖浓度下被抑制，当葡萄糖浓度下降到一定水平以下时被诱导。在熊峰生假丝酵母中，这些启动子都未被表征，在不同碳源下诱导或抑制情况暂不明确。

[0037] 本文中选用的启动子序列通过序列分析，选取了同源蛋白编码基因与该蛋白上游基因之间的序列作为启动子序列，用于启动蛋白表达。其中，Padh启动子序列如SEQ ID NO.1所示，Picl启动子序列如SEQ ID NO.2所示，Pst1.3启动子序列如SEQ ID NO.3所示，Pst1.1启动子序列如SEQ ID NO.4所示。

[0038] 实施例2：qPCR分析启动子在不同碳源培养下的转录活性

[0039] 测定了不同碳源培养下各启动子的转录活性，包括YPD培养基、无碳源培养基（YP）为YPD培养基不添加葡萄糖，D‑半乳糖培养基（YPG）、乙醇培养基（YPE）及柠檬酸钠培养基（YPA）分别为将YPD中葡萄糖替换为1%的D‑半乳糖、乙醇及柠檬酸钠。

[0040] 表2  本实施例中所用引物

[0041]

[0042] 菌体制备：挑取熊峰生假丝酵母单克隆至YPD培养基中过夜培养，转接至分别含有1%葡萄糖（YPD），1%D‑半乳糖（YPG），1%乙醇（YPE），1%柠檬酸钠（YPA）及不含糖（YP）培养基中培养，取对数生长期的菌体提取RNA测转录水平。

[0043] RNA提取：使用聚合美公司M5 EASYspin 酵母 RNA 快速提取试剂盒提取RNA。

[0044] 1）收集 1ml （约 10 7细胞）处于对数生长期酵母培养物到 1.5ml 离心管， 12,000 rpm 离心 30 秒，尽可能吸弃上清。

[0045] 2）加入 100μl 缓冲液 SE 中（确认已经加入β‑巯基乙醇至终浓度 0.2%），轻柔吹打充分重悬细胞；根据酵母量加入约 20μl 蜗牛酶储液，充分颠倒混匀，37℃温育 15－30 分钟消化细胞壁，中间可颠倒数次帮助消化。

[0046] 3）加入 380μl 裂解液 RLT（确认已经加入β‑巯基乙醇至终浓度 1%），吹打混匀后用手剧烈振荡 20 秒，充分裂解。 一般加入裂解液后充分涡旋吹打后应该见不到明显团块或者不溶物,极少数情况下如果有明显团块或者不溶物可以将裂解物 13,000rpm 离心 3 分钟,沉淀不能裂解的碎片或者不溶物, 将裂解物上清全部转到一个新离心管再进行下一步。加入 280μl 96－100％乙醇，立即吹打混匀，不要离心。

[0047] 4）将混合物加入一个吸附柱 RA 中，（吸附柱放入收集管中）13,000 rpm 离心 30‑60 秒，弃掉废液。

[0048] 5）加 700μl 去蛋白液 RW1，室温放置 30 秒，12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。

[0049] 如果 DNA 残留明显,可在加入 RW1 后室温放置 5 分钟再离心。

[0050] 6）加入 500μl 漂洗液 RW（请先检查是否已加入无水乙醇!），12,000 rpm 离心 30 秒，弃掉废液。加入 500μl 漂洗液 RW,重复一遍。

[0051] 7）将吸附柱 RA 放回空收集管中，13,000 rpm 离心 2 分钟，尽量除去漂洗液, 以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。

[0052] 8）取出吸附柱 RA，放入一个无菌的离心管中，根据预期 RNA 产量在吸附膜的中间部位加 30‑50μl DEPC处理水（事先在70‑90℃水浴中加热可提高产量）， 室温放置 1 分钟，12,000 rpm 离心 1 分钟。

[0053] 9）如果预期 RNA 产量>30μg,加 30‑50μl DEPC处理水 重复步骤 7, 合并两次洗脱液,或者使用第一次的洗脱液加回到吸附柱重复步骤一遍(如果需要 RNA 浓度高)。

[0054] 使用超微量分光光度计检测RNA浓度。

[0055] 反转录：使用TAKARA试剂PrimeScript™ RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)进行反转录获得反应用模板 cDNA。

[0056] 1）去除基因组 DNA 反应

[0057] 按如下成分于冰上配制反应混合液：5×gDNA Eraser Buffer用量2.0 μl，gDNA Eraser用量1.0 μl，总RNA<1 ug，加DEPC处理水至10 μl。

[0058] 先按反应数+2 的量配制预混液，然后再分装到每个反应管中，最后加入 RNA 样品。

[0059] 反应程序：42℃ 2 min（或者室温 5 min），4℃ 恒温。

[0060] 2）反转录反应

[0061] 反应液配制在冰上进行：步骤 1 的反应液的用量10.0 μl，PrimeScript RT Enzyme Mix I的用量1.0 μl，RT Primer Mix 的用量1.0 μl，5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）用量4.0 μl，DEPC处理水的用量4.0 μl，总体积为20 μl。

[0062] 先按反应数+2 的量配制预混液，然后再分装 10 μl 到每个反应管中。轻柔混匀后立即进行反转录反应。

[0063] 反应程序：37℃ 15 min*6 ，85℃ 5 sec ，4℃ 恒温。

[0064] qPCR：使用全式金PerfectStart Green qPCR SuperMix进行荧光定量PCR反应。按下下述配置qPCR反应体系：cDNA模板的用量为1 μl，正向引物 (10 M)用量0.4 μl，反向引物 (10 M)用量0.4 μl，2xPerfectStarr Green qPCR SuperMix的用量10 μl，加DEPC处理水至10 μl。

[0065] 反应程序：94℃ 30 sec，循环段：94℃ 5 sec，50‑60℃，15 sec，72℃，10sec，40‑45个循环。

[0066] 各启动子在YPD培养条件下的转录水平定为1，计算其它碳源培养条件下的相对转录水平。结果图1所示，Pgalk启动子（GenBank: KU172440.1）对碳源的响应最弱，D‑半乳糖条件下Pgalk的转录水平与葡萄糖条件下一致，表明熊蜂生假丝酵母中D‑半乳糖对Pgalk几乎无诱导性。Padh启动子在D‑半乳糖条件下具有较强的诱导性，相对于葡萄糖条件下转录水平提高了三倍。Picl启动子在柠檬酸钠条件下具有最强烈的诱导性，相对于葡萄糖条件下转录水平提升12倍，另外其在乙醇条件下的转录水平也提升了近5倍。Pst1.3启动子受到葡萄糖的抑制，在无糖条件下，相对于葡萄糖条件下转录水平提高了13倍。另外，D‑半乳糖及乙醇对Pst1.3具有诱导性，相对于葡萄糖，D‑半乳糖诱导后转录水平提高19倍，乙醇诱导后转录水平提高21倍。

[0067] 与前面提到的诱导型启动子不同，Pst1.1启动子受到碳源的响应，对葡萄糖的响应最强，乙醇次之，D‑半乳糖最弱(图1)。在环境中不含有碳源的时候，st1.1几乎不表达，D‑半乳糖诱导转录水平提高3.4倍，乙醇诱导转录水平提高8.2倍，葡萄糖诱导转录水平提高20倍。

[0068] 测定了各启动子在诱导前后的转录水平（结果如图2）。以YPD培养条件下内参基因的转录水平定为1，计算各启动子在最佳诱导物诱导前后的相对内参基因的转录水平。其中，Pgalk启动子基础转录水平为内参基因的0.8倍，并且几乎无诱导性。Padh的基础转录活性低于内参基因，诱导后转录水平略高于内参基因。Picl启动子本身基础转录水平是内参基因的6倍，诱导后转录活性是内参基因的80倍。Pst1.1启动子在诱导前及诱导后转录水平均较低。Pst1.3启动子诱导前转录水平很低，相较于内参基因几乎不表达，诱导后转录水平是内参基因的1.3倍。上述结果表明，Picl启动子诱导后的转录水平更高，更适用于蛋白的高水平表达；Pst1.3的基础转录水平更低，更适用于实现基因编辑等精准调控，如Cas9、Rec等基因的转录调控。

[0069] 实施例3：基于诱导型启动子实现高效基因编辑

[0070] 对于筛选标记很少的非模式菌株，抗性回收是实现多轮基因编辑的重要手段。熊峰生假丝酵母就是非模式菌株，可供使用的抗性筛选标记仅有潮霉素和诺尔斯菌素两种目前在熊蜂生假丝酵母中，Pgalk启动子调控下的Recsix系统是唯一可实现抗性回收的多基因编辑系统。但由于Pgalk启动子诱导水平低，严谨性不强，导致该系统编辑效率低，难以筛选到目标工程菌株。本发明基于新挖掘的诱导型启动子，建立高效的抗性回收方法。

[0071] 本发明利用Pst1.3启动子建立了一种高效的抗性回收方法，抗性回收过程如图3所示。在乙醇或D‑半乳糖的条件下，用Pst1.3启动子诱导Rec重组酶表达，Rec重组酶可以识别six序列，并切除两个six序列之间的片段，留下单一的six序列，以此来实现抗性基因的回收利用。由于Pst1.3的低泄露表达量，相较于原有的Recsxi系统，该重组系统电转后阳性转化子数量更多，并且诱导后更高的转录水平使得诱导切除效率更高，提高了近4倍。

[0072] 3.1构建抗性回收表达盒

[0073] 利用本发明中Pst1.3启动子替换原有的Pgalk启动子构建Recsix系统，构建在PXA1基因位点包含Pgalk/Pst1.3‑Recsix系统的A基因过表达盒。Pgalk‑Recsix序列由南京金斯瑞合成，如SEQ ID NO.6所示；Pst1.3‑Recsix序列在Pgalk‑Recsix的基础上构建而成，将Pst1.3启动子替换Pgalk启动子，其序列如SEQ ID NO.5所示，构建过程如下：

[0074] 本实验中的引物：

[0075]

[0076] 利用引物PUC‑Kana‑F、PUC‑Kana‑R以Puc‑kana为模板扩增大肠杆菌中卡那抗性标记基因及ori序列。利用引物PXA1‑ZUOBI‑F、PXA1‑ZUOBI‑R以熊蜂生假丝酵母基因组为模板扩增pXA1基因左侧1KB同源臂序列，同样利用PXA1‑YOUBI‑F、PXA1‑YOUBI‑R扩增pXA1基因右侧1KB同源臂序列。交由南京金斯瑞合成Pgki启动子、A、Ttrpc终止子连接序列，并使用引物Pgki‑F、Ttrpc‑R扩增其全长序列。将上述片段利用全式金pEASY®‑Uni Seamless Cloning and Assembly Kit拼接上述片段并化转至大肠杆菌感受态细胞中。使用引物PXA1‑ZUOBI‑F、PXA1‑ZUOBI‑R进行菌落PCR鉴定，提取质粒进行酶切验证符合预期，构建质粒pAB1。

[0077] 交由南京金斯瑞公司合成Pgalk‑Recsix序列，并克隆至pAB1质粒pAX1右侧同源臂上游，构建质粒pGAB1（图4A）。使用引物SIX‑F1、SIX‑R1以质粒pGAB1为模板线性化载体，使用引物ST1.3‑Apa1‑R、STL1.3‑Asc1‑F1以熊蜂生假丝酵母基因组为模板扩增st1.3基因上游1kb序列作为启动子序列片段，使用Apa1、Asc1限制性核酸内切酶消解上述片段与载体吗，并使用T4连接酶连接上述片段与载体。利用引物ST1.3‑Apa1‑R、STL1.3‑Asc1‑F1进行菌落PCR筛选转化子，提取质粒进行酶切验证符合预期，质粒pSAB1构建完成（图4B）。质粒pSAB1即包含抗性回收表达盒Pst1.3‑Recsix。

[0078] 3.2利用Pst1.3‑Recsix基因编辑系统构建无抗性工程菌株S22214（Ppgki::A,ΔPXA1）

[0079] 本实验中所用的引物

[0080]

[0081] 使用引物PXA1‑ZUOBI‑F、PXA1‑YOUBI‑R分别以pGAB1、pSAB1模板扩增表达盒。将待转化的表达盒和酵母感受态细胞转移至预冷的2mm电转杯中。冰上静置5min后，使用电转仪进行电转，参数为15KV（200Ω），电击时间为5ms。使用1mL预冷的1M山梨醇重悬菌体，30℃，200rpm摇床中培养1.5h。取出200μl菌液涂布至含潮霉素（工作浓度：500mg/L）的YPD平板中，置于28℃培养2d。

[0082] 使用引物YZ‑HYG‑F、YZ‑HYG‑R以转化子菌落作为模板，筛选右交换的重组菌株。如图5A和图5B所示，携带Pst1.3‑Recsix表达盒转化子数量明显优于Pgalk‑Recsix表达盒转化子数量。

[0083] 进一步，将上述阳性转化子在YPG培养基中30℃，200rpm摇床中培养18h，将菌液稀释涂布至YPD平板中。挑选单菌落分别转接至YPD平板及含有潮霉素的平板中，放置于28℃培养箱中培养。24h后，在含有抗生素的平板中无法生长而在平板中生长良好的为目标转化子。结果如图6A所示，Pgalk调控下的Recsix系统转化子共筛选了179个单菌落，其中2个转化子符合预期（画圆圈的转化子）。Pst1.3‑Recsix系统转化子共筛选了79个单菌落，其中4个转化子符合预期（如图6B所示，其中画圆圈的转化子）。结果表明，Pst1.3‑Recsix系统诱导效率是Pgalk‑Recsix系统的4倍。

[0084] 进一步，使用引物YZ‑HYG‑F、YZ‑ZUO‑F扩增目标转化子Pxa1基因座序列，交由生工生物工程股份有限公司进行测序，测序引物为CX‑R1、CX ‑R2。如图7所示，pxa1基因座测序结果显示，six位点已发生重组，已丢失潮霉素抗性基因，基因组仅保留1个six位点。