一种抗HA标签的单克隆抗体及其应用

摘要

本发明公开了一种抗HA标签的单克隆抗体及其应用，包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；重链CDR1包括SEQ ID NO:1所示氨基酸序列或由其组成；重链CDR2包括SEQ ID NO:2所示序列或由其组成；重链CDR3包括SEQ ID NO:3所示序列或由其组成；轻链CDR1包括SEQ ID NO:4所示序列或由其组成；轻链CDR2包括SEQ ID NO:5所示序列或由其组成；轻链CDR3包括SEQ ID NO:6所示序列或由其组成；其效价可达1.48×106，亲和力达1.333E‑8，抗体活性高，具有极大地应用潜力。

权利要求

1.一种抗HA标签的单克隆抗体，其特征在于，包括3个重链的互补决定区：重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及3个轻链的互补决定区：轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；

所述重链CDR1为SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列S‑Y‑G‑M‑S；

所述重链CDR2为SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列Y‑I‑S‑D‑G‑G‑V‑R‑T‑Y‑Y‑P‑D‑T‑I‑K‑G；

所述重链CDR3为SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列H‑R‑G‑Y‑D‑G‑G‑M‑D‑Y；

所述轻链CDR1为SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列R‑A‑S‑A‑S‑V‑I‑A‑M‑H；

所述轻链CDR2为SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列A‑T‑S‑S‑L‑A‑S；

所述轻链CDR3为SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列Q‑H‑W‑S‑R‑N‑P‑L‑T。

2.如权利要求1所述的抗HA标签的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体，其重链可变区中FR1‑4依次为以下氨基酸序列：包括如SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列或由其组成，或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的序列具有至少80％，85％，90％同一性的序列，或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变的序列。

3.如权利要求2所述的抗HA标签的单克隆抗体，其特征在于，所述重链可变区中FR1‑4依次为以下氨基酸序列：如SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列，

或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列具有至少91％，92％，93％，94％，95％，

96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变的氨基酸序列；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。

4.如权利要求1至3任意一项所述的抗HA标签的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体，其轻链可变区中FR1‑4依次为以下氨基酸序列：包括如SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列或由其组成，或者与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的序列具有至少80％，85％，90％同一性的序列，或者与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变的序列。

5.如权利要求4所述的抗HA标签的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区中FR1‑4依次为以下氨基酸序列：如SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列具有至少91％，92％，93％，94％，

95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列，或者与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变的氨基酸序列；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。

6.如权利要求5所述的抗HA标签的单克隆抗体，其特征在于，所述抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

7.一种含有编码如权利要求6所述抗HA标签的单克隆抗体的核酸序列的生物材料，其特征在于，所述生物材料，包括表达载体、表达盒、宿主细胞、工程菌或杂交瘤细胞株。

8.一种如权利要求6所述抗HA标签的单克隆抗体在检测、分离和纯化HA标记的靶蛋白中的应用。

9.一种检测试剂盒，其特征在于，包含如权利要求6所述抗HA标签的单克隆抗体。

说明书

一种抗HA标签的单克隆抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于分子免疫学领域，更具体地，涉及一种抗HA标签的单克隆抗体及其应用。

背景技术

[0002] HA标签(HA‑tag)是一种基于人流感病毒血凝素(HA)抗原的蛋白标签，其化学本质是一段来自于流感病毒血凝素(HA)蛋白第98～106位氨基酸的短序列(氨基酸序列：
YPYDVPDYA)，其分子量为1.1KDa，是目前广泛应用的表位标签之一。一般采用分子生物学手
段将HA标签融合到目的蛋白的C端或N端，再利用HA标签抗体特异识别C末端或N末端带有HA
标签的融合蛋白，通常可用于检测和HA tag融合表达蛋白的表达、细胞内定位，以及纯化、
定性或定量检测HAtag融合表达蛋白等，即HA标签抗体可用于HA标记的靶蛋白的检测、分离
和纯化，而无需蛋白特异性抗体或探针。目前，HA标签抗体是蛋白质表达和细胞生物学研究
中最常用的抗体之一。但是，目前商品化抗HA标签蛋白的单克隆抗体种类较少，且价格十分
昂贵。因此，研究更多的抗HA标签的单克隆抗体，在融合蛋白质的表达检测、定位、免疫吸附及分离纯化中具有广阔的应用前景。

发明内容

[0003] 针对现有技术的以上缺陷或改进需求，本发明提供了一种抗HA标签的单克隆抗体及其应用，其目的在于通过流感病毒血凝素(HA)的氨基酸残基YPYDVPDYA (98‑106)的合成
肽与钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin,KLH)偶联作为抗原，刺激小鼠产生抗体，
在其体内发现一种高效价的HA抗体，通过该抗体可变区基因克隆及测序，获得该抗体重链
和轻链互补决定区的氨基酸序列，以此为基础制备抗HA标签的单克隆抗体，由此解决现有
抗HA标签蛋白的单克隆抗体种类较少，价格昂贵的技术问题。

[0004] 为实现上述目的，按照本发明的一个方面，提供了一种抗HA标签的单克隆抗体，其包括3个重链的互补决定区：重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，以及3个轻链的互补决定区：
轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；

[0005] 所述重链CDR1包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列S‑Y‑G‑M‑S或由其组成；

[0006] 所述重链CDR2包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列Y‑I‑S‑D‑G‑G‑V‑R‑T‑Y‑Y‑P‑D‑T‑I‑K‑G或由其组成；

[0007] 所述重链CDR3包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列H‑R‑G‑Y‑D‑G‑G‑M‑D‑Y或由其组成；

[0008] 所述轻链CDR1包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列R‑A‑S‑A‑S‑V‑I‑A‑M‑H或由其组成；

[0009] 所述轻链CDR2包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列A‑T‑S‑S‑L‑A‑S或由其组成；

[0010] 所述轻链CDR3包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列Q‑H‑W‑S‑R‑N‑P‑L‑T或由其组成。

[0011] 优选地，所述抗HA标签的单克隆抗体，其所述抗体，其重链可变区包括以下氨基酸序列：

[0012] 包括如SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列或由其组成、与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的序列具有至少80％，85％，90％同一性的序列、或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变的序列。

[0013] 优选地，所述抗HA标签的单克隆抗体，其所述重链可变区包括以下氨基酸序列：

[0014] 包括如SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列、与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列具有至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变的氨基酸序列；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。

[0015] 优选地，所述抗HA标签的单克隆抗体，其所述抗体，其轻链可变区包括以下氨基酸序列：

[0016] 包括如SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列或由其组成、与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的序列具有至少80％，85％，90％同一性的序列、或者与SEQ ID NO:11，12，
13，14所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变的序列。

[0017] 优选地，所述抗HA标签的单克隆抗体，其所述轻链可变区包括以下氨基酸序列：

[0018] 包括如SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列、与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列具有至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列、或者与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变的氨基酸序列；所述氨基酸突变，为保守突变，包括置换，插入或缺失。

[0019] 优选地，所述抗HA标签的单克隆抗体，其所述抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

[0020] 按照本发明的另一方面，还提供了一种编码如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体或其抗体片段的核酸序列，其所述核酸序列，包括基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片
段寡核苷酸。

[0021] 按照本发明的另一方面，还提供了一种含有编码如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体或其抗体片段核酸序列的生物材料，其所述生物材料，包括表达载体、表达盒、宿主细
胞、工程菌或杂交瘤细胞株。

[0022] 按照本发明的另一方面，还提供了一种如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体在检测、分离和纯化HA标记的靶蛋白中的应用。

[0023] 按照本发明的另一方面，还提供了一种检测试剂盒，其包含如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体。

[0024] 总体而言，通过本发明所构思的以上技术方案与现有技术相比，由于本发明通过HA与KLH结合作为抗原刺激小鼠，在其体内发现一种效价高的抗HA的抗体，能够取得下列有
益效果：

[0025] 本发明通过HA抗原刺激小鼠，在其体内发现一种效价高达的腹水抗体，其效价可6
达1.48×10，通过该抗体可变区基因克隆及测序，获得重链和轻链互补决定区的氨基酸序
列，采用重组技术制备抗HA标签的单克隆抗体，经测定，本发明提供的抗HA标签的单克隆抗
体的亲和力KD为1.333E‑8，纯化后的抗HA标签的单克隆抗体亲和力好、活性高，市场前景应用广阔。

附图说明

[0026] 图1是抗HA标签的单克隆抗体的重链和轻链的氨基酸序列。

具体实施方式

[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于
限定本发明。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及到的技术特征只要彼此之
间未构成冲突就可以相互组合。

[0028] 整个抗体分子可分为恒定区(C区)和可变区(V区)两部分，不同抗体V区的氨基酸组成和排列序列不同，其中VH和VL各有3个区域的氨基酸组成和排列顺序特别易变化，这些
区域称为HVR。VH和VL的三个HVR共同组成Ig的抗原结合部位，即重链和轻链可变区内的高
变区构成抗体分子的抗原(Ag)结合点。因此，高变区又称为抗体分子的互补决定区
(complementarity‑determining region，CDR)，其氨基酸序列决定了抗体的特异性。

[0029] 本发明通过人流感病毒血凝素(HA)的氨基酸残基YPYDVPDYA(98‑106)的合成肽与KLH偶联作为抗原，注射小鼠刺激其体内产生抗体，结果在小鼠体内发现一种高效价的HA抗
体，通过该抗体可变区基因克隆及测序，获得该抗体重链和轻链的氨基酸序列，经分析，其
重链的互补决定区：CDR1：S‑Y‑G‑M‑S；CDR2：Y‑I‑S‑D‑G‑G‑V‑R‑T‑Y‑Y‑P‑D‑T‑I‑K‑G；CDR3：
H‑R‑G‑Y‑D‑G‑G‑M‑D‑Y；其轻链的互补决定区：CDR1：R‑A‑S‑A‑S‑V‑I‑A‑M‑H；CDR2：A‑T‑S‑S‑L‑A‑S；CDR3：Q‑H‑W‑S‑R‑N‑P‑L‑T；依据获得该抗体重链和轻链的氨基酸序列制备重组抗体，即为本发明优选的抗HA的单克隆抗体。

[0030] 本发明提供一种抗HA标签的单克隆抗体，包括3个重链的互补决定区和3个轻链的互补决定区，其中重链的互补决定区分别为重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，轻链的互补决
定区分别为轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；

[0031] 所述重链CDR1包括SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列S‑Y‑G‑M‑S或由其组成；

[0032] 所述重链CDR2包括SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列Y‑I‑S‑D‑G‑G‑V‑R‑T‑Y‑Y‑P‑D‑T‑I‑K‑G或由其组成；

[0033] 所述重链CDR3包括SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列H‑R‑G‑Y‑D‑G‑G‑M‑D‑Y或由其组成；

[0034] 所述轻链CDR1包括SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列R‑A‑S‑A‑S‑V‑I‑A‑M‑H或由其组成；

[0035] 所述轻链CDR2包括SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列A‑T‑S‑S‑L‑A‑S或由其组成；

[0036] 所述轻链CDR3包括SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列Q‑H‑W‑S‑R‑N‑P‑L‑T或由其组成。

[0037] 优选地，所述抗HA标签的单克隆抗体，其重链可变区，还包括以下氨基酸序列或由其序列组成：

[0038] 包括如SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列；

[0039] 或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的序列具有至少80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列；

[0040] 或者与SEQ ID NO:7，8，9，10所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变的序列；优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变的氨基酸序列；所述氨基酸突变，优选保守突变，更优选置换，插入或缺失。

[0041] 其轻链可变区还包括以下氨基酸序列或由其序列组成：

[0042] 包括如SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列；

[0043] 或者与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的序列具有至少80％，85％，90％，优选至少91％，92％，93％，94％，95％，96％，97％，98％，99％或100％序列同一性的序列；

[0044] 或者与SEQ ID NO:11，12，13，14所示的氨基酸序列相比具有一个或多个氨基酸突变的序列；优选1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸突变的氨基酸序列；所述氨基酸突变，优选保守突变，更优选置换，插入或缺失。

[0045] 在一些实施例中，所述抗HA标签的单克隆抗体，其重链氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示，轻链氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示。

[0046] 在一些实施方案中，本发明还提供一种编码如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体或其抗体片段的核酸序列。在本发明中，核酸序列包含其保守置换的变体(例如简并密码子
的置换)和互补序列。术语“核酸”和“多核苷酸”是同义的，包含基因、cDNA分子、mRNA分子以及它们的片段例如寡核苷酸。

[0047] 在一些实施方案中，本发明还提供了一种含有编码如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体或其抗体片段核酸序列的生物材料，所述生物材料，包括表达载体、表达盒、宿主细
胞、工程菌或杂交瘤细胞株。

[0048] 其中的核酸序列与至少一种调节序列可操作连接。“可操作连接”指的是编码序列以允许编码序列的表达的方式与调节序列连接。调节序列选择用来在合适的宿主细胞中指
导目的蛋白质的表达，包含启动子、增强子和其它的表达调控元件。

[0049] 另外，本发明还提供了一种如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体在检测、分离和纯化HA标记的靶蛋白中的应用。

[0050] 本发明还提供了一种包含如本发明所述抗HA标签的单克隆抗体的检测试剂盒。

[0051] 以下为实施例：

[0052] 实施例1抗HA标签的单克隆抗体

[0053] 本实施例中抗HA标签的单克隆抗体的重链和轻链氨基酸序列，如图1所示，其重链包括重链CDR1、重链CDR2和重链CDR3，轻链包括轻链CDR1、轻链CDR2和轻链CDR3；

[0054] 其中重链CDR1，由SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列S‑Y‑G‑M‑S组成；重链CDR2，由SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列

[0055] Y‑I‑S‑D‑G‑G‑V‑R‑T‑Y‑Y‑P‑D‑T‑I‑K‑G组成；重链CDR3，由SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列H‑R‑G‑Y‑D‑G‑G‑M‑D‑Y组成；

[0056] 轻链CDR1由SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列R‑A‑S‑A‑S‑V‑I‑A‑M‑H组成；轻链CDR2由SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列A‑T‑S‑S‑L‑A‑S组成；轻链CDR3由SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列Q‑H‑W‑S‑R‑N‑P‑L‑T组成。

[0057] 实施例2

[0058] 1.抗原免疫

[0059] HA是半抗原，需要与钥孔血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)偶联组成抗原，本实施例中用一种来自人流感病毒血凝素(HA)的氨基酸残基YPYDVPDYA(98‑106)的
合成肽与KLH结合，以0.15mL的剂量皮下注射BALB/c小鼠。第一次免疫14天后，增强免疫，增强免疫第四针后，采尾血检测，效价达到融合要求。融合前三天，继续免疫一次。

[0060] 2.杂交瘤细胞株的制备

[0061] (1)饲养细胞的制备

[0062] 以BALB/c鼠腹腔巨噬细胞作饲养细胞。剪开腹部，注射RPMI 1640基础培养液5mL，反复冲洗，收集。1000rpm，5分钟，留沉淀。用含HAT的RPMI 1640培养液重悬筛选，调整浓度
5
为1×10个/mL，加入96孔板，150μL/孔，37℃，5％CO2培养过夜。

[0063] (2)免疫脾细胞的制备

[0064] 末次免疫后3天，无菌条件下取小鼠脾脏置于平皿中，RPMI 1640基础培养液清洗，于尼龙膜上磨碎过滤，制成细胞悬液。离心，去上清，RPMI 1640基础培养液重悬，重复三次，得到免疫脾细胞，计数。

[0065] (3)骨髓瘤细胞的制备

[0066] 小鼠骨髓瘤细胞Sp2/0经8‑氮鸟嘌呤筛选后，培养至对数生长期，取两大瓶制成细胞悬液，离心，弃上清，用RPMI 1640基础培养液重悬，如些重复三次，得到骨髓瘤细胞，计数。

[0067] (4)细胞融合及HAT选择杂交瘤

[0068] 将骨髓瘤细胞与免疫脾细胞按1:10比例混合，在50mL塑胶离心管内用RPMI 1640基础培养液洗1次，1200rpm，离心10分钟。弃上清，将细胞混匀，缓慢加入1mL50％的PEG 
1500融合，融合1分钟后加入15mL的RPMI 1640基础培养液终止细胞融合。1000rpm，离心5‑
10分钟。弃上清，用50mL的RPMI 1640筛选培养液轻轻重悬，平分于10块96孔板，50μL/孔，37℃，5％CO2培养。培养至第六天，换HAT培养液(含HAT的RPMI 1640完全培养液)两次。

[0069] (5)杂交瘤细胞筛选

[0070] 用0.05M pH 9.6碳酸缓冲溶液稀释HA抗原至1μg/mL，加入96孔板，37℃、2小时。含10％小牛血清或1％脱脂奶粉的0.02M pH 7.2PBS，0.15mL/孔，37℃封闭2小时，用于检测。
融合后第7天，取0.1mL细胞上清至96孔板内，37℃，30min，水洗6次后，加入二抗，37℃，30分钟。洗后，每孔加入100μL含0.1％(M/V)邻苯二胺，0.1％(V/V)双氧水，pH 5.0柠檬酸磷酸缓冲液，37℃，15分钟，加入稀硫酸溶液，每孔50μL，测450nm吸收值。

[0071] 分泌抗体阳性细胞孔以1个细胞/孔在96孔培养板上用有限稀释法克隆，筛选阳性6
孔依上法连续克隆三次，扩大培养后，用含10％DMSO的培养液冻存，细胞密度为10 个/mL。
共获得五株稳定的抗HA标签杂交瘤细胞株，分别命名为A、B、C、D、E。

[0072] 3.单克隆抗体的制备

[0073] 选6～8周健壮的BALB/c小鼠，每只小鼠腹腔注射0.5mL的降植烷；10天后腹腔注射6
1×10个杂交瘤细胞。接种细胞7‑10天后可产生腹水，密切观察动物的健康状况与腹水征
象，待腹水尽可能多，而小鼠频于死亡之前，处死小鼠，用滴管将腹水吸入试管中，一般一只小鼠可获5～10mL腹水。收集腹水，离心取上清，放于‑20℃冰箱保存。取腹水上清，用3倍体积的PBS稀释后滤纸过滤。将所得的滤液在1mL/min的流速下加到一个已用PBS平衡的蛋白G
亲和层析柱。然后用PBS以1mL/min的流速洗涤未被蛋白G吸附的物质直至在OD280 nm下的
吸收值达到基线为止。再用0.1M的甘氨酸洗脱液(pH 2.5)洗脱并回收该抗体。所回收的溶
液用0.1MTris(pH 8.8)中和，通过超滤将抗体浓度调节到一个合适的浓度，‑20℃分装冻
存。

[0074] 4.效价测定

[0075] 以间接ELISA法检测上述5株杂交瘤细胞和分泌的腹水抗体的效价，具体实验步骤如下：

[0076] (1)包被：将HA抗原稀释至1μg/mL，100μL/孔加至酶标板，37℃2小时或者4℃过夜；

[0077] (2)用洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

[0078] (3)用洗涤液洗去包被液，用封闭液封闭，每孔150μL，37℃放置1.5‑2小时；

[0079] (4)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒；最后拍干；

[0080] (5)加样品：分别将稀释成不同梯度的细胞培养上清和腹水加入用HA抗原包被好的酶标板，100μL/孔，37℃反应1小时(同时做阴性对照孔和阳性对照孔)；

[0081] (6)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒，最后拍干；

[0082] (7)加辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG酶标二抗(用封闭液稀释6000倍)，100μL/孔，37℃反应1小时；

[0083] (8)洗板机洗板5次，每次每孔注洗液350μL，停留20秒，最后拍干；

[0084] (9)加显色液TMB：即用即配，100μL/孔，37℃避光反应30分钟；

[0085] (10)终止反应：于各反应孔中加入2M的硫酸，50μL/孔；

[0086] (11)酶标仪读数：450nm，630nm波长测定。

[0087] 结果见表1，筛选效价较高的细胞株。

[0088] 表1 5株杂交瘤细胞分泌腹水抗体的效价比较

[0089]

[0090]

[0091] 表1中的数据是能被酶标仪检测到的该抗体溶液的最低浓度，即该抗体溶液可用的最大稀释倍数。由表1可知，在上述5株杂交瘤细胞中，杂交瘤细胞6C6分泌的腹水抗体最
6
高，其效价可达1.48×10。

[0092] 5.抗体可变区基因克隆及测序

[0093] 从以上分泌HA单克隆抗体的杂交瘤细胞株6C6中提取总RNA，用SMARTERTM RACE cDNA Amplification Kit试剂盒及试剂盒中的SMARTER II A Oligonucleotide和5'‑CDS
引物进行第一链cDNA合成，获得的第一链cDNA产物作为PCR扩增模板。轻链基因以
Universal Primer AMix(UPM)、Nested Universal Primer A (NUP)和mIgG CKR引物进行
扩增，重链基因以Universal Primer A Mix(UPM)、Nested Universal Primer A(NUP)和
mIgG CHR引物进行扩增。其中轻链的引物对扩增出0.7KB左右的目的条带，重链的引物对扩
增出1.5KB左右的目的条带。用琼脂糖凝胶电泳纯化回收，产物用rTaq DNA聚合酶进行加A
反应后插入到pMD‑18T载体中，转化到DH5α感受态细胞中，长出菌落后分别取重链及轻链基因克隆各4个克隆送擎科公司进行测序。

[0094] 经分析，重链的互补决定区：

[0095] CDR1：S‑Y‑G‑M‑S

[0096] CDR2：Y‑I‑S‑D‑G‑G‑V‑R‑T‑Y‑Y‑P‑D‑T‑I‑K‑G

[0097] CDR3：H‑R‑G‑Y‑D‑G‑G‑M‑D‑Y

[0098] 轻链的互补决定区：

[0099] CDR1：R‑A‑S‑A‑S‑V‑I‑A‑M‑H

[0100] CDR2：A‑T‑S‑S‑L‑A‑S

[0101] CDR3：Q‑H‑W‑S‑R‑N‑P‑L‑T

[0102] 6.制备重组抗体进行亲和力分析、活性鉴定

[0103] 以酶免间接法做数据，包被做四个梯度1μg/ml、0.5μg/ml、0.25μg/ml、0.125μg/ml；抗体从1000ng/ml开始2倍梯度稀释至0.97656ng/ml上样。得出不用包被浓度下不同抗体浓度对应的OD值。在同一包被浓度下，以抗体浓度为横坐标，OD值为纵坐标，对数作图，根据拟合方程计算出50％最大OD值时的抗体浓度，带入公式计算出亲和力常数的倒数，具体
公式如下：

[0104] K＝(n‑1)/(2*(n*Ab`‑Ab))；

[0105] 式中Ab和Ab`分别表示对应包被浓度(Ag、Ag`)下50％最大OD值时的抗体浓度，n＝Ag/Ag`；

[0106] 每两个包被浓度可以组合计算出一个K值，最后可得六个K值，取其平均数值，再求其倒数则为亲和力常数KD，结果如下表2所示。

[0107] 表25株杂交瘤细胞分泌的抗体的亲和力比较

[0108] 样品名称 KD6C6 1.333E‑8
2D9 6.245E‑7
5A4 4.298E‑6
3B6 9.328E‑7
4E7 7.645E‑6

[0109] 由表2可知，纯化后的抗HA单抗亲和力分析数据，与另外4株杂交瘤细胞分泌的抗体的亲和力对照，本发明提供的抗体(克隆杂交瘤细胞6C6分泌的抗体)亲和力明显更优。

[0110] 活性鉴定

[0111] 用50mM碳酸盐缓冲液包被液稀释HA抗原到1μg/mL进行微孔板包被，每孔100μL，4℃过夜；次日，洗涤液用PBST清洗2次，拍干；加入封闭液(20％BSA+80％PBS)，每孔120μL，37℃，1h，拍干；加入稀释后的抗HA单克隆抗体6C6，从1000ng/ml始进行5倍比稀释，上样，100μL/孔，37℃，30min(部分上清1h)；用PBST洗涤液清洗5次，拍干；加入辣根过氧化酶标记的羊抗鼠IgG，每孔100μL，37℃，30min；用PBST洗涤液清洗5次，拍干；加入过氧化脲(50μL/孔)，加入四甲基联苯胺(50μL/孔)，10min；加入稀盐酸终止反应，50μL/孔；酶标仪上450nm(参考
620nm)处读OD值，结果如下表所示：

[0112]样品浓度ng/ml 1000 200 40 8 1.6 0.32 0
OD值 3.262 2.003 0.812 0.166 0.128 0.062 0.01

[0113] 由上表可知，样品浓度低至0.32ng/ml仍能检测出，说明其活性高。

[0114] 本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含
在本发明的保护范围之内。