一种大麻二酚酸合成酶的应用

摘要

本发明公开了一种大麻二酚酸合成酶的应用，涉及合成生物学技术领域。具体地，本发明提供一种大麻二酚酸合成酶在提高由大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的转化效率中的应用，所述大麻二酚酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明提取高大麻二酚含量大麻叶片的基因组，通过PCR扩增获得了CBDAS基因，将该基因在毕赤酵母中异源表达，得到了高催化活性的大麻二酚酸合成酶，该大麻二酚酸合成酶可以提高底物大麻萜酚酸转化为大麻二酚酸的转化率，避免在利用大麻植株提取大麻二酚时，植株中残存大麻萜酚酸未被转化成大麻二酚而造成的浪费，可进一步提高大麻二酚的产量。(56)对比文件CN 114214339 A,2022.03.22US 2021309975 A1,2021.10.07US 2016010126 A1,2016.01.14US 2022290194 A1,2022.09.15李建国《.高等仪器分析》.苏州大学出版社,2020,第56-62段.Genbank.Accession No.:NP_001384865.1，cannabidiolic acid synthase precursor[Cannabis sativa]《.Genbank》.2021,Featuressig_peptide.Niranjan Aryal .Distribution ofcannabinoid synthase genes in non-Cannabis organisms《.Journal of CannabisResearch 》.2019,第1卷(第1期),第1-6页.Chiara Onofri .Sequence heterogeneityof cannabidiolic- andtetrahydrocannabinolic acid-synthase inCannabis sativa L. and its relationshipwith chemical phenotype《.Phytochemistry》.2015,第116卷第57-68页.

权利要求

1.一种大麻二酚酸合成酶在提高由大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的转化效率中的应用，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示；

所述大麻二酚酸合成酶通过参与体外催化反应，使得大麻萜酚酸转化成大麻二酚酸；

所述大麻二酚酸合成酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示；

所述大麻二酚酸合成酶由一种重组微生物菌株表达，所述重组微生物菌株包括如SEQ ID NO.1所示的基因。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述重组微生物菌株为重组毕赤酵母(Pichia pastoris)菌株。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述重组微生物菌株的构建方法，包括以下步骤：(1)将如SEQ ID NO.1所示的编码基因连接入表达载体，得到重组质粒；

(2)将所述重组质粒导入毕赤酵母感受态细胞，筛选得到阳性重组子，即为所述重组微生物菌株。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，在步骤(1)中，所述表达载体为pPIC9K载体。

5.一种提高从大麻植株中提取大麻二酚的产量的方法，其特征在于，包括利用氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大麻二酚酸合成酶催化大麻植株中的大麻萜酚酸生成大麻二酚酸，进而形成大麻二酚的步骤。

说明书

一种大麻二酚酸合成酶的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及合成生物学技术领域，特别是涉及一种大麻二酚酸合成酶的应用。

背景技术

[0002] 大麻(Cannabis sativa L.)是一年生麻科草本植物，被称为大麻或汉麻，在世界各地种植已有数千年，目前为止，已分离出100多种大麻素。其中，酸性大麻素四氢大麻酚酸(THCA)、大麻二酚酸(CBDA)和大麻色酸(CBCA)含量最丰富，其他类型大麻素大多是由这三种物质在热和光照下通过非酶转化、降解反应和自氧化等方式获得。大麻二酚(CBD)是一种与THC具有不同环状结构的同分异构体，近年来在治疗阿尔兹海默病、帕金森病、癫痫，以及抗肿瘤和神经保护等方面发挥着重要作用。但由于CBD原料短缺、价格高昂、生物提取得率低等问题，限制了其在医疗领域的广泛使用。

[0003] 毕赤酵母(Pichiapastoris)是在甲醇培养基中生长的一种甲基营养菌，可利用AOX1启动子来驱动外源蛋白的高水平表达。酵母异源表达系统有许多优点，发酵培养基取材稳定、成本低廉、繁殖快速；与细菌相比，具有翻译后修饰，易于遗传操作等优势。外源目的基因线性化后，利用同源重组方式可将外源基因高效整合到酵母细胞的染色体中，产生稳定的细胞系。

[0004] 大麻二酚酸合成酶(CBDAS)可催化底物大麻萜酚酸(CBGA)生成CBDA，而CBDA在高温下易脱羧形成CBD。若能通过操作简便，经济高效的方法获得CBDAS，就可在利用大麻植株提取CBD的过程中，通过进一步催化CBGA继续合成CBDA，利用二次体外反应来增加CBD的产量。因此，有必要开发一种高产大麻二酚酸合成酶的毕赤酵母菌株，为CBDAS的工业化生产奠定基础。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供一种大麻二酚酸合成酶的应用，以解决上述现有技术存在的问题，本发明提供的大麻二酚酸合成酶可以提高底物CBGA转化为CBDA的转化率，避免在利用大麻植株提取CBD时，植株中残存CBGA未被转化成CBD而造成的浪费，从而进一步提高CBD的产量。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0007] 本发明提供一种大麻二酚酸合成酶在提高由大麻萜酚酸生成大麻二酚酸的转化效率中的应用，其特征在于，所述大麻二酚酸合成酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0008] 进一步地，所述大麻二酚酸合成酶的编码基因如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 进一步地，所述大麻二酚酸合成酶由一种重组微生物菌株表达，所述重组微生物菌株包括如SEQ ID NO.1所示的基因。

[0010] 进一步地，所述重组微生物菌株为重组毕赤酵母(Pichiapastoris)菌株。

[0011] 进一步地，所述重组微生物菌株的构建方法，包括以下步骤：

[0012] (1)将如SEQ ID NO.1所示的编码基因连接入表达载体，得到重组质粒；

[0013] (2)将所述重组质粒导入毕赤酵母感受态细胞，筛选得到阳性重组子，即为所述重组微生物菌株。

[0014] 进一步地，在步骤(1)中，所述表达载体为pPIC9K载体。

[0015] 本发明还提供一种提高从大麻植株中提取大麻二酚的产量的方法，包括利用氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的大麻二酚酸合成酶催化大麻植株中的大麻萜酚酸生成大麻二酚酸，进而形成大麻二酚的步骤。

[0016] 本发明公开了以下技术效果：

[0017] (1)本发明以高CBD含量的大麻叶片为材料，采用PCR克隆技术获得CBDAS基因，并构建酵母表达载体，在毕赤酵母中重组表达。经生物活性分析后表明，该毕赤酵母菌株可以高效表达CBDAS，而且在将底物CBGA转化为CBDA时具有较高活性。利用该毕赤酵母菌株高效表达的CBDAS催化反应12h后，以大麻叶片粗提液中CBGA为底物时再次合成CBDA 60.64ng/mL，CBD 128.01ng/mL；而以CBGA标准品为底物时合成CBDA 20.12ng/mL，CBD 207.87ng/mL。

[0018] (2)利用本发明提供的大麻二酚酸合成酶，可以在利用大麻植株提取CBD时，将植株中残存的CBGA进行体外反应，进一步生物合成CBDA，进而脱羧形成CBD，避免大麻植株中残存CBGA未被转化成CBD而造成浪费，从而进一步提高CBD的产量。

[0019] (3)本发明构建的毕赤酵母菌株生长周期短，培养成本低廉，重组酶表达稳定，具有翻译后修饰等特点，可进行批量工厂化生产。

[0020] (4)本发明还为大麻中其他有益大麻素的获得提供了参考方案。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022] 图1为CBDAS基因扩增结果；其中M：DS2000 Marker；1：CBDAS扩增片段；

[0023] 图2为pPIC9K‑CBDAS重组载体图谱；

[0024] 图3为重组毕赤酵母PCR鉴定结果；其中，M：DS5000 Marker；1：阴性对照；2：pPIC9K‑CBDAS质粒；3‑5：重组毕赤酵母的PCR产物；

[0025] 图4为重组酶催化底物CBGA产生CBDA和CBD的情况；其中A图为pPIC9K‑CBDAS粗酶液催化大麻叶片粗提液中CBGA在不同时间生成CBDA和CBD的情况；B图为pPIC9K‑CBDAS粗酶液催化CBGA标准品在12h生成CBDA和CBD的情况；在A中，CK为只加底物不加酶液的空白对照(即对比例1)，pPIC9K为空载转入酵母菌提取粗酶液(即对比例2)，pPIC9K‑CBDAS表示实施例2；在B中，CK为只加底物不加酶液的空白对照(即对比例3)，pPIC9K为空载转入酵母菌提取粗酶液(即对比例4)，pPIC9K‑CBDAS表示实施例3；不同小写字母表示不同样品间差异显著(P＜0.05)。

具体实施方式

[0026] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0027] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0028] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0029] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0030] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0031] 以下实施例中使用的培养基如下：

[0032] LB培养基：胰蛋白胨10g/L、酵母浸粉5g/L、氯化钠5g/L和琼脂12g/L。

[0033] MD培养基：琼脂20g/L、葡萄糖20g/L、无氨基氮源13.4g/L和生物素4×10‑4mL/L。

[0034] BMGY培养基：胰蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L、磷酸氢二钾3.94g/L、磷酸氢二钾‑412g/L、甘油20mL/L、无氨基氮源13.4g/L和生物素4×10 mL/L。

[0035] BMMY培养基：胰蛋白胨20g/L、酵母浸粉10g/L、磷酸氢二钾3.94g/L、磷酸氢二钾‑412g/L、无氨基氮源13.4g/L和生物素4×10 mL/L。

[0036] 注：Kana或Amp抗生素配制成50mg/mL水溶液后过滤除菌，再按1:1000的体积比加入灭菌后的LB培养基中。

[0037] 以下实施例中使用的载体pGGC000和pPIC9K购自武汉淼灵生物技术公司；毕赤酵母感受态细胞为毕赤酵母(Pichiapastoris)GS115，购自上海昂羽生物技术公司。

[0038] 以下实施例中，CBDA和CBD的含量用安捷伦高效液相色谱分析仪器进行检测，其中液相色谱条件为：色谱柱：Shimadzu sil‑16C18柱(150mm×4.6mm×3μm)，柱温：30℃；流动相：A为水溶液中含有0.1％甲酸，B为乙腈中含有0.1％甲酸；等度洗脱：25％A，75％B，保留时间30min；紫外检测器：230nm；流速：0.7mL/min；进样量：10μL。

[0039] 实施例1

[0040] 1.大麻基因组的提取

[0041] 称取适量高CBD含量的大麻叶片经液氮研磨后，按照植物DNA提取试剂盒说明书提取总基因组。使用NanoDrop2000检测DNA浓度和质量。DNA保存在‑20℃备用。

[0042] 2.CBDAS基因序列的获得

[0043] (1)使用Primer3 plus在线网站设计特异引物。以大麻基因组DNA为模板进行PCR扩增，扩增结果如图1。本实验选用高保真聚合酶进行目的片段的扩增，向PCR小管中加入5×SF Buffer 10μL，dNTPs 1μL，引物1和引物2(见表1)各2μL，基因组DNA 100ng，去离子水定容至50μL，Phanta Super‑Fidelity DNApolymerase 0.5μL进行扩增。PCR扩增程序：95℃，2min，95℃，10s，56℃，30s，72℃，2min，共32个循环；72℃，5min，4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，点样量50μL，恒压110V，时间30min。使用凝胶成像仪记录结果并切胶，按照胶回收试剂盒说明书进行纯化。

[0044] (2)向PCR管中加入空载体pGGC0001μL，纯化产物与pGGC000质量比达到3:1，10×Cutsmart Buffer 2μL，BsaI限制性内切酶2μL，用去离子水补至20μL，进行PCR反应。具体反应条件：37℃，1h；80℃，10min；4℃，5min；25℃，1h；70℃，10min；4℃保存，(在4℃，5min期间加入T4 ligase和T4ligase Buffer各2.5μL)。PCR反应结束后，取10μL连接液加入50μL大肠杆菌DH5α感受态，立即冰浴20min；42℃，90s；冰浴3min后，在37℃，190rpm摇至45‑60min。室温离心2min，留下约200μL上清重悬菌体，将菌液均匀涂布于含有Amp的LB平板上，37℃培养16h。

[0045] (3)隔天挑取平板上单克隆进行菌落PCR验证。向PCR小管中加入2×Taq Max 7.5μL，引物3和引物4(见表1)各2μL，去离子水补至20μL，用白枪头挑取不同单菌落为模板放入各个PCR小管中，来回抽吸。具体反应条件为：95℃，3min，95℃，20s，52℃，30s，72℃，2min，共32个循环，72℃，5min，4℃保存。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳检测，点样量6μL，恒压110V，电泳约30min。使用凝胶成像仪记录结果。符合条带大小的菌落，进行摇菌，菌液送测序，根据测序结果获得CBDAS基因的序列。

[0046] 根据图1所示，以大麻的基因组为模板，使用引物1和2进行PCR扩增，基因目的条带清晰可见，通过测序可知CBDAS基因全长1632bp，编码544个氨基酸。CBDAS基因的序列如SEQ ID NO.1所示。CBDAS的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。

[0047] SEQ ID NO.1：

[0048] ATGAAGTACTCAACATTCTCCTTTTGGTTTGTTTGCAAGATAATATTTTTCTTTTTCTCATTCAATATCCAAACTTCCATTGCTAATCCTCGAGAAAACTTCCTTAAATGCTTCTCGCAATATATTCCCAATAATGCAACAAATCTAAAACTCGTATACACTCAAAACAACCCATTGTATATGTCTGTCCTAAATTCGACAATACACAATCTTAGATTCACCTCTGACACAACCCCAAAACCACTTGTTATCGTCACTCCTTCACATGTCTCTCATATCCAAGGCACTATTCTATGCTCCAAGAAAGTTGGCTTGCAGATTCGAACTCGAAGTGGTGGTCATGATTCTGAGGGCATGTCCTACATATCTCAAGTCCCATTTGTTATAGTAGACTTGAGAAACATGCGTTCAATCAAAATAGATGTTCATAGCCAAACTGCATGGGTTGAAGCCGGAGCTACCCTTGGAGAAGTTTATTATTGGGTTAATGAGAAAAATGAGAATCTTAGTTTGGCTGCTGGGTATTGCCCTACTGTTTGCGCAGGTGGACACTTTGGTGGAGGAGGCTATGGACCATTGATGAGAAACTATGGCCTCGCGGCTGATAATATCATTGATGCACACTTAGTCAACGTTCATGGAAAAGTGCTAGATCGAAAATCTATGGGGGAAGATCTCTTTTGGGCTTTACGTGGTGGTGGAGCAGAAAGCTTCGGAATCATTGTAGCATGGAAAATTAGACTGGTTGCTGTCCCAAAGTCTACTATGTTTAGTGTTAAAAAGATCATGGAGATACATGAGCTTGTCAAGTTAGTTAACAAATGGCAAAATATTGCTTACAAGTATGACAAAGATTTATTACTCATGACTCACTTCATAACTAGGAACATTACAGATAATCAAGGGAAGAATAAGACAGCAATACACACTTACTTCTCTTCAGTTTTCCTTGGTGGAGTGGATAGTCTAGTCGACTTGATGAACAAGAGTTTTCCTGAGTTGGGTATTAAAAAAACGGATTGCAGACAATTGAGCTGGATTGATACTATCATCTTCTATAGTGGTGTTGTAAATTACGACACTGATAATTTTAACAAGGAAATTTTGCTTGATAGATCCGCTGGGCAGAACGGTGCTTTCAAGATTAAGTTAGACTACGTTAAGAAACCAATTCCAGAATCTGTATTTGTCCAAATTTTGGAAAAATTATATGAAGAAGATATAGGAGCTGGGATGTATGCGTTGTACCCTTACGGTGGTATAATGGATGAGATTTCTGAATCAGCAATTCCATTCCCTCATCGAGCTGGAATCTTGTATGAGTTATGGTACATATGTAGCTGGGAGAAGCAAGAAGATAACGAAAAGCATCTAAACTGGATTAGAAATATTTATAACTTCATGACTCCTTATGTGTCCCAAAATCCAAGATTGGCATATCTCAATTATAGAGACCTTGATATAGGAATAAATGATCCCAAGAATCCAAATAATTACACACAAGCACGTATTTGGGGTGAGAAGTATTTTGGTAAAAATTTTGACAGGCTAGTAAAAGTGAAAACCCTGGTTGATCCCAATAATTTTTTTAGAAACGAACAAAGCATCCCACCTCTTCCACGGCATCGTCAT。

[0049] SEQ ID NO.2：

[0050] MKYSTFSFWFVCKIIFFFFSFNIQTSIANPRENFLKCFSQYIPNNATNLKLVYTQNNPLYMSVLNSTIHNLRFTSDTTPKPLVIVTPSHVSHIQGTILCSKKVGLQIRTRSGGHDSEGMSYISQVPFVIVDLRNMRSIKIDVHSQTAWVEAGATLGEVYYWVNEKNENLSLAAGYCPTVCAGGHFGGGGYGPLMRNYGLAADNIIDAHLVNVHGKVLDRKSMGEDLFWALRGGGAESFGIIVAWKIRLVAVPKSTMFSVKKIMEIHELVKLVNKWQNIAYKYDKDLLLMTHFITRNITDNQGKNKTAIHTYFSSVFLGGVDSLVDLMNKSFPELGIKKTDCRQLSWIDTIIFYSGVVNYDTDNFNKEILLDRSAGQNGAFKIKLDYVKKPIPESVFVQILEKLYEEDIGAGMYALYPYGGIMDEISESAIPFPHRAGILYELWYICSWEKQEDNEKHLNWIRNIYNFMTPYVSQNPRLAYLNYRDLDIGINDPKNPNNYTQARIWGEKYFGKNFDRLVKVKTLVDPNNFFRNEQSIPPLPRHRH。

[0051] 3.酵母表达载体的构建

[0052] (1)测序成功的菌液根据质粒试剂盒说明提取pGGC000‑CBDAS质粒。用含有NotI和EcoRI酶切位点的引物5和引物6(见表1)扩增pGGC000‑CBDAS质粒，PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测后再进行胶回收。将pPIC9K空载体和带接头的目的片段回收产物分别进行双酶切，反应体系为：pPIC9K空载体(或目的片段回收产物)1μg，NotI 1μL，EcoRI 1μL，10×CutSmart Buffer 2μL，去离子水补至20μL。在37℃下反应3h，65℃灭活10min。最终将反应液经1％琼脂糖凝胶电泳后，切胶回收。

[0053] (2)酶连接的反应体系：胶回收后的pPIC9K载体和目的片段的质量比例达到1:5，T4ligase Buffer 2μL，T4ligase1μL，去离子水补至20μL。25℃下反应3h。取10μL连接液加入50μL大肠杆菌DH5α感受态中，立即冰浴20min；42℃，90s；冰浴3min后，在37℃，190rpm摇至
45‑60min。室温离心2min，留下约200μL上清重悬菌体，将菌液均匀涂布于含有Kana的LB平板上，37℃培养16h。隔天挑取平板上单克隆用引物5和引物7(见表1)进行菌落PCR，鉴定阳性重组子，菌液送去测序验证，重组质粒图谱见图2。

[0054] 4.毕赤酵母转化

[0055] 将重组质粒pPIC9K‑CBDAS经SacI限制性内切酶进行线性化后纯化。每100μL毕赤酵母感受态细胞中，混入1μgpPIC9K‑CBDAS重组质粒的纯化产物，混匀加入电击杯中冰浴5min，1500V，5ms下电转后，立即加入600μL 1M预冷山梨醇混匀，30℃培养1h。室温离心
2min，留500μL上清重悬菌体。取200μL菌液涂布于MD平板上，30℃培养5d。用5mL去离子水把平板上菌落冲洗下来，取200μL菌液依次涂布于不同G418(遗传霉素)浓度(1mg/mL、2mg/mL、
4mg/mL、6mg/mL)的YPD平板上，于30℃培养5d，筛选高拷贝酵母重组子。

[0056] 5.酵母阳性重组子的筛选

[0057] 挑取YPD平板上的单克隆，采用高温‑乙酸乙酯法释放酵母基因组，方法为：用枪头挑取适量菌体，置于100μL乙酸乙酯中，充分涡旋，100℃加热至乙酸乙酯挥干；再加入50μL去离子水，充分涡旋，100℃加热5min，得到酵母单菌落DNA提取液，作为模板进行PCR反应。反应体系为：2×Taq Max 7.5μL，引物5和引物7(见表1)各2μL，酵母单菌落提取液2μL，去离子水补至15μL。PCR反应程序：95℃，3min；95℃，20s，54℃，30s，72℃，2min15 s，32个循环；
72℃，5min，4℃保存。PCR产物进行1％琼脂糖凝胶电泳鉴定，结果见图3。阳性重组子条带为
2002bp，挑选阳性单菌落进行甘油冻存。

[0058] 如图3所示，CBDAS基因片段成功插入pPIC9K表达载体中，用pPIC9K载体上引物7和CBDAS基因序列设计的引物5进行PCR扩增，获得2002bp的条带，表明pPIC9K‑CBDAS质粒已经整合到毕赤酵母GS115的染色体中。

[0059] 6.重组蛋白的诱导表达

[0060] 挑取平板上阳性重组子接种于YPD液体培养基中，30℃、190rpm培养过夜。第二天按1％量接种于20mLBMGY培养基，于30℃、190rpm培养至OD600值为6时，利用血球计数板计算9
酵母菌数量，收集菌体后用BMMY培养基(pH 6.0)重悬至菌数约为8.0×10 /mL，再于30℃、
190rpm培养，每隔24h补充1％体积比的甲醇，连续诱导48h，每组3个重复。收集菌体加入适量破菌液进行超声破碎25min，离心收集上清，再用超滤管进行换液浓缩，得到超滤浓缩后的pPIC9K‑CBDAS重组蛋白液(简称pPIC9K‑CBDAS粗酶液)。测定蛋白浓度为101.35μg/mL后用于催化活性检测。

[0061] 表1本发明使用的引物序列

[0062]

[0063] 注：下划线部分表示引物接头序列。

[0064] 实施例2

[0065] (1)取高CBGA含量大麻品种的烘干叶片，每0.1g中加入50mL甲醇，超声破碎30min后，4℃离心20min收集上清液，再用0.22μm滤膜去除杂质，得到CBGA粗提液浓度为31.4μg/mL，‑20℃保存备用。

[0066] (2)1.5mL离心管中加入100μL步骤(1)提取得到的CBGA粗提液，0.5μLTritionX‑100，实施例1制备得到的pPIC9K‑CBDAS粗酶液25μg，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)定容至500μL。在37℃分别反应0h、2h、4h、8h、12h后，加入600μL甲醇终止反应，每组三次重复；将反应液离心3min，取上清，过0.22μm滤膜，用于HPLC检测。

[0067] 检测结果显示，CBDA的产量为60.64ng/mL，CBD的产量为128.01ng/mL。

[0068] 实施例3

[0069] 1.5mL离心管中加入CBGA标准品，0.5μL TritionX‑100，实施例1制备得到的pPIC9K‑CBDAS粗酶液25μg，用0.1M柠檬酸钠缓冲液(pH 5.0)定容至500μL(CBGA的终浓度为25μΜ)。在37℃反应12h后，加入600μL甲醇终止反应，每组三次重复，将反应液离心3min，取上清，过0.22μm滤膜，用于HPLC检测。

[0070] 检测结果显示，CBDA的产量为20.12ng/mL，CBD的产量为207.87ng/mL。

[0071] 对比例1

[0072] 同实施例2，区别仅在于，在步骤(2)中，反应体系不加实施例1制备得到的pPIC9K‑CBDAS粗酶液。

[0073] 对比例2

[0074] 同实施例2，区别仅在于，在步骤(2)中，将pPIC9K‑CBDAS粗酶液替换为利用以下方法制备得到的pPIC9K粗酶液：

[0075] 将pPIC9K为空载体转入毕赤酵母，获得阳性重组子后，表达提取，得到pPIC9K粗酶液，其中转化、表达以及提取的方法同实施例1。

[0076] 对比例3

[0077] 同实施例3，区别仅在于，在步骤(2)中，反应体系不加实施例1制备得到的pPIC9K‑CBDAS粗酶液。

[0078] 对比例4

[0079] 同实施例3，区别仅在于，在步骤(2)中，将pPIC9K‑CBDAS粗酶液替换为利用以下方法制备得到的pPIC9K粗酶液：

[0080] 将pPIC9K为空载体转入毕赤酵母，获得阳性重组子后，表达提取，得到pPIC9K粗酶液，其中转化、表达以及提取的方法同实施例1。

[0081] 分别在0h、2h、4h、8h和12h后，对实施例2和对比例1‑2反应液中的CBDA和CBD含量进行检测；并在12h后对实施例3和对比例3‑4反应液中的CBDA和CBD含量进行检测，结果如图4所示。

[0082] 根据图4所示，当使用大麻叶片粗提液中CBGA为底物发生反应时，由于粗提液中含有CBDA和CBD，因此，在0h时三组均会检测到这两种物质。随着反应时间增加(0‑12h)，CK组和pPIC9K组的CBDA和CBD的含量略微下降，但差异不显著。对于pPIC9K‑CBDAS组来说，反应2h后，CBDA和CBD的含量未发生显著变化；当反应4h后，CBDA含量显著增加(P<0.05)；在8h后CBD含量显著增加，12h时生成的CBDA和CBD含量达到最大值；在重组酶CBDAS作用下，新合成CBDA 60.64ng/mL，CBD 128.01ng/mL，分别比pPIC9K组的高15.67倍和37.87倍(图4中A)。为进一步确定重组CBDAS的生物活性，减少大麻叶片粗提液中其他物质对反应的干扰，以CBGA标准品为底物，反应12h后分析重组酶催化底物CBGA产生CBDA和CBD的情况，结果如图4中B所示。CK组和pPIC9K组中未检测到CBDA，但有CBD检出，这是因为CBGA标准品中含有少量的CBD而导致；pPIC9K‑CBDAS组中新合成CBDA 20.12ng/mL，CBD 207.87ng/mL，CBD含量比pPIC9K组高9.34倍。CBDAS酶和底物发生反应直接生成CBDA，但当反应时间长于4h后，CBDA就会发生脱羧反应生成CBD，所以在8h和12h时会产生大量的CBD。

[0083] 由上可知，通过毕赤酵母重组产生大麻的CBDAS无论在大麻叶片粗提液还是标准品中，都可以催化底物CBGA生成CBDA和CBD。说明本方法能够实现通过毕赤酵母异源表达大麻二酚酸合成酶，为经济高效体外进一步催化CBGA再次合成CBD提供酶源。

[0084] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。