一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒

摘要

本发明涉及EBV检测技术领域。本发明提供了一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、NTC、野生型质控品和突变型质控品。本发明的试剂盒可以稳定检出10copies的单基因型标本。杂合型样本中，LMP1突变型的低频基因型灵敏度为5％。其他4种EBV高危型的低频基因型灵敏度为1％。样本投入量少，仅需要10copies；低频基因型灵敏度高，最高可检测1％的杂合型高危型；成本低，检测过程简单快速。

权利要求

1.一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，其特征在于，包括如下组分：热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、NTC、野生型质控品和突变型质控品；

所述通用引物包括：

BALF2_162215C分型的引物、BALF2_162476C分型的引物、BALF2_163364T分型的引物、RPMS1_155391A分型的引物和LMP1_del分型的引物；

所述BALF2_162215C分型的引物如SEQ ID NO.1 SEQ ID NO.2所示；

~

所述BALF2_162476C分型的引物如SEQ ID NO.3 SEQ ID NO.4所示；

~

所述BALF2_163364T分型的引物如SEQ ID NO.5 SEQ ID NO.6所示；

~

所述RPMS1_155391A分型的引物如SEQ ID NO.7 SEQ ID NO.8所示；

~

所述LMP1_del分型的引物如SEQ ID NO.9 SEQ ID NO.10所示。

~

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述热启动Taq酶系统的酶为高特异性、具有5’‑3’外切活性的热启动酶。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述荧光探针包括：BALF2_162215C分型的探针、BALF2_162476C分型的探针、BALF2_163364T分型的探针、RPMS1_155391A分型的探针和LMP1_del分型的探针。

4.根据权利要求3所述的试剂盒，其特征在于，所述BALF2_162215C分型的探针如SEQ ID NO.11所示；

所述BALF2_162476C分型的探针如SEQ ID NO.12所示；

所述BALF2_163364T分型的探针如SEQ ID NO.13所示；

所述RPMS1_155391A分型的探针如SEQ ID NO.14所示；

所述LMP1_del分型的探针如SEQ ID NO.15所示。

5.根据权利要求4所述的试剂盒，其特征在于，所述NTC为无菌水。

6.根据权利要求5所述的试剂盒，其特征在于，所述野生型质控品和突变型质控品为含有目标序列的pUC57‑Amp质粒。

7.根据权利要求6所述的试剂盒，其特征在于，所述野生型质控品中的目标序列为SEQ ID NO.16，所述突变型质控品中的目标序列为SEQ ID NO.17。

8.根据权利要求1 7任意一项所述的试剂盒，其特征在于，所述EBV高危型分型为~BALF2_162215C、BALF2_162476C、BALF2_163364T、RPMS1_155391A和LMP1_del。

说明书

一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及EBV检测技术领域，尤其涉及一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

[0002] 鼻咽癌(nasopharyngeal carcinoma,NPC)是起源于鼻咽上皮细胞的恶性肿瘤。鼻咽癌与EBV感染密切相关，大约90％的人在年幼时感染过EBV，鼻咽癌高风险人群的EBV感染率在60％以上，几乎所有的鼻咽癌患者均与EBV感染相关。研究发现，EBV高危亚型与鼻咽癌有强相关性，通过检测EBV高危型分型，有助于鼻咽癌的早期筛查。

[0003] 传统的NGS测序至少需要100copies，低频基因型灵敏度至少15％以上；成本高，检测过程繁琐，并且周期长。因此，急需开发新型检测产品。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，快速、准确、灵敏的检测EBV高危型分型。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，包括如下组分：热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、NTC、野生型质控品和突变型质控品。

[0007] 作为优选，所述热启动Taq酶系统的酶为高特异性、具有5’‑3’外切活性的热启动酶。

[0008] 作为优选，所述通用引物包括：

[0009] BALF2_162215C分型的引物、BALF2_162476C分型的引物、BALF2_163364T分型的引物、RPMS1_155391A分型的引物和LMP1_del分型的引物中的一种或多种。

[0010] 作为优选，

[0011] 所述BALF2_162215C分型的引物如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.2所示；

[0012] 所述BALF2_162476C分型的引物如SEQ ID NO.3～SEQ ID NO.4所示；

[0013] 所述BALF2_163364T分型的引物如SEQ ID NO.5～SEQ ID NO.6所示；

[0014] 所述RPMS1_155391A分型的引物如SEQ ID NO.7～SEQ ID NO.8所示；

[0015] 所述LMP1_del分型的引物如SEQ ID NO.9～SEQ ID NO.10所示。

[0016] 作为优选，所述荧光探针包括：

[0017] BALF2_162215C分型的探针、BALF2_162476C分型的探针、BALF2_163364T分型的探针、RPMS1_155391A分型的探针和LMP1_del分型的探针中的一种或多种。

[0018] 作为优选，

[0019] 所述BALF2_162215C分型的探针如SEQ ID NO.11所示；

[0020] 所述BALF2_162476C分型的探针如SEQ ID NO.12所示；

[0021] 所述BALF2_163364T分型的探针如SEQ ID NO.13所示；

[0022] 所述RPMS1_155391A分型的探针如SEQ ID NO.14所示；

[0023] 所述LMP1_del分型的探针如SEQ ID NO.15所示。

[0024] 作为优选，所述NTC为无菌水。

[0025] 作为优选，所述野生型质控品和突变型质控品为含有目标序列的pUC57‑Amp质粒。

[0026] 作为优选，所述野生型质控品中的目标序列为SEQ ID NO.16，所述突变型质控品中的目标序列为SEQ ID NO.17。

[0027] 作为优选，所述EBV高危型分型为BALF2_162215C、BALF2_162476C、BALF2_163364T、RPMS1_155391A和LMP1_del。

[0028] 本发明提供了一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、NTC、野生型质控品和突变型质控品。本发明的试剂盒可以稳定检出10copies的单基因型标本。杂合型样本中，LMP1突变型的低频基因型灵敏度为5％。其他4种EBV高危型的低频基因型灵敏度为1％。样本投入量少，仅需要10copies；低频基因型灵敏度高，最高可检测1％的杂合型高危型；成本低，检测过程简单快速。

附图说明

[0029] 图1为标本人基因组定量检测结果；

[0030] 图2为EBV DNA定量检测结果；

[0031] 图3为管1的4个WT质控品的阈值线设置图；

[0032] 图4为管1的4个MT质控品的扩增曲线图；

[0033] 图5为管1检测3个突变基因型的阈值线设置图；

[0034] 图6为管1，4个MT质控品各有3条扩增曲线的扩增曲线图；

[0035] 图7为管1B95‑8的检测结果图；

[0036] 图8为管2BALF2_162215C的4个MT质控品的阈值线设置图；

[0037] 图9为管2BALF2_162215C的4个WT质控品的扩增曲线图；

[0038] 图10为管2BALF2_162215C B95‑8的检测结果图；

[0039] 图11为管2LMP1_del的4个WT质控品的阈值线设置图；

[0040] 图12为管2LMP1_del的4个MT质控品的扩增曲线图；

[0041] 图13为管2LMP1_del B95‑8的检测结果图。

具体实施方式

[0042] 本发明提供了一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，包括如下组分：热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、NTC、野生型质控品和突变型质控品。

[0043] 在本发明中，所述热启动Taq酶系统的酶优选为高特异性、具有5’‑3’外切活性的热启动酶。

[0044] 在本发明中，所述通用引物优选包括：

[0045] BALF2_162215C分型的引物、BALF2_162476C分型的引物、BALF2_163364T分型的引物、RPMS1_155391A分型的引物和LMP1_del分型的引物中的一种或多种。

[0046] 在本发明中，

[0047] 所述BALF2_162215C分型的引物为：

[0048] 162215_F：ACAGCATCAGCACCTTGG，

[0049] 162215_R：AGCCCACCTGCGACCTG；

[0050] 所述BALF2_162476C分型的引物为：

[0051] 162476_F：GGGTTGTCATTCTCATAGCACATAC

[0052] 162476_R：GCCAAGAACAACATCACCTACAAG；

[0053] 所述BALF2_163364T分型的引物为：

[0054] 163364_F：AGACTCTCCTTGCCCTGAC；

[0055] 163364_R：CCCTGTTTGCCGACTGTG；

[0056] 所述RPMS1_155391A分型的引物为：

[0057] 155391_F：ACCAGAGGACGCAGGATA；

[0058] 155391_R：CGAGTACGACTGTGAGGTG；

[0059] 所述LMP1_del分型的引物为：

[0060] LMP1_F：GTGGGGGTCGTCATCATCTC；

[0061] LMP1_R：GACGGAAGAGGTTGAAAACAAAGG。

[0062] 在本发明中，荧光通道选择FAM，VIC，ROX，CY5.5任意一种，荧光探针为Taqman普通探针和MGB探针，FAM、VIC、ROX的淬灭基团均为MGB，CY5.5的淬灭基团为BHQ3。

[0063] 在本发明中，所述荧光探针优选包括：

[0064] BALF2_162215C分型的探针、BALF2_162476C分型的探针、BALF2_163364T分型的探针、RPMS1_155391A分型的探针和LMP1_del分型的探针中的一种或多种。

[0065] 在本发明中，

[0066] 所述BALF2_162215C分型的探针为：162215C_WT_P：CCGTACACCCGGCCC；

[0067] 所述BALF2_162476C分型的探针为：162476C_MT‑P：TGAAGACGGGGCA，所述核苷酸序列第七位的C为锁核酸；

[0068] 所述BALF2_163364T分型的探针为：163364T_MT_P：CCCGTATGGCTGC，所述核苷酸序列第六位的A为锁核酸；

[0069] 所述RPMS1_155391A分型的探针为：155391A_MT_P：TCCCCCAAACACTCG；

[0070] 所述LMP1_del分型的探针为：LMP1‑MT‑P：ATGACAGACGGTGACAGTGATGATCCACACC。

[0071] 在本发明中，所述探针包括两种荧光基团，一种报告荧光，一种淬灭荧光。所述报告荧光选自FAM、HEX/VIC/HEX/、TAMRA、Cy3、Cy5、CY5.5、Texax、ROX，所述淬灭荧光，选自BHQ1、BHQ2与BHQ3。

[0072] 在本发明中，检测人基因组DNA作为标本质控，探针标记为CY5和BHQ3。引物探针如下：

[0073] Human‑F：CCTGTCTTGTAACCTTGATACCA(SEQ ID NO.18)

[0074] Human‑R：TGAGGAGAAGTCTGCCGTTA(SEQ ID NO.19)

[0075] Human‑P：ACCAACTTCATCCACGTTCACCTTGCC(SEQ ID NO.20)。

[0076] 在本发明中，检测EBV DNA作为标本质控，探针标记为ROX和BHQ2。引物探针如下：

[0077] EBV_F：GTCACGTAGAAAGGACTACCGA(SEQ ID NO.21)

[0078] EBV_R：GGTTGTAAAGGGAGGTCTTACTACC(SEQ ID NO.22)

[0079] EBV_P：CCATATACGAACACACCGGCGACCCA(SEQ ID NO.23)。

[0080] 在本发明中，所述NTC优选为无菌水。

[0081] 在本发明中，所述野生型质控品和突变型质控品优选为含有目标序列的pUC57‑Amp质粒。

[0082] 在本发明中，所述野生型质控品中的目标序列优选为GTAGTTCTCCCTCCTGGTAGTGGACTTGATGAAGCTGTTCTGGAGGGCGGCGTTCTCCCCCGTGAAGACCACCCTGTTCTTGATCTTGATGTTCCTGGGGCACAGCATCAGCACCTTGGACATGCGCACCGGCAGCCGCCGGCCGTACACCCGGCCCTGCAGGGCCGCGTCGAGGTCTGGCAGGTCGCAGGTGGGCTCCCCATGCACCACCTTGGCCTCCTTGGCCGTGAGGACCCCCTTGTCGATGGCCAGGCTCCTAAAGTTGGTGCACAGCGTCTGGTAGTGACCCTTTAGCCACTAGTTGGTGCACAGCGTCTGGTAGTGACCCTTTAGCCACTCTGGGGGGCTCTGGCCAAGCCCGGGGTTGTCATTCTCATAGCACATACAGATGGGCAGGGAGATGTCCTGCAGGATGGTCAGCAGTGAGCGGTAAAACAACTGGGTGAAGATGGGGCAGGCGGGCTGCGCAAAGGGGTTGCACGAGTACTGCATCACGTGGTAGCAGCTCTTGACCAGGTCCTTGTAGGTGATGTTGTTCTTGGCCATGCTGTTCATAAACTGGACCACTTCGGCGTCCACCGCCGCATCCACGTCCTTGAGTGGGTCATGTAGAAACTGTTAAAGAGACTCTCCTTGCCCTGACCGGTTGACTTCGAGACCCCCGAGACGTAAAGGACGGAATTGGTGGCAAAGATCTGCGTGGACACGTGGGGGGCCAGGCTGGCATTATATCGGTGTAACGCAGCCACACGGGCCTCTGGGCCCTCACAGTCGGCAAACAGGGGCCAAGAGTCGTAGTTGAGGCTTGCCGGGGTCTCGTGCGAGGCCTCCAGCATGGCGGGCGCGTAACTCACCGCCAGCTCGCAGGCCGCGCTGTCCACAATCATTAAGGCTCCCGACCTCAACCCCCTCTATGTCTTCGCAGGTGCCCAGCGTCAGCAGGATGCGCCTATAGCGCCCGGCCTCCTCCCCTGTCGACCAGAGGACGCAGGATATCTGCAGGATCAGGTCAGCCTCGTTGGTGGCCGTGGGGAAGCCCTCCTCCCCCAGACACTCGATATCGAAGGCCAGGGCCTGGTAGGAGGGCCAGGAGCTGTCTTCACGCCGGACCGAGAGGTCGCCCACCTCACAGTCGTACTCGAGCTCGGCGTACGAGTCCCGGTGCTGGAGGCGGGGGATGGCGCGGCGGCAGCTGTACCGTCACGTAGAAAGGACTACCGACGAAGGAACTTGGGTCGCCGGTGTGTTCGTATATGGAGGTAGTAAGACCTCCCTTTACAACCCAAGCCTATGACATGGTAATGCCTAGAAGTAAAGAAAGGTTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAACTGGGCCGTGGGGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAGTACCCAAAAGCAGCGTAGGAAGGTGTGGATCACCGCCGCCATGGCCGGAATCATGACTATGACCGCCGCCTCCGTCTGTCATCAAAGGCGGGCCCTGGTCACCTCCTTTGTTTTCAACCTCTTCCGTCAAATTTGGAGGGCCTCCATCATTTCCAGCAGAGTCGCTAGGGTTATGAGGCAGCGGGTCATGTGGGCC

[0083] 在本发明中，所述突变型质控品中的目标序列优选为TGTAGTTCTCCCTCCTGGTAGTGGACTTGATGAAGCTGTTCTGGAGGGCGGCGTTCTCCCCCGTGAAGACCACCCTGTTCTTGATCTTGATGTTCCTGGGGCACAGCATCAGCACCTTGGACATGCGCACCGGCAGCCGCCGGCCGTACAACCGGCCCTGCAGGGCCGCGTCGAGGTCTGGCAGGTCGCAGGTGGGCTCCCCATGCACCACCTTGGCCTCCTTGGCCGTGAGGACCCCCTTGTCGATGGCCAGGCTCCTAAAGTTGGTGCACAGCGTCTGGTAGTGACCCTTTAGCCACTAGTTGGTGCACAGCGTCTGGTAGTGACCCTTTAGCCACTCTGGGGGGCTCTGGCCAAGCCCGGGGTTGTCATTCTCATAGCACATACAGATGGGCAGGGAGATGTCCTGCAGGATGGTCAGCAGTGAGCGGTAAAACAACTGGGTGAAGACGGGGCAGGCGGGCTGCGCAAAGGGGTTGCACGAGTACTGCATCACGTGGTAGCAGCTCTTGACCAGGTCCTTGTAGGTGATGTTGTTCTTGGCCATGCTGTTCATAAACTGGACCACTTCGGCGTCCACCGCCGCATCCACGTCCTTGAGTGGGTCATGTAGAAACTGTTAAAGAGACTCTCCTTGCCCTGACCGGTTGACTTCGAGACCCCCGAGACGTAAAGGACGGAATTGGTGGCAAAGATCTGCGTGGACACGTGGGGGGCCAGGCTGGCATTATATCGGTGTAACGCAGCCATACGGGCCTCTGGGCCCTCACAGTCGGCAAACAGGGGCCAAGAGTCGTAGTTGAGGCTTGCCGGGGTCTCGTGCGAGGCCTCCAGCATGGCGGGCGCGTAACTCACCGCCAGCTCGCAGGCCGCGCTGTCCACAATCATTAAGGCTCCCGACCTCAACCCCCTCTATGTCTTCGCAGGTGCCCAGCGTCAGCAGGATGCGCCTATAGCGCCCGGCCTCCTCCCCTGTCGACCAGAGGACGCAGGATATCTGCAGGATCAGGTCAGCCTCGTTGGTGGCCGTGGGGAAGCCCTCCTCCCCCAAACACTCGATATCGAAGGCCAGGGCCTGGTAGGAGGGCCAGGAGCTGTCTTCACGCCGGACCGAGAGGTCGCCCACCTCACAGTCGTACTCGAGCTCGGCGTACGAGTCCCGGTGCTGGAGGCGGGGGATGGCGCGGCGGCAGCTGTACCGTCACGTAGAAAGGACTACCGACGAAGGAACTTGGGTCGCCGGTGTGTTCGTATATGGAGGTAGTAAGACCTCCCTTTACAACCGGAGAGTCAGTCAGGCAAGCCTATGACATGGTAATGCCTAGAAGTAAAGAAAGGTTAGTCATAGTAGCTTAGCTGAACTGGGCCGTGGGGGTCGTCATCATCTCCACCGGAACCAGAAGTACCCAAAAGCAGCGTAGGAAGGTGTGGATCACCGCCGCCACCGTCTGTCATCGAAGGCGGGTCCCGGTCACCTCCTTTGTTTTCAACCTCTTCCGTCAAATTTGGAGGGCCTCCATCATTTCCAGCAGAGTCGCTAGGGTTATGAGGCAGCGGGTCATGTGGGCCATTGTCATCAGTGTT。

[0084] 在本发明中，所述EBV高危型分型优选为BALF2_162215C、BALF2_162476C、BALF2_163364T、RPMS1_155391A和LMP1_del。

[0085] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0086] 实施例1

[0087] 标本：64例病例(活检确诊为鼻咽癌)的鼻咽刷子和56例对照(鼻咽癌高风险人群)的鼻咽刷子。参加本次研究的个体已获得本次研究的知情同意书。

[0088] 使用QIAGEN公司的QIAamp DNA Blood Mini kit(51106)从鼻咽刷子中提取DNA，实验流程完全按照试剂盒说明书进行，最终DNA溶解于100μL的AE溶液。

[0089] PCR酶、dNTPs购自生工生物工程(上海)股份有限公司，货号B110004。分别取2.5ul DNA溶液进行人基因组(标本质控)和EBV DNA检测，2个PCR程序均为95℃10min；95℃30s，61.5℃30s(收集荧光)，循环45次。人基因组定量的qPCR的体系如表1所示；EBV DNA定量的qPCR的体系如表2所示。

[0090] 表1

[0091] 人基因组定量 体积(ul)HiTaq Buffer 4
Solution(10x) 2
dNTPs(25mmol/L) 0.16
Human‑F(10uM) 0.48
Human_R(10uM) 0.48
Human_P(10uM) 0.24
灭菌水 7.44
HiTaq Polymerase 0.2
DNA 5
total 20

[0092] 表2

[0093]

[0094]

[0095] 120例标本均能检测到人基因组，CT值在22左右，如图1所示。120例标本检测均为EBV DNA阳性，如图2所示。

[0096] 实施例2

[0097] 测试标本：4个WT质控品，4个MT质控品，2个NTC，B95‑8标本(作为已知野生型的EBV标本)

[0098] 多重PCR酶购自北京擎科生物科技有限公司，货号TSE301。引物探针、浓度和程序经过反复设计优化调整，2个PCR体系如表3、表4所示，2个PCR体系的程序如下95℃3min；95℃15s，60℃30s(收集荧光)，循环45次。

[0099] 表3

[0100]

[0101]

[0102] 表4

[0103]管2 体积(ul)
2×T5Fast qPCR Mix(TSE301) 10
LMP1_F(10uM) 0.2
LMP1_R(10uM) 0.2
LMP1‑MT‑P(10uM) 0.3
162215_F(10uM) 0.2
162215_R(10uM) 0.2
162215C_WT_P(10uM) 0.2
水 3.7
样本 5
Total 20

[0104] PCR完成后，调整部分基线异常的扩增曲线和调整阈值。比如管1检测RPMS1_155391A‑MT突变基因型，需要将阈值线设置在4个WT质控品之上，如图3；调整阈值线后，RPMS1_155391A‑MT基因型的4个MT质控品和4个WT质控品的扩增曲线如图4。

[0105] 管1的荧光PCR结果：管1检测3个突变基因型(BALF2 162476C，BALF2_163364T，RPMS1_155391A)，将阈值线分别设置在4个WT质控品之上，如图5；NTC和4个WT质控品无CT值(阴性)，4个MT质控品各有3条扩增曲线，如图6。B95‑8(野生型)在管1检测3个突变基因型中，扩增曲线均低于阈值线，表现为无CT值(阴性)，如图7。

[0106] 管2的荧光PCR结果：管2检测1个野生基因型(BALF2_162215C)，1个突变基因型(LMP1‑del)。将BALF2_162215C阈值线设置在4个MT质控品之上，如图8；NTC和4个MT质控品无CT值(阴性)，4个WT质控品各有1条扩增曲线，如图9。将LMP1‑MT阈值线设置在4个WT质控品之上，如图10；NTC和4个WT质控品无CT值(阴性)，4个MT质控品各有1条扩增曲线，如图11。B95‑8(野生型)在管2检测1个野生基因型和1个突变基因型中，BALF2_162215C有扩增曲线，如图12；LMP1‑del无扩增曲线，如图13。

[0107] 实施例3

[0108] 为了测试5个EBV高危型分型多重PCR检测的检测灵敏度(检测下限)和低频基因型灵敏度，野生型(WT)质控品和突变型(MT)质控品分别稀释成6个梯度，PCR分别投入1，10，10^2，10^3，10^4，10^5，10^6copies的WT质控品和MT质控品，重复3个。WT质控品和MT质控品按照1％，5％，10％，90％，95％，99％的比例混合，PCR分别检测混合的样本，重复3个。

[0109] 5个EBV高危型分型多重PCR检测技术(灵敏度)可以稳定检出10copies的单基因型标本。杂合型样本中，LMP1突变型的低频基因灵敏度为5％。其他4种EBV高危型的低频基因型灵敏度为1％。

[0110] 实施例4

[0111] 实施例1的120例EBV DNA阳性标本按照实施例2的实验流程进行检测。PCR截断值设置为40，ct值<40为阳性，ct值≥40为阴性。PCR结果示意图如表5。

[0112] 表5

[0113]

[0114]

[0115] 实施例5

[0116] 为了对新开发的5个EBV高危型分型多重PCR检测技术进行验证，将实施例1的120例的鼻咽刷子标本取20ul DNA进行NGS测序。测序公司为上海茂槿生物技术有限公司，检测方法为多重PCR扩增高通量测序技术。位点覆盖的平均深度为985X，覆盖大于20X的位点比例为0.94。设置测序的突变截断值：突变深度/总深度<15％为野生型，15％≤突变深度/总深度≤85％为杂合型，突变深度/总深度≥85％为纯合突变型。5个EBV高危型分型多重PCR检测结果与测序结果，按照是否检出高危型进行比较。比如PCR检出某个高危野生型，测序结果检出野生型或者杂合型，2种方法的结果算一致；如果PCR未检出某个高危野生型，表示为/，测序结果为纯合突变型，2种方法的结果算一致，结果如表6所示。120例5个EBV高危型分型多重PCR与测序平均一致率为95.3％，高危型分型多重PCR检测技术准确可靠。

[0117] 表6测序与PCR一致率

[0118]

[0119] 由以上实施例可知，本发明提供了一种EBV高危型分型荧光PCR检测试剂盒，所述试剂盒包括如下组分：热启动Taq酶系统、通用引物、荧光探针、NTC、野生型质控品和突变型质控品。本发明的试剂盒可以稳定检出10copies的单基因型标本。杂合型样本中，LMP1突变型的低频基因型灵敏度为5％。其他4种EBV高危型的低频基因型灵敏度为1％。样本投入量少，仅需要10copies；低频基因型灵敏度高，最高可检测1％的杂合型高危型；成本低，检测过程简单快速。

[0120] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。