分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物

摘要

本发明提供了一种分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物，涉及基因检测领域。该用于分析MSI的标志物包括分别位于SULF2、SEC31A、TGFBR2、EIF4E3、ACVR2A、TAOK3、DIDO1和UBAC2基因的标志物。本发明提供的检测方法基于熔解曲线分析法，具有分析速度快、成本低和准确度高等优点。

权利要求

1.用于检测标志物的引物探针组合物，其特征在于，所述标志物用于分析微卫星不稳定性，包含MS1 MS8：~

MS1：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人基因SULF2并起始于chr20：47657577；

MS2：包含9个连续T的同聚物重复，其定位在人SEC31A基因并起始于chr4：82864412；

MS3：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人TGFBR2基因并起始于chr3：30650380；

MS4：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人EIF4E3基因并起始于chr3：71690181；

MS5：包含8个连续A的同聚物重复，其定位在人ACVR2A基因并起始于chr2：147926117；

MS6：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人TAOK3基因并起始于chr12：118238179；

MS7：包含11个连续A的同聚物重复，其定位在人DIDO1基因并起始于chr20：62905340；

MS8：包含12个连续T的同聚物重复，其定位在人UBAC2基因并起始于chr13：99238595；

所述引物探针组合物基于荧光PCR熔解曲线分析检测所述标志物，包含分别用于扩增各标志物的引物对和用于提供荧光信号的探针；所述探针为分子信标探针，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团；

所述引物探针组合物中引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1 16；探针的核苷酸序列选~自SEQ ID NO.19 26。

~

2. 根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，还包括用于检测内参基因的引物对和探针；用于检测内参基因的引物对的核苷酸序列如SEQ ID NO.17和18所示；用于检测内参基因的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。

3.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，各引物对中包括限制性引物和过量引物，过量引物的数量大于限制性引物的数量，所述限制性引物与所述探针具有相同的方向，过量引物产生的单链模板与所述分子信标探针进行互补配对；其中，用量较少的一条引物为所述限制性引物，用量较大的一条引物为所述过量引物。

4.根据权利要求3所述的引物探针组合物，其特征在于，限制性引物与过量引物的摩尔比例为1:5 15。

~

5.根据权利要求1所述的引物探针组合物，其特征在于，探针的Tm值不低于扩增步骤中的退火温度。

6. 用于检测权利要求1中的所述标志物的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1 5任一~项所述的引物探针组合物，和，PCR buffer、盐、酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、阴性对照、阳性对照和荧光染料中的一种或多种。

7.权利要求1 5任一项所述的引物探针组合物，或权利要求6所述的试剂盒在以下任意~一项中的应用：

（ⅰ）非诊断和治疗目的的分析微卫星不稳定性；

（ⅱ）制备用于分析微卫星不稳定性状态的产品；

（ⅲ）制备癌症检测产品。

8.非诊断和治疗目的的基于荧光PCR熔解曲线分析微卫星不稳定性状态的方法，其特征在于，包括PCR扩增后生成熔解曲线数据，标志物的Tm值范围内有熔解峰，判定为微卫星不稳定位点；标志物的Tm值范围内无熔解峰，判定为微卫星稳定位点；然后根据微卫星不稳定位点个数判断待测样本的微卫星不稳定性状态；扩增步骤使用权利要求1 5任一项所述~的引物探针组合物进行扩增。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，在PCR扩增步骤结束后进行熔解曲线分析前，包括将反应体系降温，降温速度低于10℃/s。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，MS1的Tm值范围为47.0℃ 50.5℃，和/或，~MS2的Tm值范围为54 58℃；和/或，MS3的Tm值范围为53.0℃ 57.5℃；和/或，MS4的Tm值范围~ ~为50.0℃ 54.0℃；和/或，MS5的Tm值范围为49.0℃ 53.5℃；和/或，MS6的Tm值范围为53.0~ ~℃ 57.0℃；和/或，MS7的Tm值范围为55.0℃ 58.5℃；和/或，MS8的Tm值范围为52.0℃ 55.0~ ~ ~℃。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，包括四个反应体系，各反应体系分别使用第一 第四引物探针组扩增；

~

第一引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1 2和19所示的用于扩增MS1的引~物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3 4和20所示的用于扩增MS2的引物对和探~针；

第二引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5 6和21所示的用于扩增MS3的引~物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7 8和22所示的用于扩增MS4的引物对和探~针；

第三引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9 10和23所示的用于扩增MS5的~引物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11 12和24所示的用于扩增MS6的引物对和~探针；

第四引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13 14和25所示的用于扩增MS7的~引物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15 16和26所示的用于扩增MS8的引物对和~探针。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，各反应体系中还包括用于检测内参基因的引物对和探针。

说明书

分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及基因检测领域，尤其是涉及一种分析微卫星不稳定性的标志物、方法和引物探针组合物。

背景技术

[0002] 微卫星（microsatellite，MS）是遍布于人类基因组中以少数几个核苷酸（多为1 6~个）为单位串联重复的DNA序列，也被称为短串联重复序列（short tandem repeat，STR），有单核苷酸、双核苷酸或多核苷酸重复，重复次数为5 50次。与正常细胞相比，肿瘤细胞内的~
微卫星由于重复单位的插入或缺失而导致微卫星长度的改变，被称为微卫星不稳定性（microsatellite instability，MSI）。研究表明，MSI是由错配修复（MMR）基因发生缺陷引起的现象，与肿瘤的发生密切相关。MMR蛋白功能缺陷同时也会导致基因组呈现高突变表型，进而导致肿瘤发生风险增加。目前，MSI检测被美国国立综合癌症网络（National Comprehensive Cancer Network，NCCN）结直肠癌临床实践指南及中国临床肿瘤学会（Chinese Society of Clinical Oncology，CSCO）结直肠癌诊疗指南推荐用于所有结肠直肠癌（colorectal，CRC）患者。MSI检测对于包括CRC和子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）在内的多种实体瘤患者均具有重要临床意义。

[0003] MSI分为三类：①高频微卫星不稳定（High‑frequency microsatellite instability，MSI‑H）：2个或2个以上微卫星位点不稳定（或检测的大板标记中>30％的位点不稳定）。②低频微卫星不稳定（Low‑frequency microsatellite instability，MSI‑L）：只有1个微卫星位点不稳定（10％～30％标记位点不稳定）。③微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS）：无不稳定微卫星位点（<10％标记点不稳定）。

[0004] 目前，多重荧光PCR‑毛细管电泳法检测MSI状态是国际公认的金标准，NCCN、ASCO等国际知名机构联合推荐。同时提取同一患者的正常组织和肿瘤组织样本DNA，采用多重荧光PCR的方法对检测位点进行扩增，再通过毛细管电泳对扩增产物进行检测，并利用专业软件对两种组织来源检测结果进行对比分析，能准确的给患者MSI状态进行分型。但是多重荧光PCR毛细管电泳法，耗材成本高，检测时间长，操作比较复杂。

[0005] 免疫组化（IHC）方法可以对MMR相关蛋白（MLH1，MSH2，MSH6，PMS2）进行检测，需要将对应的蛋白进行荧光标记，通过显微镜观察是否在细胞内正常表达，来判断MMR是否存在缺陷。需要注意的是，以MMR蛋白/MSI检测作为初筛手段，有可能漏诊部分林奇综合征患者。MMR蛋白表达及MSI（基于不同的微卫星位点选择的DNA检测）对林奇综合征的检测敏感度分别为83%和77% 89%，提示即使对所有CRC患者进行MMR或MSI普筛，也可能存在高达10%的漏~
诊率由于需要肉眼观察，对观测者要求比较高，同时方法本身灵敏度相对金标准稍微低一些，因此，临床一般采用金标准毛细管电泳法为主，免疫组化为辅助。

[0006] 二代测序（NGS）方法可以作为MSI检测的一种手段，通过构建文库，利用二代测序仪对文库进行测序，再用生信算法对MSI位点进行分析，判断MSI长度是否发生变化，来推断MSI位点是否存在不稳定。但是二代测序的检测耗时比较长，成本高，随着测序技术不断的革新，仍在不断的探索中。

[0007] 上述的几种检测MSI的方法各有所长，也各有缺点，当下迫切需要一种可以博采众长，既省时省力又节约成本，高精度，操作简单，实现MSI状态的检测方法。

[0008] 有鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0009] 本发明的目的在于提供一组准确度高的用于分析微卫星不稳定性的标志物，以及检测上述标志物的引物探针组合物和试剂盒，以及它们的应用；本发明的目的还在于提供一种基于荧光PCR熔解曲线分析微卫星不稳定性状态的方法，以缓解现有技术中存在的检测MSI的方法中的至少一个缺陷。

[0010] 为解决上述技术问题，本发明特采用如下技术方案：

[0011] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于分析微卫星不稳定性的标志物，包含如下MS1 MS8中的至少1、2、3、4、5、6、7或8个标志物：~

[0012] MS1：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人基因SULF2并起始于chr20：47657577；MS2：包含9个连续T的同聚物重复，其定位在人SEC31A基因并起始于chr4：
82864412；MS3：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人TGFBR2基因并起始于chr3：
30650380；MS4：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人EIF4E3基因并起始于chr3：
71690181；MS5：包含8个连续A的同聚物重复，其定位在人ACVR2A基因并起始于chr2：
147926117；MS6：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人TAOK3基因并起始于chr12：
118238179；MS7：包含11个连续A的同聚物重复，其定位在人DIDO1基因并起始于chr20：
62905340；MS8：包含12个连续T的同聚物重复，其定位在人UBAC2基因并起始于chr13：
99238595。

[0013] 根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测上述标志物的引物探针组合物，所述引物探针组合物基于荧光PCR熔解曲线分析检测所述标志物，包含分别用于扩增各标志物的引物对和用于提供荧光信号的探针，所述引物对扩增各标志物的同聚物重复或其突变形式的区域；所述探针为分子信标探针，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。

[0014] 根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测上述试剂盒，包括检测上述标志物的检测试剂。

[0015] 根据本发明的另一个方面，还提供了一种上述用于分析微卫星不稳定性的标志物，或上述引物探针组合物，或上述试剂盒的在以下任意一项中的应用：

[0016] （ⅰ）分析微卫星不稳定性；

[0017] （ⅱ）制备用于分析微卫星不稳定性状态的产品；

[0018] （ⅲ）制备癌症检测产品。

[0019] 根据本发明的另一个方面，还提供了一种基于荧光PCR熔解曲线分析微卫星不稳定性状态的方法，包括PCR扩增后生成熔解曲线数据，标志物的Tm值范围内有熔解峰，判定为微卫星不稳定位点；标志物的Tm值范围内无熔解峰，判定为微卫星稳定位点；然后根据微卫星不稳定位点个数判断待测样本的微卫星不稳定性状态；扩增步骤使用上述引物探针组合物进行扩增。

[0020] 与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

[0021] 本发明提供的标志物同聚物重复长度集中在8 12bp范围内，可检测人群的MSI状~态，准确度高。经验证，检测特异性100％，灵敏度100％，检测性能非常优异；该标志物组合可使用荧光PCR平台进行检测，相比一代测序、二代测序，仪器价格从百万左右降低至约10万，检测平台通用性高，成本大大降低。

[0022] 本发明提供的微卫星不稳定性状态的方法基于荧光PCR熔解曲线分析，具有快速、成本低、准确度高等优点，只需在荧光PCR仪上即可进行分析。且还具有通用性佳的优点，检测的判读无需软件算法，直接根据熔解峰的“有/无”进行判断，可快速进行肉眼判读。

[0023] 本发明提供的用于检测上述标志物组合的引物探针组合物能够实现多重检测，可以采用多色探针熔解曲线法分析，提高了检测多重度，试剂盒在一台荧光PCR仪上，可2小时左右完成24 48个样本的检测，通量适中，检测时间快。~

附图说明

[0024] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0025] 图1是实施例4中利用本发明检测临床阴性样本部分熔解曲线线性图；

[0026] 图2是实施例4中利用本发明检测临床阳性样本部分熔解曲线线性图。

具体实施方式

[0027] 下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0028] 下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。

[0029] 本文中所用的术语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”或其任何其它变形，意在覆盖非排它性的包括。例如，包含所列要素的组合物、步骤、方法、制品或装置不必仅限于那些要素，而是可以包括未明确列出的其它要素或此种组合物、步骤、方法、制品或装置所固有的要素。

[0030] 当量、浓度、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，当公开了范围“1～5”时，所描述的范围应被解释为包括范围“1～4”、“1～3”、“1～2”、“1～2和4～5”、“1～3和5”等。当数值范围在本文中被描述时，除非另外说明，否则该范围意图包括其端值和在该范围内的所有整数和分数。

[0031] “和/或”用于表示所说明的情况的一者或两者均可能发生，例如，A和/或B包括（A和B）和（A或B）。

[0032] 本文中，序号用于区分不同的组成或条件，不意味着这些组成或条件之间具有先后顺序，不能理解为，也并未暗示序号更靠前的组成、条件或步骤更重要。例如标志物MS1、MS2、MS3、MS4、MS5、MS6、MS7和MS8只是用于区分不同的标志物，并不意味着编号顺序在前的MS1比编号顺序在后的，例如MS6、MS7或MS8具有更好的技术效果。本文中诸如A1和A2；B1、B2和B3；罗马数字序号标记的条件等应做同样理解。

[0033] 本文中，引物对和探针可以指具体的一条探针，也可以指用于扩增同一标志物的一类引物对和探针。

[0034] 本文中，MS表示微卫星（microsatellite）；MSI表示微卫星不稳定性（microsatellite instability）；MSI‑H：高频微卫星不稳定（High‑frequency microsatellite instability），为2个或2个以上微卫星位点不稳定；MSI‑L：低频微卫星不稳定（Low‑frequency microsatellite instability），为只有1个微卫星位点不稳定；MSS：
微卫星稳定（Microsatellite stability，MSS），为无不稳定微卫星位点。前述中的英文、英文缩写以及中文可以任意的互相替换使用。

[0035] 根据本发明的一个方面，提供了一组用于分析微卫星不稳定性的标志物，包含如下MS1 MS8中的至少1、2、3、4、5、6、7或8个标志物，优选包括全部标志物：~

[0036] MS1：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人基因SULF2并起始于chr20：47657577；

[0037] MS2：包含9个连续T的同聚物重复，其定位在人SEC31A基因并起始于chr4：82864412；

[0038] MS3：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人TGFBR2基因并起始于chr3：30650380；

[0039] MS4：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人EIF4E3基因并起始于chr3：71690181；

[0040] MS5：包含8个连续A的同聚物重复，其定位在人ACVR2A基因并起始于chr2：147926117；

[0041] MS6：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人TAOK3基因并起始于chr12：118238179；

[0042] MS7：包含11个连续A的同聚物重复，其定位在人DIDO1基因并起始于chr20：62905340；

[0043] MS8：包含12个连续T的同聚物重复，其定位在人UBAC2基因并起始于chr13：99238595。

[0044] 根据本发明的另一个方面，还提供了用于检测前述标志物的引物探针组合物，所述引物探针组合物基于荧光PCR熔解曲线分析检测所述标志物，包含分别用于扩增各标志物的引物对和用于提供荧光信号的探针，所述引物对扩增各标志物的同聚物重复或其突变形式的区域；所述探针为分子信标探针，所述探针的两端分别标记有荧光基团和淬灭基团。荧光基团和淬灭基团可选自本领域一般的、公知的任何的荧光基团和淬灭基团，本发明对此不做限制。荧光基团包括但不限于FAM、VIC、TET、JOE、HEX、CY3、CY5、TAMRA、ROX、Texas Red或Cy5中的一种或多种；淬灭基团包括但不限于HQ1、BHQ2、BHQ3、MGB或Dabcyl中的一种或多种。

[0045] 可选的实施方式中，各引物对中包括限制性引物和过量引物，过量引物的量大于限制性引物的量，所述限制性引物与探针具有相同的方向，过量引物产生的单链模板与所述分子信标探针进行互补配对。

[0046] 可选的实施方式中，限制性引物与过量引物的摩尔比例为1:5 15，例如可以为但~不限于为1:5、1:6、1:7、1:8、1:9、1:10、1:11、1:12、1:13、1:14或1:15。

[0047] 可选的实施方式中，探针的Tm值不低于扩增步骤中的退火温度。

[0048] 可选的实施方式中，所述引物探针组合物还包括用于检测内参基因的引物对和探针。内参可选择本领域可接受的任何内参基因，包括但不限于编码如下蛋白的基因：核糖核酸酶P、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶、β微球蛋白、β微管蛋白、18sRNA、β‑actin肌动蛋白或TATA结合蛋白。

[0049] 可选的实施方式中，内参基因选自编码β‑actin肌动蛋白的基因，引物对的核苷酸序列分别如SEQ ID 17 18所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.27所示。~

[0050] 可选的实施方式中，引物探针组合物中的引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1 16~中的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15或16条；和/或，探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO.19 26中的至少1、2、3、4、5、6、7或8条。
~

[0051] 可选的实施方式中，引物探针组合物中的引物的核苷酸序列选自SEQ ID NO.1~16，以及，探针的核苷酸序列选自SEQ ID NO.19 26。
~

[0052] 根据本发明的另一个方面，还提供了一种用于检测所述标志物的试剂盒，该试剂盒包括检测所述标志物的检测试剂，检测试剂可根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的教材、参考文献、工艺手册、商品说明或标准文件中的记载，根据本领域的一般知识来选择，本发明对此不做限制。

[0053] 可选的实施方式中，所述试剂盒包括（B1）或（B2）：

[0054] （B1）前述实施方式中的用于扩增MS1 MS8的引物对中的至少一对，以用于PCR方法~或基于PCR原理改进的方法，例如与其他种类探针、荧光染料或反应体系配合使用。

[0055] （B2）前述实施方式中的用于基于熔解曲线分析法检测所述标志物的引物探针组合物。

[0056] 可选的实施方式中，所述试剂盒包括（C1）（C3）中的至少一种：~

[0057] （C1）荧光熔解曲线法所使用的试剂。

[0058] （C2）PCR buffer、盐、酶、dATP、dCTP、dGTP、dTTP、dUTP、阴性对照、阳性对照和荧光染料中的一种或多种。

[0059] （C3）阴性对照和/或阳性对照。

[0060] 在某个具体的实施方式中，试剂盒的组成如下：包括PCR反应条、PCR反应液、PCR混合酶、阴性对照、阳性对照，试剂盒组成如下表所示：

[0061] 表1

[0062]

[0063] 所述的PCR 反应条为8孔PCR管，每4个PCR反应孔检测1个样本。每个反应孔含有检测目的基因和内参基因的引物、探针等组分。

[0064] 表2PCR反应条的组成

[0065]

[0066] 根据本发明的另一个方面，还提供了前述用于分析微卫星不稳定性的标志物，或前述引物探针组合物，或前述试剂盒的在以下任意一项中的应用：

[0067] （ⅰ）分析微卫星不稳定性；

[0068] （ⅱ）制备用于分析微卫星不稳定性状态的产品；

[0069] （ⅲ）制备癌症检测产品。

[0070] 可选的实施方式中，所述癌症包括实体瘤；

[0071] 可选的实施方式中，所述癌症包括结肠直肠癌（colorectal，CRC）和子宫内膜癌（endometrial cancer，EC）。

[0072] 根据本发明的另一个方面，还提供了一种基于荧光PCR熔解曲线分析分析微卫星不稳定性状态的方法，包括PCR扩增后生成熔解曲线数据，标志物的Tm值范围内有熔解峰，判定为微卫星不稳定位点；标志物的Tm值范围内无熔解峰，判定为微卫星稳定位点；然后根据微卫星不稳定位点个数判断待测样本的微卫星不稳定性状态；扩增步骤使用前述实施方式中的引物探针组合物进行扩增。

[0073] 微卫星不稳定性状态的判断方法可根据本领域常规的对微卫星不稳定性状态的划分方式进行，例如当存在2个或以上位点为微卫星不稳定位点，则待测样本为微卫星高度不稳定（MSI‑H）；当存在1个位点为微卫星不稳定位点，则待测样本为微卫星低度不稳定（MSI‑L）；当不存在微卫星不稳定位点，则待测样本为微卫星稳定（MSS）。

[0074] 可选的实施方式中，MS1的Tm值范围为47.0℃ 50.5℃，和/或，MS2的Tm值范围为54~58℃；和/或，MS3的Tm值范围为53.0℃ 57.5℃；和/或，MS4的Tm值范围为50.0℃ 54.0℃；
~ ~ ~
和/或，MS5的Tm值范围为49.0℃ 53.5℃；和/或，MS6的Tm值范围为53.0℃ 57.0℃；和/或，~ ~
MS7的Tm值范围为55.0℃ 58.5℃；和/或，MS8的Tm值范围为52.0℃ 55.0℃。
~ ~

[0075] 可选的实施方式中，扩增的循环数为50 70个，例如可以为但不限于为50 55个、50~ ~60个、55 60个、60 65个或60 70个。
~ ~ ~ ~

[0076] 可选的实施方式中，用所述引物对进行扩增采用的酶包括Taq酶。

[0077] 可选的实施方式中。扩增步骤的反应体系中，使用的酶还包括UNG酶。

[0078] 可选的实施方式中，在PCR扩增步骤结束后进行熔解曲线分析前，包括复性的步骤，所述复性包括将反应体系降温，降温速度低于10℃/s，优选低于4℃/s。

[0079] 可选的实施方式中，基于多色探针熔解曲线分析微卫星不稳定性状态，每个反应体系中至少包括两个标志物的引物对和探针；每个反应体系中的对应于不同标志物的探针，标记不同的荧光基团。在该实施方式中，在一个反应中检测多个目标核酸序列，利用特别设计的引物通过PCR扩增多个目标核酸序列，利用与目标序列形成双链后具有不同熔解温度(Tm)的多条荧光标记探针对PCR产物进行熔解曲线分析，根据荧光标记和Tm值对结果进行判读，实现一管反应对多个目标序列的多重分析。

[0080] 可选的实施方式中，包括四个反应体系，各反应体系分别使用第一 第四引物探针~组扩增；

[0081] 第一引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1 2和19所示的用于扩增MS1~的引物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.3 4和20所示的用于扩增MS2的引物对和~
探针；

[0082] 第二引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.5 6和21所示的用于扩增MS3~的引物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.7 8和22所示的用于扩增MS4的引物对和~
探针；

[0083] 第三引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.9 10和23所示的用于扩增~MS5的引物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.11 12和24所示的用于扩增MS6的引~
物对和探针；

[0084] 第四引物探针组：包括核苷酸序列分别如SEQ ID NO.13 14和25所示的用于扩增~MS7的引物对和探针，和核苷酸序列分别如SEQ ID NO.15 16和26所示的用于扩增MS8的引~
物对和探针。

[0085] 可选的实施方式中，各反应体系中还包括用于检测内参基因的引物对和探针，内参基因的引物对优选核苷酸序列分别如SEQ ID 17 18所示，探针的核苷酸序列如SEQ ID ~NO.27所示。

[0086] 在某个具体的实施方式中，基于荧光PCR熔解曲线分析分析微卫星不稳定性状态的方法包括如下步骤：

[0087] 步骤一、不对称PCR体系设计：

[0088] 1.1.引物设计和不对称引物浓度设计：针对上述8个标志物设计上下游引物，引物扩增出目的标志物序列，且扩增子长度应适中。进行扩增时，应对上下游引物用量进行调整，以使用其中一条引物扩增出足够的单链寡核苷酸与探针进行杂交配对。其中用量较少的一条引物为“限制性引物”、用量较大的一条引物为“过量引物”，探针应与限制性引物具有相同方向。

[0089] 1.2. 探针设计：针对上述8个标志物设计检测探针，探针对同聚物重复序列或其突变形式进行设计，探针应位于上下游引物中间，且Tm值在60 75℃范围。探针为分子信标~探针。探针需使用荧光基团与淬灭基团进行修饰，荧光基于团修饰包括FAM（6‑羧基荧光素）、VIC、CY5和HEX的一种或多种；淬灭基团包括Dabcyl、MGB、BHQ1和BHQ2的一种或多种。

[0090] 步骤二、PCR扩增：

[0091] 按照设计好的PCR体系进行PCR反应配制，按本领域常规的方法进行PCR扩增。例如常规的三步法（变性‑退火‑延伸）或两步法（变性‑退火延伸）PCR扩增。

[0092] 步骤三、熔解曲线分析：

[0093] 3.1 复性：在PCR扩增步骤结束后在进行从低温到高温的熔解曲线分析前，优选地，包括一个缓慢的从高温到低温的DNA从单链形成双链的复性步骤，降温速度低于10℃/秒，优选的低于4℃/秒。

[0094] 3.2：熔解曲线分析步骤：常规的熔解曲线分析步骤，例如，将PCR条件降温到35℃左右，再升温到75 85℃，升温速率为0.02℃/s，收集荧光。~

[0095] 实施例1

[0096] 提供了一组标志物：

[0097] 根据MSI阴、阳性样本中MS标志物上串联重复序列长度的差异，对MS标志物进行分析。根据NCBI、Ensembl、UCSC等人类基因组数据库数据作为参考序列，分析NGS测序数据中MS标志物的长度变化。收集人群结直肠癌样本WGS、WES的NGS测序数据，确定各个MS标志物的检测长度，通过比较MS标志物中参考序列与检测序列的重复长度变化，确定各个标志物在结直肠癌患者中组织样本的变化。其中，MSI样本中MS标志物应发生长度变化，且长度减短或加长的突变丰度应较高；MSS样本中MS标志物应与参考序列的重复长度一致。

[0098] 使用“金标准”PCR‑毛细管电泳法检测临床样本，确定各个样本的MSI状态，作为NGS位点筛选的标准结果。对测序数据分析后选择的标志物设计oligo，对金标准确定MSI状态的临床样本分别进行建库，并进行NGS测序，经生信分析确定各个标志物中MSI及MSS样本的重复长度，根据NCBI、Ensembl、UCSC等人类基因组数据库数据作为标准参考序列，分析各个标志物在MSI样本中的检测灵敏度，分析各个标志物在MSS样本中的检出特异性。使用MSIsensor，一个C++程序，用于自动检测体细胞微卫星的变化。计算配对肿瘤和正常序列数据中每个位点微卫星的长度分布，随后使用这些数据对两个样本中观察到的分布进行统计比较。综合测试表明，MSIsensor是一种从标准肿瘤‑正常配对序列数据中获得MSI状态的有效工具。

[0099] 分析结果表明，SULF2、SEC31A、TGFBR2、EIF4E3、ACVR2A、TAOK3、DIDO1、UBAC2这8个标志物分别检测MSS及MSI样本时具有优异的区分度，可特异性区分阴阳性样本。

[0100] 具体的，本实施例提供的标志物如下：

[0101] MS1：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人基因SULF2并起始于chr20：47657577；

[0102] MS2：包含9个连续T的同聚物重复，其定位在人SEC31A基因并起始于chr4：82864412；

[0103] MS3：包含10个连续A的同聚物重复，其定位在人TGFBR2基因并起始于chr3：30650380；

[0104] MS4：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人EIF4E3基因并起始于chr3：71690181；

[0105] MS5：包含8个连续A的同聚物重复，其定位在人ACVR2A基因并起始于chr2：147926117；

[0106] MS6：包含12个连续A的同聚物重复，其定位在人TAOK3基因并起始于chr12：118238179；

[0107] MS7：包含11个连续A的同聚物重复，其定位在人DIDO1基因并起始于chr20：62905340；

[0108] MS8：包含12个连续T的同聚物重复，其定位在人UBAC2基因并起始于chr13：99238595。

[0109] 实施例2

[0110] 一种人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒：

[0111] 根据筛选出的8个标志物目标基因序列设计特异性引物、探针，引物序列在上海生工合成。具体引物、探针如下表所示：

[0112] 表3用于扩增标志物的引物探针组合物

[0113]

[0114] 人类微卫星不稳定性状态MSI检测试剂盒包含以下五组分，分别为：

[0115] PCR反应条：为8孔PCR管，每4个PCR反应孔检测1个样本。每个反应孔含有检测目的基因和内参基因的引物、探针等组分；

[0116] 表4PCR反应条的组成

[0117]

[0118] PCR 反应液：包括PCR buffer、MgCl2、dNTPs、dN(U)TP；

[0119] PCR混合酶：包括Taq酶、UNG酶；

[0120] 阴性质控品为微卫星稳定型细胞系DNA；阳性质控品为微卫星高度不稳定型细胞系DNA。

[0121] 实施例3

[0122] 人类微卫星不稳定性状态检测方法：

[0123] 采用本发明实施例2的试剂盒检测人类微卫星不稳定性状态，包括以下步骤：

[0124] （1）待测样本处理和模板提取：福尔马林固定石蜡包埋组织（FFPE）样本，其肿瘤组织样本中的肿瘤细胞含量不低于20%，保存年限不超过三年。按照提取试剂盒（康为世纪，CWY017S）说明书提取DNA。提取的模板DNA原液稀释至10ng/μl（qubit测定浓度）作为PCR扩增模板。

[0125] （2）试剂配制：在每次检测时，必须同时检测NTC（纯化水）、阳性对照、阴性对照。按每测试取59.4μl PCR反应液、2.7μl PCR混合酶于新的200μl离心管中，再分别加入9μl 待测样本、NTC、阳性对照及阴性对照，振荡混匀，快速离心5s。

[0126] （3）加样：将混合后的样本加入同一PCR反应条中的4个孔中（1# 4#孔与5# 8#孔相~ ~同），每孔加入量为20μl，小心盖紧PCR管盖，快速离心4s。上机检测，样本布局参考表5。

[0127] 表5PCR反应板布局示例

[0128]

[0129] （4）运行扩增及熔解曲线程序如下：

[0130] 表6扩增程序

[0131]

[0132] （5）结果分析：

[0133] 各反应孔FAM、CY5通道（目的基因）熔解峰Tm值范围见表7。

[0134] 表7各反应孔目的基因熔解峰Tm值范围

[0135]

[0136] 待测样本在FAM、CY5通道4个反应孔的规定Tm值范围内，存在2个或以上目的基因存在熔解峰，则样本检测结果为微卫星不稳定。判定方法见表8

[0137] 表8待测样本微卫星不稳定判断方法

[0138]

[0139] 进行检验结果的分析时，选择单一样本的单一信号进行分析。

[0140] 每次实验均需检测NTC、阴性对照及阳性对照，其检验结果如果满足以下标准时，才可进行检验结果的解释：

[0141] NTC: ①在FAM、CY5通道，规定Tm值范围内8个目的基因均无熔解峰出现；②在VIC通道，规定Tm值范围内4个反应孔应无熔解峰出现，若熔解峰偶尔出现且发生管数不多于两管则不影响检测结果判读；③当FAM、CY5及VIC通道不满足以上要求时，说明实验室存在污染或者操作有误，该结果无效。

[0142] 阴性对照：①在FAM、CY5通道，规定Tm值范围内8个目的基因均无熔解峰出现；②在VIC通道，规定Tm值范围内4个反应孔均有熔解峰出现，各反应孔内参基因熔解峰Tm值范围见

[0143] 阳性对照：①在FAM、CY5通道，规定Tm值范围内8个目的基因均有熔解峰出现；②在VIC通道，规定Tm值范围内4个反应孔均有熔解峰出现。

[0144] 待测样本检测结果的解释：

[0145] 1）应确保待测样本4个反应孔内参基因（VIC通道）在规定Tm值范围内存在熔解峰，才可进行结果的判读，若内参基因无熔解峰出现，样本质量、加样过程可能存在问题，需重新进行检测。

[0146] 2）依据4个反应孔中目的基因（FAM、CY5通道）在规定Tm值范围内的熔解峰数量，判定待测样本微卫星的状态。

[0147] 实施例4

[0148] 将8个标志物组合与金标准“PCR‑毛细管电泳法”进行一致性对比。将临床样本进行编盲处理，分别使用本发明组合与“PCR‑毛细管电泳法”试剂盒对相同临床样本分别进行检测，对检测结果进行判读时，无需算法、图形分析软件等的额外参与，可人工直接、快速完成判读。完成检测后以金标准检测方法为对比，分析两种试剂检测一致性。对本发明试剂盒及金标准检测试剂盒的检测结果进行一致性分析，统计灵敏度、特异性、阳性预测值、阴性预测值、总符合率及Kappa值，临床样本检测一致性如表9所示：

[0149] 表9金标准与本发明组合一致性对比

[0150]

[0151] 实施例2试剂盒灵敏度＝100%；实施例2试剂盒特异性＝100%；阳性预测值＝100%；阴性预测值＝100%；总符合率＝100%；Kappa＝1.0。检测结果表明，本发明的标志物组合检测特异性100％，灵敏度100％，检测性能非常优异。

[0152] 最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。