一种海甘蓝突变基因CaFAE1-3及其在合成芥酸中的应用

摘要

本发明提供了一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3及其在合成芥酸中的应用。本申请采用PCR突变技术，对海甘蓝CaFAE1‑3基因进行了点突变，获得了一个I38V的氨基酸突变体。利用酵母表达系统进行重组表达后，采用GC‑MS对重组菌脂肪酸组分及含量检测发现，突变基因CaFAE1‑3的芥酸合成量比野生型基因CaFAE1‑3提高了约10.17％。

权利要求

1.一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3，其特征在于，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种蛋白CaFAE1‑3，其特征在于，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

3.一种重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体中含有权利要求1所述的海甘蓝突变基因CaFAE1‑3。

4.一种包含权利要求3所述重组表达载体的重组菌，其特征在于，所述的重组表达载体包括大肠杄菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体中的一种。

5.一种包含权利要求3所述重组表达载体的工程化宿主细胞系，其特征在于，所述宿主细胞包括大肠杄菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的一种。

6.权利要求1所述的海甘蓝基因CaFAE1‑3或权利要求3所述重组表达载体或权利要求4所述的重组菌或权利要求5所述的工程化宿主细胞系在合成芥酸中的应用。

7.一种发酵生产芥酸的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：发酵培养权利要求

4所述的重组菌获得发酵菌体，后裂解所述发酵菌体并分离提取获得芥酸。

说明书

一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3及其在合成芥酸中的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物工程技术领域，特别涉及一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3及其在合成芥酸中的应用。

背景技术

[0002] 芥酸是十字花科和金莲科植物种子中积累的特异超长链脂肪酸，难于被人体吸收，营养价值较低，但是在工业上其应用价值广阔，是重要的化工原料。高芥酸菜籽油可以作为工业润滑剂、化妆品、表面活性剂、塑料等的原料，具有广泛的工业用途。国内已有若干专门加工高芥酸菜籽油的生产厂家，其中，四川西普化工股份有限公司生产的高芥酸油占国际市场的1/8，占亚洲市场的60％。按照加工企业的要求，菜籽油中芥酸含量越高越好，高芥酸菜籽油可显著降低加工成本，提高产品质量，进而提高企业效益。

[0003] FAE1基因是控制芥酸生物合成的关键基因，由FAE1基因编码的β‑酮酯酰‑CoA合酶(KCS)是芥酸合成的限速酶。如何制备一种突变的FAE1基因使得编码的β‑酮酯酰‑CoA合酶(KCS)具有更强的催化合成能力，芥酸合成量更高，成为亟待解决的技术问题。

发明内容

[0004] 本发明目的是提供一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3及其在合成芥酸中的应用，海甘蓝突变基因CaFAE1‑3能够合成芥酸且催化效率高，芥酸合成量比野生型基因提高了10.17％。

[0005] 本发明采用如下技术方案：

[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3，所述海甘蓝突变基因CaFAE1‑3的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0007] 在本发明的第二方面，提供了蛋白CaFAE1‑3，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示。

[0008] 在本发明的第三方面，提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体含有所述的海甘蓝突变基因CaFAE1‑3。

[0009] 在本发明的第四方面，提供了一种包含所述重组表达载体的重组菌或工程化细胞系，所述的重组表达载体包括大肠杄菌表达载体、酵母表达载体、枯草杆菌表达载体、乳酸菌表达载体、链霉菌表达载体、丝状真菌表达载体、昆虫表达载体或哺乳动物细胞表达载体中的一种或两种以上；所述宿主细胞包括大肠杄菌宿主细胞、酵母菌宿主细胞、枯草杆菌宿主细胞、乳酸菌宿主细胞、放线菌宿主细胞、丝状真菌宿主细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞中的一种。

[0010] 在本发明的第五方面，提供了所述的海甘蓝基因CaFAE1‑3或所述重组表达载体或所述的重组菌或工程化细胞系在合成芥酸中的应用。

[0011] 本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

[0012] 本发明提供的一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3及其在合成芥酸中的应用，本申请人从植物海甘蓝转录组数据筛选得到的CaFAE1‑3，具有最高的芥酸合成能力，其合成的芥酸占总脂肪酸含量的4.82％，发现其能高效并特异性催化底物油酸和二十碳烯酸产生芥酸，核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。接着本发明采用PCR突变技术，对上述海甘蓝CaFAE1‑3基因进行了点突变，获得了一个I38V的氨基酸突变体。利用酵母表达系统进行重组表达后，采用GC‑MS对重组菌脂肪酸组分及含量检测发现，突变基因CaFAE1‑3的芥酸合成量比野生型基因CaFAE1‑3提高了约10.17％。本发明提供的海甘蓝突变基因CaFAE1‑3，利用工程酵母菌进行蛋白表达，能高效率催化油酸生成芥酸，整个反应过程具有操作简便、安全系数高，生产周期短、效率高、环境友好的优点，为芥酸的工业化高效生产提供重要的参考价值。

附图说明

[0013] 为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其它的附图。

[0014] 图1为野生型与突变型CaFAE1‑3氨基酸序列比对结果；

[0015] 图2为野生型CaFAE1‑3酵母重组表达菌脂肪酸GC‑MS分析结果；

[0016] 图3为突变型CaFAE1‑3酵母重组表达菌脂肪酸GC‑MS分析结果。

具体实施方式

[0017] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。

[0018] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。

[0019] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买获得或者可通过现有方法获得。

[0020] 下面将结合实施例及实验数据对本申请的一种海甘蓝突变基因CaFAE1‑3及其在合成芥酸中的应用进行详细说明。本申请pYES2/NT A质粒为商用载体，购买自Invitrogen公司，货号V8252‑20；大肠杆菌DH5α可市售获得。本申请中，对表达载体的种类和大肠杆菌的菌株没有特殊要求。

[0021] 实施例1、构建CaFAE1‑3突变基因的表达质粒

[0022] 1、获得质粒pYES2/HEBX

[0023] 为避免表达载体标签序列(6×His、XpressTMepitope、Enterokinase(EK)recognition site)影响重组表达目的蛋白的正确折叠和生物学功能，对表达载体pYES2/NT A进行了改造。依据载体序列酶切位点构成及CaFAE1‑3基因序列酶切位点分析结果(均不含EcoRⅠ和BamHⅠ识别序列)，设计了含4个限制性酶切位点(HindⅢ+EcoRⅠ+BamHⅠ+XbaⅠ)的连接头Linker‑F和Linker‑R(见表1)。载体改造流程如下：(1)pYES2/NT A质粒(购买自Invitrogen公司，货号V8252‑20)DNA用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，回收大片段备用；(2)取Linker‑F和Linker‑R各10μL混合于离心管，95℃水浴5min，自然冷却备用；(3)用T4 DNA连接酶构建回收载体大片段与连接头(Linker‑F和Linker‑R)的退火产物的连接体系(10μL)，16℃连接过夜；(4)连接产物转化大肠杆菌，筛选重组子并鉴定，改造后的质粒命名为pYES2/HEBX。

[0024] 表1

[0025] 名称 序列(5’‑3’)Linker‑F AGCTTGGGCCGGAATTCCGGGATCCCGGCT(SEQ ID NO.4)
Linker‑R CTAGAGCCGGGATCCCGGAATTCCGGCCCA(SEQ ID NO.5)
Primer‑F CCGGAATTCATGACGTCCATTAACGTAAAGCTC(SEQ ID NO.6)
Primer‑R CGGGATCCTTAGGACCGACCGTTTTGGG(SEQ ID NO.7)

[0026] 2、采用高保真酶和引物组合Primer‑F和Primer‑R(具体见表1)扩增获得CaFAE1‑3基因编码区DNA序列。用EcoRⅠ+BamHⅠ同时对CaFAE1‑3和质粒pYES2/HEBX进行双酶切，分别回收酶切产物；后用T4 DNA连接酶构建载体与CaFAE1‑3的连接反应体系(10μL)，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌，采用菌落PCR技术鉴定重组子。获得质粒pYES2/HEBX‑CaFAE1‑3。

[0027] 3、同时构建野生型CaFAE1‑3基因的表达质粒作为对照，构建方法如下：Primer‑F和Primer‑R(具体见表1)扩增后用EcoRⅠ+BamHⅠ双酶切和质粒pYES2/HEBX进行双酶切，分别回收酶切产物；后用T4 DNA连接酶构建载体与CaFAE1‑3的连接反应体系(10μL)，16℃连接过夜；连接产物转化大肠杆菌，采用菌落PCR技术鉴定重组子。获得野生型的表达质粒。

[0028] 实施例2、pYES2/HEBX‑CaFAE1‑3质粒的蛋白表达与鉴定

[0029] 1、提取上述经鉴定的突变基因CaFAE1‑3重组质粒DNA，参照酵母菌INVSc1感受态细胞产品说明书进行遗传转化和筛选。挑取单菌落用CaFAE1‑3特异PCR扩增引物组合进行菌落PCR鉴定，阳性菌落用于后续诱导表达分析。诱导表达前，对pYES2/HEBX(空载)和pYES2/HEBX‑CaFAE1‑3酵母转化菌绘制生长曲线，获得的最佳诱导表达条件为：30℃，250rpm，振荡培养16h。诱导培养时间如表2所示。

[0030] 表2

[0031]

[0032] 采用上述最佳诱导表达条件，对CaFAE1‑3酵母转化菌进行培养(50mL)。后于4℃，4000rpm离心6min收集酵母菌体。无菌水重复清洗3次后，菌体置‑80℃冰箱中冷冻8h，然后放入真空冷冻干燥机中干燥。

[0033] 2、芥酸含量的鉴定

[0034] 称取干燥菌体65mg进行脂肪酸甲酯化处理和GC‑MS检测分析。分析条件如下：

[0035] (1)脂肪酸甲酯化处理：

[0036] ①在装有65mg干燥酵母菌体的玻璃试管中，加入1.5mL 2.5％硫酸甲醇溶液，再加入350μL甲苯，旋紧试管盖，确保气密性良好，90℃水浴40min。

[0037] ②将试管静置冷却至室温，加入1mL无菌水和1mL庚烷，剧烈震荡混匀，静置分层。

[0038] ③吸取上层溶液，加入至进样瓶中，封口，待分析。

[0039] (2)GC‑MS分析条件：

[0040] 色谱柱：TG‑FAME(50m×0.25mm×0.20μm)；载气：氦气(99.999％)；流速：0.63mL/min；进样量：1.0μL；分流比：30:1；进样口温度：270℃；升温程序：80℃(保持1min)，以20℃/min速率升高到160℃(保持1.5min)，再以3℃/min的速率升高到250℃(保持3min)。离子化方式：电子轰击(EI)；离子化能量70eV；传输线温度260℃；离子源温度280℃；扫描范围：50～350amu(atomic mass unit)。

[0041] 野生型CaFAE1‑3酵母重组表达菌脂肪酸GC‑MS分析结果如图2所示；由图2可知，野生型CaFAE1‑3酵母中芥酸相对含量为4.82％。

[0042] 突变型CaFAE1‑3酵母重组表达菌脂肪酸GC‑MS分析结果如图3所示，由图3可知，突变型CaFAE1‑3酵母中芥酸相对含量为5.31％。

[0043] 由此可知，本申请中突变型CaFAE1‑3酵母重组的芥酸合成量比野生型基因提高了10.17％。

[0044] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

[0045] 最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

[0046] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。

[0047] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。