一种钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及评价系统

摘要

本申请涉及医用材料检测领域，尤其涉及一种钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及评价系统。所述钙化模拟液由以下成分组成：1L的注射用水；5g~80g的牛血清白蛋白；3g~15g的氯化钠；1.5g~5g的无水氯化钙；0.15g~0.60g的碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、氢氧化钙或碳酸氢钙；0.005g~0.03g的羟基亚乙基二膦酸、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸、乙二胺四亚甲基膦酸或乙二胺二邻苯基乙酸。本申请提供的钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及钙化评价系统，其不仅可以减缓钙离子在瓣膜上的沉积速度，也可更好的模拟人体内血流对生物瓣的冲刷情况，从而模拟出人体内长期且缓慢的钙化过程。

权利要求

1.一种钙化模拟液，其特征在于，所述钙化模拟液由以下成分组成：

1L 的注射用水；

20g 80g 的牛血清白蛋白；

~

9g 15g 的氯化钠；

~

1.5g 5g 的无水氯化钙；

~

0.15g 0.60g 的碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、氢氧化钙或碳酸氢~钙；

0.005g 0.03g 的羟基亚乙基二膦酸、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸、乙二胺四亚甲基膦~酸或乙二胺二邻苯基乙酸。

2.根据权利要求 1 所述的钙化模拟液，其特征在于，所述钙化模拟液由以下成分组成：

1L 的注射用水；

20g 的牛血清白蛋白；

9g 的氯化钠；

1.5g 的无水氯化钙；

0.40g 的碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、氢氧化钙或碳酸氢钙；

0.01g 的羟基亚乙基二膦酸、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸、乙二胺四亚甲基膦酸或乙二胺二邻苯基乙酸。

3.根据权利要求 1 所述的钙化模拟液，其特征在于，所述钙化模拟液由以下成分组成：

1L 的注射用水；

20g 的牛血清白蛋白；

9g 的氯化钠；

1.5g 的无水氯化钙；

0.40g 的碳酸氢钾；

0.01g 的羟基亚乙基二膦酸。

4.一种体外生物瓣钙化评价方法，其特征在于，所述体外生物瓣钙化评价方法采用权利要求 1 3 任一所述的钙化模拟液。

~

5.一种体外生物瓣钙化评价系统，其特征在于，所述评价系统包括以下装置：电机，其用于对钙化模拟液进行压力输出；

加热且控温的水箱，其用于维持钙化模拟液的温度；

阻尼装置，其用于控制钙化模拟液的流速；

瓣膜通道，其用于对生物瓣进行固定；和连接以上各装置的管路，并且钙化模拟液在上述各装置之间单向循环流动；

所采用的钙化模拟液采用权利要求 1 3 任一所述的钙化模拟液。

~

6.根据权利要求 5 所述的体外生物瓣钙化评价系统，其特征在于，瓣膜通道用于固定多片生物瓣。

说明书

一种钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及评价系统

技术领域

[0001] 本申请涉及医用材料检测领域，尤其涉及一种钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及评价系统。

背景技术

[0002] 全部或部分用生物组织制成的人体心脏瓣膜的替代品简称生物瓣膜，也即生物瓣，其可以应用于瓣膜置换类外科手术中。其随着使用时间的增加，血液内的游离钙离子会逐渐堆积其上并形成钙化，从而降低生物瓣的功能甚至于导致失效。不同生物组织来源的生物瓣抵抗钙化的能力也各不相同，目前也有研究如何提高生物瓣的抗钙化能力。此类研究中，如何对生物瓣的抗钙化能力或者钙化所需时间进行客观的评价和检测则是被期望的，其中，如何模拟出更接近于真实的人体血液环境从而更好的评估生物瓣的抗钙化能力或者钙化所需时间则是需要解决的问题。

[0003] 目前已知的评估检测手段中，除常规的动物植入实验、配置钙化模拟液体外静态评估外，还有配置钙化模拟液体外动态评估的方式，例如CN105717053A中所记载的方式。常规的动物植入实验是最接近于人体血液环境的模拟实验，但其成本高，操作困难，且需专业机构处理。配置钙化模拟液体外静态评估的方式虽然成本低、操作简单，但其无法体现人体内血流对瓣膜冲刷的情况，导致评估结果并不准确。而CN105717053A中记载的配置钙化模拟液体外动态评估的方式虽然可以体现人体内血流对生物瓣冲刷的情况，但其钙离子在瓣膜上的沉积速度过快，仍无法体现出瓣膜在体内钙化中长期且缓慢的过程。

发明内容

[0004] 本申请提供的钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及钙化评价系统，其不仅可以减缓钙离子在瓣膜上的沉积速度，也可更好的模拟人体内血流对生物瓣的冲刷情况，从而模拟出人体内长期且缓慢的钙化过程。

[0005] 本申请所提供的第一种方案为：一种钙化模拟液，所述钙化模拟液由以下成分组成：

[0006] 1L的注射用水；

[0007] 5g 80g的牛血清白蛋白；~

[0008] 3g 15g的氯化钠；~

[0009] 1.5g 5g的无水氯化钙；~

[0010] 0.15g 0.60g的碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、氢氧化钙或碳~酸氢钙；

[0011] 0.005g 0.03g的羟基亚乙基二膦酸、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸、乙二胺四亚甲~基膦酸或乙二胺二邻苯基乙酸。

[0012] 可选的，所述钙化模拟液由以下成分组成：

[0013] 1L的注射用水；

[0014] 20g的牛血清白蛋白；

[0015] 9g的氯化钠；

[0016] 1.5g的无水氯化钙；

[0017] 0.40g的碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、氢氧化钙或碳酸氢钙；

[0018] 0.01g的羟基亚乙基二膦酸、二亚乙基三胺五亚甲基膦酸、乙二胺四亚甲基膦酸或乙二胺二邻苯基乙酸。

[0019] 可选的，所述钙化模拟液由以下成分组成：

[0020] 1L的注射用水；

[0021] 20g的牛血清白蛋白；

[0022] 9g的氯化钠；

[0023] 1.5g的无水氯化钙；

[0024] 0.40g的碳酸氢钾；

[0025] 0.01g的羟基亚乙基二膦酸。

[0026] 本申请还提供第二种方案，即一种体外生物瓣钙化评价方法，所述体外生物瓣钙化评价方法采用前述任一所述的钙化模拟液。

[0027] 本申请还提供第三种方案，即一种体外生物瓣钙化评价系统，所述评价系统包括以下装置：

[0028] 电机，其用于对钙化模拟液进行压力输出；

[0029] 加热且控温的水箱，其用于维持钙化模拟液的温度；

[0030] 阻尼装置，其用于控制钙化模拟液的流速；

[0031] 瓣膜通道，其用于对生物瓣进行固定；和

[0032] 连接以上各装置的管路，并且钙化模拟液在上述各装置之间单向循环流动；

[0033] 所采用的钙化模拟液采用前述任一所述的钙化模拟液。

[0034] 可选的，瓣膜通道用于固定多片生物瓣。

[0035] 本申请所得钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及评价系统等具有以下优势：

[0036] （1）所采用的钙化模拟液采用的组分中涵盖蛋白成分、pH调节剂、钙离子螯合剂等，这样的成分组合可更有效模拟人体血液环境中钙离子的动态平衡过程，有效控制钙化模拟液中钙离子的浓度，从而可以降低其在瓣膜上的沉积速度；

[0037] （2）所采用的钙化模拟液配合本申请的体外生物瓣钙化评价系统，利用电机的压力输出作用模拟血液循环，并且可模拟血流对生物瓣的冲刷作用，配合使用的沉积速度降低的钙化模拟液，可以有效模拟出生物瓣在人体内长期且缓慢的钙化过程；

[0038] （3）本申请提供的体外生物瓣钙化评价系统具有加热及控温装置，可更有效模拟出人体血液环境及血钙所处的温度及pH环境下的钙离子浓度控制。

附图说明

[0039] 图1是本申请体外生物瓣钙化评价系统的简略示意图。

[0040] 1：钙化模拟液

[0041] 2：加热且控温的水箱

[0042] 3：电机

[0043] 4：瓣膜通道

[0044] 4‑1：生物瓣

[0045] 5：阻尼装置。

具体实施方式

[0046] 为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本申请实施例，对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。通常在此处描述和示出的本申请实施例的组件可以以各种不同的配置来布置和设计。

[0047] 现有体外模拟钙化方法常见的是配制一种模拟体液的含钙溶液拟液，将待测瓣膜放置于含钙溶液中，再将其放入恒温水浴锅中，搅拌并将温度恒定在37℃的情况下，放置一段时间，之后将瓣膜拿出进行测试。该方法虽然操作简单，成本低廉，瓣膜上可以产生钙化堆积，但经过我们反复使用类似的方式对瓣膜进行钙化模拟实验后发现存在一下几种不可避免问题：

[0048] 一、溶液中钙离子释放过快，短时间内即可达到峰值，非真实人体情况。

[0049] 二、瓣膜在人体内钙化，是钙离子随血液长时间冲刷缓慢积累在瓣膜组织上的，而该方法虽然也会有钙离子沉积在瓣膜上，但经过观察瓣膜上钙化点上的钙沉积实为溶液中高浓度的钙离子析出后附着在瓣膜的表面，部分钙化点经过冲洗很容易被清水洗掉，钙沉积的机理与人体内的真实情况完全不符。

[0050] 三、代血浆溶液加入含钙无机盐形成的模拟体液的含钙溶液，经过一段时间实验之后，溶液中的pH会随之下降，并非体液的真实情况，而pH降低后的溶液，不仅pH值无法与体液保持一致，且会使已经在瓣膜上沉积的部分钙离子酸解了，例如前述提到的专利文献。

[0051] 总之使用现有常规模拟体液的钙化模拟液在特定温度下对瓣膜进行钙化性能测试是无法模拟人体内的实际情况的，且钙含量测定值与实际情况（例如最接近实际情况的动物植入实验）也会存在极大偏差。

[0052] 动物植入实验，其方法是将生物瓣膜植入到特定环境饲养的大鼠体内，经过不同的时间点处死大鼠，取出瓣膜再进行钙含量测试。抛开实验本身影响，该方法最大的问题在于绝大多数公司都不具备该实验所需条件，往往需要将瓣膜样品送至专业机构进行测试，该过程需要双方密切配合，大大增加了实验难度；且在一个测试周期，即半年至一年的费用往往需要几万‑十几万，如按照一个研发周期估算，往往需要几个同样的或同时进行的测试周期，该项支出对于普通医疗公司也是难以承担的。

[0053] 在此基础上，本申请提供的钙化模拟液、体外生物瓣钙化评价方法及评价系统可以很好的解决上述问题。其中该评价系统中，可供钙化模拟液流动的装置由可变电机（泵）、加热且控温的水箱，阻尼装置（可控流速）、可固定例如多片瓣膜的通道，以及连接各部分的管路构成。可变电机可以根据实验需求，对含钙溶液进行不同的压力输出，模拟人体血压情况；加热且控温的水箱可以保证钙化模拟液保持在37℃的温度；阻尼装置可以改变并控制钙化模拟液的流速。将待测试瓣膜置于固定瓣膜的通道内，通过各部件创造血液真实流过瓣膜的情景。

[0054] 钙化评价系统需要的钙化模拟液由牛血清白蛋白、氯化钠、无水氯化钙、碳酸氢钾、羟基亚乙基二膦酸、以及注射用水组成，其配比如下：

[0055]

[0056] 例如配制1L的含钙牛血清白蛋白溶液，取20g牛血清白蛋白，9g氯化钠，1.5g无水氯化钙，和0.01g羟基亚乙基二膦酸溶解在1L注射用水中，再加入0.40g碳酸氢钾。碳酸氢钾溶液的作用是由于其水溶液呈弱碱性，可以调节混合后溶液的pH至人体血液的范围内，这是因为pH高低对于钙离子的沉积有很大的影响；羟基亚乙基二膦酸的作用是与钙离子进行螯合，可以起到减缓钙元素在瓣膜上沉积的速度，从而使钙例子的沉积达到缓慢且平稳的目的。

[0057] 其中钙化模拟中碳酸氢钾可以用碳酸氢钠、氢氧化钠、氢氧化钾、氧化钙、氢氧化钙、碳酸氢钙替代；羟基亚乙基二膦酸可以使用二亚乙基三胺五亚甲基膦酸、乙二胺四亚甲基膦酸和乙二胺二邻苯基乙酸钠替代。

[0058] 使用该评价系统对瓣膜钙化情况进行实验，成本上与可操作性上要远好于大鼠植入实验，同时还可以保证测试环境的统一性。相对现有常规的钙化模拟液进行体外模拟钙化实验，该评价系统在模拟人体环境的过程中与真实情况更加贴切，一方面模拟了血液不断的冲刷过程，另一方面模拟了钙离子在体内缓慢积累的过程，测试的结果与实际更为贴切。

[0059] 以下是对本申请方案的详细举例说明：

[0060] 以下实施例、对比例以及参照例测试所采用的生物瓣膜组织均取材于牛心包，采购自新疆驰疆驿商贸有限公司。

[0061] 实施例1

[0062] 具体的实验过程可参考以下内容，具体评价系统所采用的装置可参考图1的示例：

[0063] 1）配制钙化模拟液1：按5000mL的钙化模拟液进行配制，100g牛血清白蛋白，45g氯化钠，7.5g无水氯化钙，和0.05g羟基亚乙基二膦酸溶解在5000mL注射用水中，再加入2g碳酸氢钾至溶液中，搅拌均匀。

[0064] 2）瓣膜准备：将经过交联与抗钙化处理的生物组织保存在0.9%的生理盐水中并放入冰箱冷藏，测试前取出，根据评价系统中瓣膜通道4的大小裁剪成适合的尺寸。测试前需准备从一张生物组织中裁剪好的六片生物瓣4‑1。其中一片作为初始空白对照，其余五片准备进行体外模拟钙化实验。

[0065] 3）系统设定：先将待测试的五片生物瓣4‑1放入瓣膜通道4内，然后将配制好的钙化模拟液1加入至加热且控温的水箱2中，升温至37°C并控制温度为恒定，启动电机3并设定频率70次/min，再通过阻尼装置5调节流速为5000mL/min，平均动脉压设定为100mmHg。

[0066] 4）体外模拟钙化反应：保持3）步骤对设备的设定，使瓣膜在系统中分别进行15天、30天、60天、90天和180天的模拟钙化实验。

[0067] 5）钙含量测试：分别对初始瓣膜（0天），以及经过15天、30天、60天、90天和180天钙化实验的瓣膜进行ICP‑OES钙元素定量测试，每个样品进行两次测试，最终得到的钙含量测试结果为两次测试的平均值。测试结果为：

[0068]

[0069] 实施例2

[0070] 具体的实验过程是：

[0071] 1）配制钙化模拟液1：按5000mL的模拟体液的含钙溶液进行配制，100g牛血清白蛋白，45g氯化钠，7.5g无水氯化钙，和0.05g羟基亚乙基二膦酸溶解在5000mL注射用水中，然后配制碳酸氢钾溶液，再加入2g碳酸氢钾至溶液中，搅拌均匀。

[0072] 2）瓣膜准备：将经过交联但未经过抗钙化处理的生物组织保存在0.9%的生理盐水中并放入冰箱冷藏，测试前取出，根据系统中瓣膜通道4的大小裁剪成适合的尺寸。测试前需准备从一张生物组织中裁剪好的六片生物瓣4‑1。其中一片作为初始空白对照，其余五片准备进行体外模拟钙化实验。

[0073] 3）系统设定：先将待测试的五片瓣膜放入固定瓣膜的通道内，然后将配制好的模拟体液的含钙溶液加入至加热且控温的水箱2中，升温至37°C并控制温度为恒定，启动电机3并设定频率70次/min，再通过阻尼装置5调节流速为5000mL/min，平均动脉压设定为
100mmHg。

[0074] 4）体外模拟钙化反应：保持3）步骤中对设备的设定，使瓣膜在系统中分别进行15天、30天、60天、90天和180天的模拟钙化实验。

[0075] 5）钙含量测试：分别对初始瓣膜（0天），以及经过15天、30天、60天、90天和180天钙化实验的瓣膜进行ICP‑OES钙元素定量测试，每个样品进行两次测试，最终得到的钙含量测试结果为两次测试的平均值。测试结果为：

[0076]

[0077] 通过实施例1与实施例2的实验结果可以说明，无论生物组织是否经过抗钙化处理该系统均具有适用性；同时钙离子在180天的周期内平稳且缓慢的沉积在瓣膜上，由此也可以说明系统中所采用的钙化模拟液具备缓释的效果。

[0078] 对比例1

[0079] 在此项实验中使用水浴摇床代替实施例中的设备进行对照实验，其余实验方式及装置不变，测试结果为：

[0080]

[0081] 通过对实验后样品进行观察发现，瓣膜上沉积的钙离子多数为溶液中钙离子缓慢析出后附着在瓣膜表面所形成的钙化现象，瓣膜表面的钙元素非紧密附着，当瓣膜上附着的钙元素达到一定程度后便会脱落。该现象可以解释瓣膜在0‑60天过程中钙含量正常积累，60‑180天时钙含量缓慢减少这一过程。

[0082] 该实验证明了使用水浴摇床进行试验虽然可以模拟人体温度的环境，但是无法模拟瓣膜正常工作的环境，从而使得测试结果与实际情况出入较大。同理可以推出使用其他如恒温搅拌，恒温摇晃类设备无法满足实际测试需求。

[0083] 对比例2

[0084] 相对于实施例1中，在配制钙化模拟液中未添加碳酸氢钾进行对照实验，其余实验方式及装置不变，测试结果为：

[0085]

[0086] 未加入碳酸氢钾的溶液pH值会随着时间而降低，pH值的降低会使得溶液体系趋向于偏酸性，酸性环境不仅无法促进钙离子的析出与沉积，反而会使得瓣膜上已经积累的钙离子在酸性条件下分解，这也就解释了测试结果中钙含量先增高再降低这一过程的原因。

[0087] 对比例3

[0088] 相对于实施例1中，在配制钙化模拟液中未添加羟基亚乙基二膦酸进行对照实验，其余实验方式及装置不变，测试结果为：

[0089]

[0090] 未加入羟基亚乙基二膦酸的钙化模拟液，通过测试结果可以了解60天内钙元素在瓣膜上沉积速度较快，而60 180天时由于溶液中钙离子浓度减少以及瓣膜上可沉积钙离子~位点的缩减使得钙元素沉积变得不稳定。未使用羟基亚乙基二膦酸的钙化模拟液虽然在一定程度上可以起到模拟瓣膜钙化的过程，但事实上与钙离子在体内是平稳且缓慢沉积的现象有着一定的差距，并不能真实的反应瓣膜在体内钙化的全过程，导致数据的可靠性存在影响。因此加入钙离子螯合剂对于体外模拟钙化实验的平稳性有着至关重要的作用。

[0091] 对比例4

[0092] 相对于实施例1中，采用CN105717053A的钙化模拟液（例如溶液一）进行对照实验，其余实验方式及装置不变，测试结果为：

[0093]

[0094] 通过对前述专利文献所采用的钙化模拟液的实验情况分析来看，即使采用其钙化模拟液，其钙离子沉积速度过快，同时由于该对比例使用的钙化模拟液在60天后pH下降，使之呈现弱酸性状态，导致已聚集的钙元素部分酸解，无法达到本申请所需的模拟人体内钙离子缓慢且长期的沉积过程。

[0095] 参照例1

[0096] 相对于实施例1与实施例2，该实验使用与实施例1与实施例2中相同的生物瓣膜进行活体大鼠植入实验。大鼠采购自专门的实验动物有限公司，均为3周龄大。其中与实施例1相同将经过交联与抗钙化处理的生物组织准备4片分别植入至编号为1、2、3、4、5的五只大鼠中，其中与实施例2相同将经过交联但未经过抗钙化处理的生物组织准备4片分别植入至编号为1、2、3、4的四只大鼠中，相当于每只大鼠分别植入了2片不同处理的生物瓣膜。实验在15、30、60、90、180天后对大鼠进行处死并取出植入的生物组织对其进行钙含量测试，其中测试结果为：

[0097]

[0098] 对比大鼠植入实验，使用本发明最后测试结果基本可以反应钙离子在体内沉积的真实情况。但大鼠植入实验整体费用包括：大鼠采购、动物饲养、饲养员人工成本、材料等在该周期内共约花费5万元人民币。相较于本发明的钙化模拟液或系统，其成本过高，大大增加了公司的研发成本支出。且动物饲养，组织植入，实验处理难度过高等都不利于进行大规模实验。本申请解决了此项问题并可以替代活体植入实验。

[0099] 以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。