一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物

摘要

本发明公开了一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，涉及生物医学检测技术领域，包括：TGF‑β1、Fas和25‑羟维生素D。本发明提供的用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，能够特异性指示骨肽及其骨肽联合降钙素对大鼠骨质疏松改善后的生化指标的变化，具有更高的灵敏度和特异性。

权利要求

1.免疫组织化学染色方法，包括：所述免疫组化法的组织病理染色过程中，采用脱除福尔马林色素液对切片进行脱色处理；

所述脱除福尔马林色素液配制方法包括：取氨水溶于75％的乙醇中，再加入二甲胺乙醇溶液混合均匀即得。

2.如权利要求1所述的免疫组织化学染色方法，其特征在于，所述氨水浓度为25 28％；

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氨水与75％的乙醇的体积比为1:160 200；二甲胺乙醇溶液浓度为30 33％；二甲胺乙醇溶~ ~液与氨水的体积比为1:1 2。

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3.如权利要求1所述的免疫组织化学染色方法，其特征在于，所述脱色处理过程中去色素方法包括：取切片常规脱蜡至水后，放入脱除福尔马林色素液中处理25 35min，之后流水~冲洗10 20min，直接脱水封固，镜检观察福尔马林色素沉着程度变化情况。

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说明书

一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物

技术领域

[0001] 本发明属于生物医学检测技术领域，具体涉及一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物。

背景技术

[0002] 骨质疏松症是以骨量减少及骨组织微结构退变为特征的一种全身性骨骼疾病，伴有骨脆性增加、易发生骨折，常“静悄悄”发病。一旦被发现，多已发展到一定程度。原发性骨质疏松最主要的两个类型为：女性绝经期后骨质疏松和老年性骨质疏松。而与颇受重视的女性骨质疏松不同，男性骨质疏松发病原因多样、骨折发生率及骨折后相关的死亡率往往更高。原发性骨质疏松主要是随年龄增加，体内性激素突然减少及生理性退行性变所致。由于雌激素不仅可以抑制破骨细胞对骨质的吸收，而且可促进胶原合成并有利于骨的形成，所以随着绝经期后性激素水平的下降，骨质疏松的发病率女性远高于男性(女男＝61)。与女性绝经期后50～70岁的发病高峰相比，男性骨质疏松常晚于女性10年左右，这主要是由于男性对雌激素的依赖水平较低，且全身骨量较女性多8％～10％有关。美国患有骨质疏松症的男性占总人口的3％～6％，我国没有确切数据报告，但发病率应不低于这一比例，并将随着人口老龄化逐年增高。对于本领域而言，寻找高灵敏度和高特异性的骨质疏松诊断分子标记物对提高骨质疏松的诊断率和生存率，有重大的临床意义。

[0003] 代谢组学是了解复杂疾病历程的系统生物学技术，是关于生物体系受刺激或扰动后其代谢产物(内源代谢物质)种类、数量及其变化规律的科学。生物体中许多生命过程都是发生在小分子代谢物层面，例如细胞之间信号的释放、能量之间的传递、细胞之间通信识别等均是通过小分子代谢物相互调控而完成的，基于代谢组学层面研究机体受外界扰动刺激后的变化，对于揭示其内在机制具有重要的前瞻性意义。代谢组学基于系统和整体对骨肽的抗骨质疏松活性作用机制进行研究将有助于客观、科学的反映其在干预作用过程中对系统的动态调控及影响，阐明骨肽治疗骨质疏松过程所调控的代谢网络与靶点群。目前，关于骨肽抗骨质疏松活性及作用机制已开展一定程度的研究，在研究水平和层次上面存在很大局限性和片面性，限制了其开发和利用。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，该生物标志物能够特异性指示骨肽及其骨肽联合降钙素对大鼠骨质疏松改善后的生化指标的变化，具有更高的灵敏度和特异性。

[0005] 本发明为实现上述目的所采取的技术方案为：

[0006] 一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，包括：TGF‑β1、Fas和25‑羟维生素D。本发明公开了骨肽或其联合降钙素抗骨质疏松活性作用下，血清骨转换标志物、骨生物力学指标、骨形态力学指标以及骨组织蛋白表达情况，并在此基础上分析筛选了骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物，能够明确其代谢通路和调控网络，从而较为全面、系统的评价骨肽或其联合降钙素抗骨质疏松活性作用机制。本发明为多肽联合其它物质干预治疗骨质疏松活性功能的评价提供研究思路以及理论支撑。本发明提供的生物标志物能够特异性指示骨肽及其骨肽联合降钙素对大鼠骨质疏松改善后的生化指标的变化，进而能够有效说明骨肽及其骨肽联合降钙素对去卵巢大鼠骨质疏松的积极作用，并且在检测时具有更高的灵敏度和特异性。

[0007] TGF‑β1、Fas联合25‑羟维生素D作为生物标志物在构建用于评估骨肽干预治疗骨质疏松预后的模型中的应用。

[0008] TGF‑β1、Fas联合25‑羟维生素D作为生物标志物在构建用于评估骨肽联合降钙素干预治疗骨质疏松预后的模型中的应用。

[0009] 本发明又公开了上述生物标志物构建用于评估骨肽联合降钙素干预治疗骨质疏松预后的模型方法，具体为：

[0010] 1)将收集经骨肽处理后的动物样本构建组织芯片；

[0011] 2)采用免疫组化法检测组织芯片中TGF‑β1和Fas的表达；并测定25‑羟维生素D含量；

[0012] 3)采用H评分系统进行TGF‑β1和Fas表达水平评估，同时评估血清中25‑羟维生素D表达水平，其中：

[0013] ‑若动物样本的TGF‑β1水平≥临界值，Fas水平≥临界值，25‑羟维生素D高表达，提示动物的预后良好；

[0014] ‑若动物样本的TGF‑β1水平＜临界值，Fas水平＜临界值，25‑羟维生素D低表达，提示动物的预后不良。

[0015] 进一步的，动物样本包括骨组织和血清。

[0016] 进一步的，骨组织包括左股骨、右股骨和右胫骨。

[0017] 进一步的，H评分系统的公式如下：H score＝(∑IS×AP)；其中，IS表示染色强度，AP表示阳性染色的细胞的百分比。

[0018] 进一步的，IS取决于细胞的染色：无染色为0分，弱染色为1分，中度染色为2分，强染色为3分；AP染色细胞的百分比为：0％为0分，1％‑25％为1分，26％‑50％为2分，51％‑75％为3分，76％‑100％为4分。

[0019] 进一步的，临界值为6。

[0020] 本发明的又一目的在于，提供了TGF‑β1、Fas联合25‑羟维生素D作为生物标志物在制备骨质疏松预后检测制剂中的应用，上述检测制剂用于骨肽和/或降钙素干预治疗骨质疏松中TGF‑β1和Fas的表达水平的检测。

[0021] 一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物的筛选方法，包括：

[0022] S1：收集经骨肽处理后的动物骨组织和血清样本；

[0023] S2：测定血清中骨转换标志物含量；

[0024] S3：测定骨组织样本的生物力学指标，分析对股骨机械力学或形态力学指标的影响；

[0025] S4：采用免疫组织化学染色法测定骨微结构指标和骨组织蛋白表达；

[0026] S5：筛选并分析骨肽抗骨质疏松活性作用的差异生物标志物。

[0027] 进一步的，上述动物包括大鼠。

[0028] 进一步的，动物样本还包括经骨肽联合降钙素处理后的动物骨组织和血清。

[0029] 进一步的，骨肽处理动物中，采用骨肽溶液以灌胃方法对动物进行处理，上述骨肽溶液的浓度为依照动物体重以500mg/kg的浓度处理；采用降钙素以皮下注射法对动物进行处理，注射量为依照动物体重以10IU/kg处理。

[0030] 进一步的，血清中骨转换标志物含量的测定包括：采用全自动血清生化分析仪测定血清生化指标，试剂盒法测定骨转换标志物。

[0031] 进一步的，骨组织样本的生物力学指标采用Micro‑CT法测定。

[0032] 进一步的，股骨机械力学或形态力学指标包括：骨的最大载荷、断裂载荷、弯曲能量、刚性系数、骨BMD值、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp。

[0033] 相比于现有技术，本发明具有如下有益效果：

[0034] 本发明公开了骨肽或其联合降钙素抗骨质疏松活性作用下，TGF‑β1、Fas和25‑羟维生素D作为骨肽抗骨质疏松活性的生物标志物，能够特异性指示骨肽及其骨肽联合降钙素对大鼠骨质疏松改善后的生化指标的变化，进而能够有效说明骨肽及其骨肽联合降钙素对去卵巢大鼠骨质疏松的积极作用，并且在检测时具有更高的灵敏度和特异性。本发明为多肽联合其它物质干预治疗骨质疏松活性功能的评价提供研究思路以及理论支撑。

[0035] 因此，本发明提供了一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物，该生物标志物能够特异性指示骨肽及其骨肽联合降钙素对大鼠骨质疏松改善后的生化指标的变化，具有更高的灵敏度和特异性。

附图说明

[0036] 图1是骨代谢标志物BMD值单独用于检测诊断是否患有骨质疏松的ROC分析曲线；

[0037] 图2是TGF‑β1作为标志物单独用于检测诊断是否患有骨质疏松的ROC分析曲线；

[0038] 图3是Fas作为标志物单独用于检测诊断是否患有骨质疏松的ROC分析曲线；

[0039] 图4是TGF‑β1和Fas作为标志物联合用于检测诊断是否患有骨质疏松的ROC分析曲线；

[0040] 图5是TGF‑β1、Fas和25‑羟基维生素D作为标志物联合用于检测诊断是否患有骨质疏松的ROC分析曲线。

具体实施方式

[0041] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合实施例对本发明的各实施方式进行详细的阐述。然而，本领域的普通技术人员可以理解，在本发明各实施方式中，为了使读者更好地理解本申请而提出了许多技术细节。但是，即使没有这些技术细节和基于以下各实施方式的种种变化和修改，也可以实现本申请所要求保护的技术方案。

[0042] 本发明实施例所用大鼠为微清洁级3月龄健康雌性大鼠，体重280～300g。所有大鼠均在25℃、相对湿度60～80％的清洁环境中分笼饲养，自由进食水，按照大鼠生长习性设定12h昼夜周期，进行一周适应性饲养。

[0043] 本发明实施例所用骨肽为市购获得，购自西安米先尔生物科技有限。

[0044] 实施例1：

[0045] 一种用于骨肽干预治疗骨质疏松中的生物标志物的筛选，包括：

[0046] S1：收集经骨肽处理后的动物骨组织和血清样本；

[0047] S2：测定骨组织样本的生物力学指标，分析对股骨机械力学或形态力学指标的影响；

[0048] S3：测定血清中骨转换标志物含量；

[0049] S4：采用免疫组织化学染色法测定骨微结构指标和骨组织蛋白表达；

[0050] S5：筛选并分析骨肽抗骨质疏松活性作用的差异生物标志物。

[0051] 具体的：

[0052] 1.大鼠模型建立

[0053] 180只大鼠随机分为6组，每组30只。随机取一组(假手术组)，采用戊巴比妥钠(体积浓度1％，40mg/kg BW)麻醉，去除大鼠卵巢附近的少许脂肪；取剩余组(手术组)大鼠同样麻醉后，进行去卵巢手术。手术后恢复4周，观察大鼠恢复情况，均表现出良好的恢复状况。

[0054] 2、样本采集

[0055] 将手术组分为阴性对照组(M组)、阳性对照组(E组)、低浓度处理组(A组)、中浓度处理组(B组)以及高浓度处理组(C组)。将骨肽溶于超纯水中依次按照灌胃浓度100mg/kg(低浓度)、200mg/kg(中浓度)、500mg/kg(高浓度)灌胃处理；阴性对照组等体积灌胃超纯无菌水；阳性对照组灌胃17β‑estradiol 50μg/kg。

[0056] 样本采集，每四周收集12h尿液，加入防腐剂NaN3(1M浓度)，4℃条件下离心，取上清液置于‑80℃冰箱保存。于十二周时，进行12h空腹，采用戊巴比妥钠(体积浓度1％，40mg/kg BW)麻醉，腹主动脉采血，于4℃下静置3h，离心取上层血清，分装于0.5mL的EP管中，放置于‑80℃冰箱中保存。大鼠灌胃实验接受后，按照操作规程处死大鼠，取两侧股骨、胫骨，除去骨组织周围附着的肌肉、软组织。其中，右侧胫骨采用磷酸‑福尔马林缓冲液固定，24h石蜡切片进行H&E染色处理，用于检测股骨骨形态计量学分析；两侧股骨用生理盐水浸润、清洗3次，浸润生理盐水的医用纱布包裹，再包裹锡纸，置于‑20℃冰箱中冷冻保存，用于大鼠股骨骨小梁微观结构和骨生物力学指标的机械强度试验。

[0057] 3、生化指标测定

[0058] 血清骨转换标志物含量测定，采用全自动血清生化分析仪测定血清生化指标，试剂盒法测定骨转换标志物，包括：骨钙素、抗酒石酸酸性磷酸酶(TRACP)、骨碱性磷酸酶(BAP)；采用ELISA方法测定大鼠血清25‑羟基维生素D含量。

[0059] 左侧股骨生物力学指标检测方法，三点弯曲试验测定骨生物力学。具体为：取骨组织置于万能材料试验机中，设置10mm跨距、2mm/min加载速度，软件自动记录断裂载荷、最大载荷、弹性挠度、弯曲能量、刚性系数。

[0060] 右侧胫骨骨微结构指标测试方法，取右侧胫骨标本，用10％福尔马林固定液固定48h，接着EDTA脱钙30d，石蜡包埋，然后切成3mm切片，接着对胫骨组织染色，并自动数字扫描系统下进行胫骨组织学观察。

[0061] 免疫组织化学染色观察具体为：石蜡切片脱蜡、入水，用3％ H2O2封闭内源性过氧化物酶，正常羊血清封闭，并采用sABC免疫酶标法进行免疫组化染色；取工作浓度1:300的TGF‑β1多克隆抗体和工作浓度1:200的Fas多克隆抗体放置于4℃条件下过夜，然后用0.1MPBS洗3次，接着滴加入二抗，37℃条件下放置于20min，用0.1M PBS洗3次，再滴加sABC，
20min后用0.1M PBS洗4次(一次5min)；最后加入新鲜配制的DBA显色剂，于室温下控制反应时间，然后用蒸馏水冲洗、苏木素复染，酒精脱水、透明、中性树胶封片。

[0062] 指标观察：显微镜下观察免疫复合物沉积部位及免疫反应强度；测试过程中阳性对照为已知阳性染色的切片，阴性对照为用PBS替代一抗。需要说明：当细胞膜、胞浆和(或)细胞核出现棕黄色阳性物质即判断为阳性细胞；骨组织中TGF‑β1和Fas蛋白表达的阳性颗粒的参数值包括平均灰度和阳性单位。图象分析及数据统计分析：免疫组化测量，在400倍视野下选取5个视野(于每张玻片中均进行该项操作)，并采用高清晰度彩色病理图文报告分析系统分别测定骨组织TGF‑β1和Fas表达的阳性颗粒各参数值。

[0063] 4、统计学处理

[0064] 所有计量数据均使用x±s表示，并应用SPSS13.0软件完成统计学分析。P＜0.05则可在统计学范畴认定差异有意义。

[0065] 5、结果分析

[0066] (1)股骨形态力学性能

[0067] 表1处理后股骨形态力学指标测试结果

[0068] 组别 BMD值(g/cm3) BV/TV(％) Tb.Th(μm) Tb.N(1/mm) Tb.Sp(μm)M组 0.928±0.013 18.4±0.2 45.7±2.1 2.8±0.2 320.7±4.6E组 0.983±0.010 32.1±0.5 73.8±3.9 3.7±0.3 132.8±3.1
A组 0.947±0.009 18.6±0.4 47.2±3.8 3.0±0.4 305.6±3.5
B组 0.956±0.011 19.0±0.3 48.0±2.0 3.2±0.2 244.1±2.8
C组 0.961±0.012 28.7±0.4 49.6±2.7 3.3±0.1 192.4±3.2
假手术组 1.122±0.021 35.4±0.3 76.3±3.2 4.4±0.3 131.5±2.4

[0069] 从表1中的数据分析可知，与假手术组相比，M组中大鼠股骨BMD值、BV/TV、Tb.Th、Tb.N均呈显著下降趋势(P<0.05)，Tb.Sp呈显著上升趋势(P<0.05)，表明去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功。其中，A组、B组和C组大鼠之间股骨BMD、Tb.Th、Tb.N无显著差异；而高浓度处理组(C组)大鼠能够显著提高大鼠股骨骨密度、BV/TV、Tb.N，降低Tb.Sp，表现出优异的改善大鼠骨质疏松的潜力。

[0070] (2)股骨机械力学性能

[0071] 表2处理后股骨机械力学指标测试结果

[0072]

[0073]

[0074] 从表2中的数据分析可知，与假手术组相比，M组中大鼠股骨最大载荷、断裂载荷、弯曲能量、刚性系数均呈下降趋势，且最大载荷、断裂载荷显著降低呈显著下降(P<0.05)，表明去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功。其中，A组、B组、C组与E组大鼠股骨最大载荷、断裂载荷均表现为明显的上升；A组、B组和C组之间无显著差异(P>0.05)；同时，A组、B组、C组与E组各组之间大鼠股骨弯曲能量、刚性系数均无显著性差异。

[0075] (3)血清骨转换标志物探究

[0076] 表3血清骨转换标志物含量测试结果

[0077] 组别 抗酒石酸性磷酸酶(U/L) 骨碱性磷酸酶(U/L) 25‑羟维生素D(nmol/L)M组 62.1±3.4 31.7±3.1 69.35±0.97E组 45.8±3.0 40.3±2.4 85.43±1.16
A组 57.6±4.1 37.9±2.0 69.98±1.05
B组 51.3±2.8 42.8±3.2 70.14±1.23
C组 49.5±2.9 46.1±0.4 71.06±0.89
假手术组 43.5±2.3 54.1±3.8 88.67±1.35

[0078] 从表3中的数据分析可知，与假手术组相比，M组中大鼠血清骨碱性磷酸酶、25‑羟维生素D均呈显著下降(P<0.05)，抗酒石酸性磷酸酶呈显著上升(P<0.05)，表明去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功。其中，A组、B组和C组大鼠之间大鼠血清25‑羟维生素D无显著差异；A组、B组和C组与阳性对照组大鼠血清骨碱性磷酸酶显著提升(P<0.05)，血清抗酒石酸性磷酸酶显著下降(P<0.05)，并且不同浓度骨肽处理组之间表现出一定的浓度效应，说明骨肽具有与雌二醇相同的改善骨质疏松相关骨转换标志物的效果。

[0079] (4)骨组织蛋白表达

[0080] 表4TGF‑β1和Fas表达结果

[0081]

[0082]

[0083] 从表4中的数据分析可知，与假手术组相比，M组中大鼠股骨组织中TGF‑β1蛋白表达和Fas蛋白表达的阳性颗粒的平均灰度和阳性单位均明显增高(P<0.05)，表明去卵巢骨质疏松大鼠模型构建成功。其中，A组、B组、C组与E组大鼠股骨组织中TGF‑β1蛋白表达和Fas蛋白表达的的阳性颗粒的平均灰度和阳性单位均显著增高(P<0.05)；提示骨肽可能通过调节TGF‑β1和Fas的合成与分泌改善骨质疏松。

[0084] C组中染色结果分析

[0085] 表5TGF‑β1和Fas在骨组织中的差异表达

[0086]变量 N <6分 ≥6分 表达率(％)
TGF‑β1 30 13 17 56.66
Fas 30 14 16 53.33

[0087] 实验分析中，将H‑score＝6分定义为临界值，将H‑score≥6分定义为TGF‑β1和Fas高表达组，H‑score<6分定义为TGF‑β1和Fas低表达组。

[0088] 实施例2：

[0089] 骨肽联合降钙素干预治疗骨质疏松中的生物标志物探究

[0090] 骨肽联合降钙素干预治疗骨质疏松中的生物标志物的筛选方法同实施例1。

[0091] 具体的：

[0092] 1、大鼠模型建立同实施例1；

[0093] 2、样品采集过程中，实验组别在实施例1的基础上，增加联合处理组(D组)：将骨肽溶于超纯水中依次按照灌胃浓度500mg/kg(高浓度)灌胃处理，给予降钙素10IU/kg，皮下注射；

[0094] 3、生化指标测定同实施例1；

[0095] 4、统计学处理同实施例1；

[0096] 5、结果分析

[0097] 表6联合处理组各项指标测试结果

[0098]

[0099]

[0100] 从表6中的数据以及结合表1～4中的数据分析，相比于M组和C组，联合处理组中股骨BMD值、BV/TV、Tb.Th、Tb.N、Tb.Sp具有显著差异，血清骨碱性磷酸酶显著提升，血清抗酒石酸性磷酸酶显著下降(P<0.05)，尤其大鼠股骨组织中TGF‑β1蛋白表达和Fas蛋白表达的的阳性颗粒的平均灰度和阳性单位均显著增高(P<0.05)。25‑羟基维生素D含量明显提升，实验分析中将治疗后大鼠血清25‑羟基维生素D含量/治疗前大鼠血清25‑羟基维生素D含量＝1.2(即D组大鼠血清25‑羟基维生素D含量/M组大鼠血清25‑羟基维生素D含量)作为截断值，≥1.2定义为大鼠血清25‑羟基维生素D高表达；<1.2定义为大鼠血清25‑羟基维生素D低表达。此时，D组中大鼠血清25‑羟基维生素D表现为高表达。

[0101] D组染色结果分析

[0102] 表7TGF‑β1和Fas在骨组织中的差异表达

[0103]变量 N <6分 ≥6分 表达率(％)
TGF‑β1 30 2 29 93.33
Fas 30 1 28 96.67

[0104] 实验分析中，将H‑score＝6分定义为临界值，将H‑score≥6分定义为TGF‑β1和Fas高表达组。

[0105] 实施例3：

[0106] ROC分析

[0107] ROC分析采用SPSS 20.0软件完成，分析组包括：对照组为已知骨代谢标志物(骨BMD值)单独用于检测诊断是否患有骨质疏松；实验组1，TGF‑β1作为标志物单独使用；实验组2，Fas作为标志物单独使用；实验组3，TGF‑β1和Fas作为标志物联合使用；实验组4：TGF‑β1、Fas和25‑羟基维生素D作为标志物联合使用。

[0108] 测试结果如图1‑5所示。从图中分析可知，实验组3联合采用TGF‑β1和Fas作为标志物，曲线下面积(AUC)为0.74，明显优于对照组和单独使用的实验组1和实验组2的，表明采用TGF‑β1和Fas作为标志物的灵敏度和特异性要好于单独使用的。实验组4联合采用TGF‑β1、Fas和25‑羟基维生素D联合作为标志物，曲线下面积(AUC)为0.82，明显优于对照组和实验组1‑3的，表明采用TGF‑β1、Fas和25‑羟基维生素D联合作为标志物，具有更佳的检测诊断灵敏度和特异性，其诊断性能进一步提高。

[0109] 实施例4：

[0110] 免疫组织化学染色方法探究

[0111] 在组织病理染色过程中，福尔马林色素易与含铁血黄素和DAB显色的棕褐色颗粒混淆，可影响组织切片的回顾性研究观察，有时甚至干扰病理诊断。针对此，本发明提供了一种新型脱除福尔马林色素液，其配制方法包括：取氨水溶于75％的乙醇中，再加入二甲胺乙醇溶液混合均匀即得。其中，氨水浓度为25～28％；氨水与75％的乙醇的体积比为1:160～200；二甲胺乙醇溶液浓度为30～33％；二甲胺乙醇溶液与氨水的体积比为1:1～2。本发明在组织病理染色过程中，采用脱色素试剂对切片进行脱色处理，能够有效避免或减少福尔马林色素带来的干扰，更好地进行研究、诊断。并且在脱色素试剂中加入二甲胺，与其它组分协同作用，进一步增强了脱色素试剂对福尔马林色素的脱除作用，色素脱除效果更加彻底。

[0112] 去色素方法包括：取切片常规脱蜡至水后，放入脱除福尔马林色素液中处理25～35min，之后流水冲洗10～20min，直接脱水封固，镜检观察福尔马林色素沉着程度变化情况。

[0113] 实验组：

[0114] 新型脱除福尔马林色素液，配制方法包括：取28％浓度的氨水1.2mL，溶于200mL 75％的乙醇中，再加入30％浓度的二甲胺乙醇溶液1mL混合均匀即得。

[0115] 对比组：

[0116] 新型脱除福尔马林色素液，配制方法包括：取28％浓度的氨水1.2mL，溶于200mL 75％的乙醇中，混合均匀即得。

[0117] 实验测试

[0118] 取福尔马林固定液固定2年以上的大鼠脾脏标本，进行常规脱水、透明、浸蜡、包埋，石蜡切片。切片组织为选择福尔马林色素较多的组织块进行处理得到的。

[0119] 取切片常规脱蜡至水后，放入脱除福尔马林色素液(实验组或对比组配制的)中处30min，之后流水冲洗16min；该步骤加在DAB显色试剂盒进行DAB显色之后。另外再制作不进行去色素处理的样本作为空白对照，以此为参考，通过镜检观察细胞质内棕色颗粒周围散在的棕黑色福尔马林色素变化情况。

[0120] 结果分析

[0121] 测试结果如表8所示：

[0122] 表8免疫化显色处理后去色素操作效果

[0123]试剂 去色素处理
实验组 ++++
对比组 +++

[0124] #：+，减弱；++，明显减弱；+++，能判明结果；++++，最佳结果。

[0125] 从表8中数据分析可知，本发明提提供的实验组的去色素效果明显好于对比组的，表面在脱除福尔马林液中加入二甲胺乙醇溶液，与其它组分复配使用，对切片组织中福尔马林色素的去除进一步增强，显著提升试剂的去色素能力。原因可能在于二甲胺的存在，能够促进氨水去除福尔马林色素的效果，同时其本身也具有一定的碱性，起到一定的消除福尔马林色素酸性的能力，使得试剂最终呈现出更佳的色素去除能力，脱色素效果更加彻底，对染色不产生影响，进而更有利于切片进行后续研究观察，有效减少干扰因素。

[0126] 上述实施例中的常规技术为本领域技术人员所知晓的现有技术，故在此不再详细赘述。

[0127] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。