多维度评价样品与母乳相似度的方法

摘要

本发明涉及乳制品评价技术领域，公开了一种多维度评价样品与母乳相似度的方法。所述方法包括以下步骤：（1）建立本地母乳神经节苷脂数据库；（2）采集待评价样品，并进行预处理；（3）测定预处理后的待评价样品中特征神经节苷脂亚类的含量、特征神经节苷脂分子的含量并从总离子流图中提取峰面积、基峰高度和峰数量；（4）按公式计算所述待评价样品的评分G。本发明从特征神经节苷脂亚类组成、特征神经节苷脂分子组成以及整体分布情况评价三个方面入手，多维度、综合评估婴幼儿配方乳粉、原辅料和母乳替代脂与母乳神经节苷脂的相似度，可以更好地评价婴幼儿配方乳粉及其原辅料对于母乳神经节苷脂的模拟质量。

权利要求

1.一种多维度评价样品与母乳相似度的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：（1）建立本地母乳神经节苷脂数据库；

（2）采集待评价样品，并进行预处理；

（3）测定预处理后的待评价样品中特征神经节苷脂亚类的含量、特征神经节苷脂分子的含量并从待评价样品的总离子流图中提取峰面积、基峰高度和峰数量；

（4）按下述公式计算所述待评价样品的评分G：

G = Gs + Gm + Gt；

其中， ；

式中， ；Hi为母乳中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；Ai为样品中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；

；

式中， ；Ri为神经节苷脂的校正系数，即样品中所有的与母乳中共同种类的特征神经节苷脂分子含量占样品中总神经节苷脂含量的比例之和；Hn为母乳中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；An为样品中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；

Gt = (Sp + Sh + Sn)/3；

其中， ；

式中，Pn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰n的峰面积；Pi为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰i的峰面积；

；

式中，In为样品中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；Ii为母乳中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；

；

其中，Nn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰数量；Ni为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰数量。

2.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（2）中所述的预处理包括以下步骤：将内标用复溶液稀释至与母乳浓度一致后加入到待评价样品中，先加入超纯水、甲醇和二氯甲烷混合后，再加入超纯水和二氯甲烷混合，进行第一次离心，分离得到第一有机相和第一水相；向第一有机相中加入超纯水、甲醇和二氯甲烷混合，进行第二次离心，分离得到第二有机相和第二水相；将第一水相与二氯甲烷混合，进行第三次离心，分离得到第三有机相和第三水相；合并第二水相和第三水相，氮气吹干，用复溶液复溶，得到预处理后的待评价样品。

3.根据权利要求2所述的方法，其中，所述复溶液为甲醇和水的体积比为（1‑9）:1或4:1的溶液。

4.根据权利要求2所述的方法，其中，所述内标为包括C18:0  GM3‑d5和C18 Ganglioside GD3‑d3的标准品。

5.根据权利要求2所述的方法，其中，所述第一次离心的条件包括：离心时间为10‑

20min，或15min；离心速率为3000‑8000r/min，或6000r/min；

和/或，所述第二次离心的条件包括：离心时间为5‑15min，或10min；离心速率为2000‑

4000×g，或3000×g；

和/或，所述第三次离心的条件包括：离心时间为10‑20min，或15min；离心速率为3000‑

8000r/min，或6000r/min。

6.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中，使用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法测定特征神经节苷脂亚类和特征神经节苷脂分子含量。

7.根据权利要求6所述的方法，其中，所述超高效液相色谱的方法为：规格为100mm×

2.1mm，1.7μm的Waters BEH C18色谱柱，进样量10μL，流速0.3mL/min，柱温50℃；流动相A为

1mM乙酸铵的体积比为1:9的甲醇/水溶液，流动相B为1mM乙酸铵的甲醇溶液；洗脱梯度为：。

8.根据权利要求6所述的方法，其中，所述四极杆飞行时间质谱的条件为：负离子模式下检测，质谱检测参数：累积时间为0.25secs，扫描范围为100‑2000Da，洗脱时间为14min，加热气压力为40psi，辅助加热气压力为35psi，气帘气压力为15psi，离子源温度为400℃，离子源喷雾电压为‑4500V，去簇电压为‑40V，碰撞能量为‑40V。

9.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中所述特征神经节苷脂亚类包括GM3和GD3。

10.根据权利要求1所述的方法，其中，步骤（3）中所述特征神经节苷脂分子包括GM3 

40:1;2、GM3 42:1;3、GD3 42:1;2、GM3 34:1;2、GD3 40:2;3、GM3 36:1;2、GM3 38:1;2、GM3 

34:2;3、GD3 38:1;2、GM3 42:2;2、GD3 42:0;2、GD3 42:1;3、GM3 42:0;3、GD3 42:2;2、GM3 

42:1;2、GD3 42:0;3、GM3 40:0;2、GD3 40:1;2、GM3 42:2;3、GD3 36:1;2、GM3 34:1;3、GM3 

36:0;2、GM3 34:0;2、GM3 38:0;2、GM3 40:2;2、GD3 34:1;2、GD3 40:0;2、GM3 32:1;2、GM3 

38:2;2、GM3 34:0;3、GM3 40:0;3、GM3 42:0;2、GM3 36:2;2、GM3 38:0;3、GM3 36:1;3、GM3 

36:0;3、GM3 40:1;3、GM3 44:1;2、GM3 32:0;2、GM3 34:2;2、GM3 38:1;3、GM3 32:1;3和GM3 

36:2;3。

说明书

多维度评价样品与母乳相似度的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及乳制品评价技术领域，具体涉及一种多维度评价样品与母乳相似度的方法。

背景技术

[0002] 脂类是人体需要的重要营养素之一，也是母乳重要组成之一。对于婴幼儿来说，日常所需能量的45‑55%是由脂质所提供的。研究表明母乳脂质组成影响婴幼儿生长发育。因此，母乳被认为是婴幼儿配方粉开发的金标准。

[0003] 神经节苷脂是一类酸性鞘糖脂，由鞘氨醇、脂肪酸和含唾液酸的糖链这三部分组成，广泛分布于人体的组织和体液中，其中在神经系统中的分布最为丰富。母乳是神经节苷脂的主要来源，最主要的神经节苷脂种类为双唾液酸神经节苷脂GD3（Neu5Acα2‑8Neu5Acα2‑3Galβ1‑4GlcβCer）和单唾液酸神经节苷脂GM3（Neu5Acα2‑3Galβ1‑4GlcβCer）。母乳中神经节苷脂主要位于乳脂球膜的外表面，有助于乳脂肪球的形成和稳定。神经节苷脂是婴儿大脑早期生长和发育的关键营养素之一，在神经发育、记忆形成和突触信号转导中起着重要作用，还可以吸附并带走婴幼儿肠道中的病原体，发挥直接抗病原体黏附功效，并参与调节免疫系统和支持新生儿肠道成熟，同时促进婴儿肠道中的双歧杆菌增殖。母乳中神经节苷脂组成及含量受哺乳期、生活习惯和区域等影响，而婴幼儿配方奶粉中神经节苷脂组成及含量主要受原辅料和加工工艺影响。

[0004] 纵观婴幼儿配方粉脂质发展史，在模拟母乳脂质时主要围绕植物油的应用、结构脂类的模拟和功能性脂肪酸的补充，即在甘油酸的组成、含量和结构上实现更紧密的匹配。随着乳源神经节苷脂的重要功效价值得到验证，母乳神经节苷脂的模拟逐渐受到重视。然而，针对婴幼儿配方粉中神经节苷脂模拟相似度的评估方法却鲜有报道。在中国，绝大多数婴幼儿配方奶粉都是以鲜奶或乳粉为基础，而脂质部分是由乳汁或者乳粉中的脂肪、植物油和母乳替代脂结合来模拟母乳脂质。配方粉加工所用原、辅料直接决定了配方粉中神经节苷脂的组成和含量，然而针对原辅料脂质与母乳相似度评估方法未见报道。

[0005] 目前，针对婴幼儿配方粉及其原辅料脂质的评估多数采用色谱、质谱等仪器检测其数据，进行比较分析，说明婴幼儿配方粉、原辅料以及母乳替代脂与母乳脂质的差距。先前的评价技术多在脂肪酸水平或脂质亚类水平亦或某种神经节苷脂水平上进行评估比较，未考虑神经节苷脂的亚类和分子组成、含量及整体分布情况对婴幼儿配方粉的影响，且未考虑不同种类神经节苷脂权重问题。

[0006] 因鉴于此，特提出此发明。

发明内容

[0007] 本发明的目的是以母乳神经节苷脂数据库为金标准，提供一种全面细化且多维度评价婴幼儿配方粉及其原辅料、母乳替代脂与母乳神经节苷脂的相似度的方法。

[0008] 为了实现上述目的，本发明提供一种多维度评价样品与母乳相似度的方法，所述方法包括以下步骤：

[0009] （1）建立本地母乳神经节苷脂数据库；

[0010] （2）采集待评价样品，并进行预处理；

[0011] （3）测定预处理后的待评价样品中特征神经节苷脂亚类的含量、特征神经节苷脂分子的含量并从待评价样品的总离子流图中提取峰面积、基峰高度和峰数量；

[0012] （4）按下述公式计算所述待评价样品的评分G：

[0013] G = Gs + Gm + Gt；

[0014] 其中， ；

[0015] 式中， ；Hi为母乳中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；Ai为样品中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；

[0016] ；

[0017] 式中， ；Ri为神经节苷脂的校正系数，即样品中与母乳中共同种类的特征神经节苷脂分子含量占比之和；Hn为母乳中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；An为样品中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；

[0018] Gt = (Sp + Sh + Sn)/3；

[0019] 其中， ；

[0020] 式中，Pn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰n的峰面积；Pi为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰i的峰面积；

[0021] ；

[0022] 式中，In为样品中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；Ii为母乳中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；

[0023] ；

[0024] 其中，Nn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰数量；Ni为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰数量。

[0025] 通过上述技术方案，本发明所取得的有益技术效果如下：

[0026] （1）本发明建立了健康母乳神经节苷脂数据库，以健康母乳神经节苷脂为金标准，在神经节苷脂亚类和分子水平上详细地评估婴幼儿配方粉及其原辅料和母乳替代脂与母乳神经节苷脂的相似度。

[0027] （2）本发明从特征神经节苷脂亚类组成、特征神经节苷脂分子组成以及整体分布情况评价三个方面入手，多维度、综合评估婴幼儿配方乳粉、原辅料和母乳替代脂与母乳神经节苷脂的相似度；评估时同时考虑了各神经节苷脂组成、含量及权重，可以更好地评价婴幼儿配方乳粉及其原辅料对于母乳神经节苷脂的模拟质量。

[0028] （3）本发明从营养学角度，根据实际样品临床实验结果与其评分比较，对评价方法进行客观验证。

附图说明

[0029] 图1是实施例1中母乳标准品神经节苷脂总离子流图；

[0030] 图2是实施例2中添加MFGM的婴幼儿配方粉神经节苷脂总离子流图；

[0031] 图3是实施例2中普通婴幼儿配方粉神经节苷脂总离子流图；

[0032] 图4是实施例3中不同喂养方式31日龄仔猪血清免疫因子和激素水平图；

[0033] 图5是实施例3中不同喂养方式仔猪血清代谢物的层次聚类热图；

[0034] 图6是实施例3中不同喂养方式仔猪血清代谢物的SPLS‑DA图；

[0035] 图7是实施例3中不同喂养方式婴儿1月龄、4月龄、6月龄身长和体重图；

[0036] 图8是实施例3中不同喂养方式婴儿4月龄和6月龄ASQ结果图。

具体实施方式

[0037] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值，这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说，各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间，以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围，这些数值范围应被视为在本文中具体公开。

[0038] 本发明第一方面提供一种多维度评价样品与母乳相似度的方法，所述方法包括以下步骤：

[0039] （1）建立本地母乳神经节苷脂数据库；

[0040] （2）采集待评价样品，并进行预处理；

[0041] （3）测定预处理后的待评价样品中特征神经节苷脂亚类的含量、特征神经节苷脂分子的含量并从待评价样品的总离子流图中提取峰面积、基峰高度和峰数量；

[0042] （4）按下述公式计算所述待评价样品的评分G：

[0043] G = Gs + Gm + Gt；

[0044] 其中， ；

[0045] 式中， ；Hi为母乳中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；Ai为样品中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；

[0046] ；

[0047] 式中， ；Ri为神经节苷脂的校正系数，即样品中与母乳中共同种类的特征神经节苷脂分子含量占比之和；Hn为母乳中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；An为样品中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；

[0048] Gt = (Sp + Sh + Sn)/3；

[0049] 其中， ；

[0050] 式中，Pn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰n的峰面积；Pi为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰i的峰面积；

[0051] ；

[0052] 式中，In为样品中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；Ii为母乳中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；

[0053] ；

[0054] 其中，Nn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰数量；Ni为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰数量。

[0055] 在本发明中，Ri为神经节苷脂的校正系数，即样品中与母乳中共同种类的特征神经节苷脂分子含量占比之和，也即样品中（所有的）与母乳中共同种类的特征神经节苷脂分子含量占（样品中总神经节苷脂含量的）比（例）之和，无量纲。

[0056] 本发明从神经节苷脂组成、含量和总离子流图吻合度三方面入手，多维度评价婴幼儿配方乳粉、原辅料和母乳替代脂与母乳神经节苷脂相似性。首先通过神经节苷脂亚类整体评判婴幼儿配方粉和原辅料；然后以母乳神经节苷脂分子组成及含量为标准，比较婴幼儿配方粉及其原辅料与母乳神经节苷脂组成及含量相似度；最后通过对比母乳中神经节苷脂整体分布情况与婴幼儿配方粉中神经节苷脂整体分布情况，评估婴幼儿配方粉神经节苷脂整体分布情况的模拟情况。本发明能够综合评估婴幼儿配方乳粉及其原辅料神经节苷脂模拟质量。

[0057] 总离子流图是质谱检测器的总离子流强度随时间变化的曲线，纵坐标表示收集存储离子的电流总强度，横坐标表示离子的生成时间或连续扫描的扫描次数。通过对各样本的总离子流图进行比较可以看出，当各图间色谱峰的响应强度和保留时间基本重叠，则表明对应样本间的差异较小。

[0058] 由于母乳中神经节苷脂总含量较低，仅占0.005%‑0.12%，这导致定性定量结果不能完全展现母乳中神经节苷脂的整体分布，部分低含量神经节苷脂由于含量低于仪器检出限而未被检出。由于总离子流图的每一个时间点都包含着每一种离子的浓度，低于检出限的神经节苷脂信息也包含在总离子流图中，可以通过比较总离子流图的相似度来评估神经节苷脂整体组成相似度。

[0059] 本发明通过总离子流图（TIC），探究母乳脂肪球中神经节苷脂的整体组成情况，同时检测婴幼儿配方粉中神经节苷脂的整体分布情况，通过对比总离子流图评估加工工艺等对神经节苷脂整体分布情况的影响。

[0060] 根据本发明的一些实施方式，步骤（2）中所述的预处理包括以下步骤：

[0061] 将内标用复溶液稀释至与母乳浓度一致后加入到待评价样品中，先加入超纯水、甲醇和二氯甲烷混合后，再加入超纯水和二氯甲烷混合，进行第一次离心，分离得到第一有机相和第一水相；向第一有机相中加入超纯水、甲醇和二氯甲烷混合，进行第二次离心，分离得到第二有机相和第二水相；将第一水相与二氯甲烷混合，进行第三次离心，分离得到第三有机相和第三水相；合并第二水相和第三水相，氮气吹干，用复溶液复溶，得到预处理后的待评价样品。

[0062] 根据本发明的一些实施方式，所述复溶液为甲醇和水的体积比为1‑9:1或4:1的溶液。

[0063] 根据本发明的一些实施方式，所述内标为包括C18:0 GM3‑d5和C18 Ganglioside GD3‑d3的标准品。

[0064] 根据本发明的一些实施方式，所述第一次离心的条件包括：离心时间为10‑20min，或15min；离心速率为3000‑8000r/min，或6000r/min。

[0065] 根据本发明的一些实施方式，所述第二次离心的条件包括：离心时间为5‑15min，或10min；离心速率为2000‑4000×g，或3000×g。

[0066] 根据本发明的一些实施方式，所述第三次离心的条件包括：离心时间为10‑20min，或15min；离心速率为3000‑8000r/min，或6000r/min。

[0067] 根据本发明的一些实施方式，步骤（3）中，使用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱法测定特征神经节苷脂亚类和特征神经节苷脂分子含量。在本发明中，采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC‑Q‑TOF‑MS)，配备ESI电喷雾离子源和PeakView2.2和MultiQuant3.0.2数据处理系统，测定样品中神经节苷脂组成并从总离子流图中提取峰面积、基峰高度、峰数量等信息。

[0068] 根据本发明的一些实施方式，所述超高效液相色谱的方法为：规格为100mm×2.1mm，1.7μm的Waters BEH C18色谱柱，进样量10μL，流速0.3mL/min，柱温50℃；流动相A为
1mM乙酸铵的体积比为1:9的甲醇/水溶液，流动相B为1mM乙酸铵的甲醇溶液；洗脱梯度为：
。

[0069] 根据本发明的一些实施方式，所述四极杆飞行时间质谱的条件为：负离子模式下检测，质谱检测参数：累积时间为0.25secs，扫描范围为100‑2000Da，洗脱时间为14min，加热气压力为40psi，辅助加热气压力为35psi，气帘气压力为15psi，离子源温度为400℃，离子喷雾电压为‑4500V，去簇电压为‑40V，碰撞能量为‑40V。

[0070] 根据本发明的一些实施方式，步骤（3）中所述特征神经节苷脂亚类包括GM3和GD3。

[0071] 根据本发明的一些实施方式，步骤（3）中所述特征神经节苷脂分子包括GM3 40:1;2、GM3 42:1;3、GD3 42:1;2、GM3 34:1;2、GD3 40:2;3、GM3 36:1;2、GM3 38:1;2、GM3 34:2;
3、GD3 38:1;2、GM3 42:2;2、GD3 42:0;2、GD3 42:1;3、GM3 42:0;3、GD3 42:2;2、GM3 42:1;
2、GD3 42:0;3、GM3 40:0;2、GD3 40:1;2、GM3 42:2;3、GD3 36:1;2、GM3 34:1;3、GM3 36:0;
2、GM3 34:0;2、GM3 38:0;2、GM3 40:2;2、GD3 34:1;2、GD3 40:0;2、GM3 32:1;2、GM3 38:2;
2、GM3 34:0;3、GM3 40:0;3、GM3 42:0;2、GM3 36:2;2、GM3 38:0;3、GM3 36:1;3、GM3 36:0;
3、GM3 40:1;3、GM3 44:1;2、GM3 32:0;2、GM3 34:2;2、GM3 38:1;3、GM3 32:1;3和GM3 36:
2;3。

[0072] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。

[0073] 以下实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购途径获得的常规产品。实施例1

[0074] 本实施例提供了一种本地母乳数据库的建立方法。

[0075] 选取来自北京、唐山、浏阳、洛阳四个地区的61位健康产妇。所有志愿者的身体指标正常，婴儿均为足月生产。

[0076] 从上述的61位健康产妇中跟踪收集0‑6个月的母乳样品共233份，并同时记录各母乳样品对应婴儿发育状况。

[0077] 母乳采集方法：所有乳母志愿者身体指标正常，婴儿足月分娩(妊娠38‑42周)，无先天性或遗传性疾病。所有志愿者需要在早上6:00‑7:00排空一个乳房，之后于上午9:00‑11:00从一个乳房(之前已排空)收集全乳。将全乳混合后分装至1mL无菌冻存管中，贮存于‑
80℃超低温冰箱。

[0078] 样品在进入色谱和质谱前需先进行预处理，预处理的具体方法为：使用复溶液将标准品稀释至与母乳相似浓度，复溶液为含甲醇:水(4:1,v/v)溶液。将5μL 100mg/L C18:0 GM3‑d5和25μL 100mg/L C18 Ganglioside GD3‑d3标准品加入到200μL待评价样本中，先加入200μL超纯水、2mL甲醇、900μL二氯甲烷，然后加入200μL超纯水、900μL二氯甲烷，混合液在6000r/min下离心15min，分离有机相和水相。有机相中加入1mL超纯水、2.2mL甲醇和600μL二氯甲烷，混合液在3000×g下离心10min，分离有机相和水相。水相与1.8mL二氯甲烷混合，6000r/min离心15min，分离并合并水相。水相使用氮气吹干，用200 μL复溶液复溶，得到预处理后的待评价样品。

[0079] 采用超高效液相色谱串联四极杆飞行时间质谱(UPLC‑Q‑TOF‑MS)，配备ESI电喷雾离子源和PeakView2.2和MultiQuant3.0.2数据处理系统，测定样品中神经节苷脂组成并从总离子流图中提取峰面积、基峰高度、峰数量等信息。

[0080] 检测条件为：Waters BEH C18 柱(100mm×2.1 mm，1.7μm)色谱柱用于神经节苷脂分离；进样量10μL，流速0.3mL/min，柱温50℃；流动相A为1mM乙酸铵的甲醇/水(1:9，v/v)溶液，流动相B为1mM乙酸铵的甲醇溶液；洗脱梯度见下表1。

[0081] 表1神经节苷脂的梯度洗脱条件：

[0082]

[0083] 所述四极杆飞行时间质谱条件为：负离子模式下检测，质谱检测参数：累积时间(accumulation time)0.25secs，扫描范围(tof masses)100‑2000Da，洗脱时间(duration)14min，加热气压力(GS1)40psi，辅助加热气压力(GS2)35psi，气帘气压力(CUR)15psi，离子源温度(TEM)400℃，离子喷雾电压(ISVF)‑4500V，去簇电压(DP)‑40V，碰撞能量(CE)‑40V。

[0084] 以上述的233份母乳样品取等体积混合后制备的样品作为母乳标准品，采用上述的色谱和质谱方法进行分析，共测得2个神经节苷脂亚类和43种特征神经节苷脂分子，结果如表2和表3所示。

[0085] 表2实施例1母乳标准品中特征神经节苷脂亚类权重结果表：

[0086] 。

[0087] 表3实施例1母乳标准品中特征神经节苷脂分子权重结果表：

[0088] 。

[0089] 需要注意的是，表3中其他项为除上述的43种特征神经节苷脂分子外的其他神经节苷脂分子的含量总和，如GM3 30:1;2，GM3 44:2;2，GD3 32:1;2，GD3 34:0;2，GD3 34:1;3，GD3 38:0;2，GD3 38:0;3，GD3 40:0;3，GD3 40:2;2等，本实施例中不完全列出。

[0090] 后续对其他乳类样品的分析均以上述的母乳标准品的特征神经节苷脂亚类和特征神经节苷脂分子含量作为评价基准。

[0091] 但是应当注意的是，由于各地饮食习惯和生活习惯的差异，不同地域的健康产妇的母乳中的神经节苷脂成分和含量是不同的，因此，对于本领域技术人员而言，母乳样品的来源可根据实际需要进行选择，对应地，以母乳样品制备的母乳标准品的特征神经节苷脂亚类和特征神经节苷脂分子的测定结果也会随之变化。

[0092] 母乳总离子流图如图1所示。使用PeakView软件中Data and Peak Table功能，获得总离子流图的峰面积、基峰强度、峰数量等信息。实施例2

[0093] 以实施例1中所述的母乳标准品的特征神经节苷脂亚类含量、特征神经节苷脂分子含量以及总离子流图吻合度作为评价基准评价各样品的得分。

[0094] 图2示出了添加MFGM的婴幼儿配方粉神经节苷脂总离子流图。图3示出了普通婴幼儿配方粉神经节苷脂总离子流图。

[0095] 评分G按照下述的公式进行计算：

[0096] G = Gs + Gm + Gt；

[0097] 其中， ；

[0098] 式中， ；Hi为母乳中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；Ai为样品中特征神经节苷脂亚类i的含量，mg/L；

[0099] ；

[0100] 式中， ；Ri为神经节苷脂的校正系数，即样品中与母乳中共同种类的特征神经节苷脂分子含量占比之和；Hn为母乳中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；Ht为母乳中神经节苷脂总含量，mg/L；An为样品中特征神经节苷脂分子n的含量，mg/L；

[0101] Gt = (Sp + Sh + Sn)/3；

[0102] 其中， ；

[0103] 式中，Pn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰n的峰面积；Pi为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰i的峰面积；

[0104] ；

[0105] 式中，In为样品中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；Ii为母乳中神经节苷脂总离子流图的基峰高度；

[0106] ；

[0107] 其中，Nn为样品中神经节苷脂总离子流图的峰数量；Ni为母乳中神经节苷脂总离子流图的峰数量。

[0108] 其中，Ai、An、Pn、In和Nn均采用实施例1中与母乳样品相同的方法进行测定。

[0109] 根据上述方法计算作为示例的添加MFGM的婴幼儿配方粉和普通婴幼儿配方粉的评分如表4所示。

[0110] 其中，添加MFGM的婴幼儿配方粉来源于市售某品牌添加MFGM的1段奶粉，普通婴幼儿配方粉来源于市售某品牌未添加MFGM的1段奶粉。

[0111] 表4样品评价得分表：

[0112] 。

[0113] 从表4可以看出，两种配方粉的Gs得分相同，但由于Gm和Gt不同，最终得分G不同，且添加MFGM的婴幼儿配方粉得分高于普通婴幼儿配方粉。这说明了仅在神经节苷脂亚类水平上进行评估存在无法得到有效评估结果的情况，而本发明从特征神经节苷脂亚类组成、特征神经节苷脂分子组成以及整体分布情况进行多维度评价，能够在各种情况下得到有效评估结果。

[0114] 但是应当注意的是，本实施例中虽然仅以上述的两种配方粉作为示例进行了相关评价，但是本发明所述的方法不仅适用于配方粉的评价，也适用于作为原辅料的脂类原料、以及各种乳类产品及制品的评价。实施例3

[0115] 本实施例针对实际样本采用实施例2中所述的方法进行评分，并从营养学角度对评估方法结果进行客观验证。

[0116] 本实施例中探索了母乳(BF)、普通婴幼儿配方粉(FF1)和添加MFGM的婴幼儿配方粉(FF2)对婴儿发育的影响，以及三种喂养方式对31日龄仔猪免疫代谢、激素水平的影响。

[0117] （1）采用动物实验进行营养学验证。

[0118] 选用产龄相似的5头怀孕英系大白二元杂交母猪进行。顺产SPF仔猪（n=20）为SPF母猪自然分娩。选取体重、身长相似的健康仔猪，出生后3天内统一母乳喂养，让仔猪获得足够的母体免疫和营养。实验开始前3天为母乳喂养，然后正式进行喂养实验直至31天。正式实验开始后，将随机分为3组，分别为母乳组（BF组）、普通婴幼儿配方粉（FF1组）和添加MFGM的婴幼儿配方粉（FF2组）。母乳组的仔猪和母猪在同一猪舍中管理，继续进行猪母乳喂养直至21天断奶，随后继续用仔猪料进行饲喂；配方粉组饲喂由奶粉和水制成的复原乳，由奶瓶（后期用食槽）饲喂直至31天，期间仔猪同母猪隔离开，用笼具单独进行饲养管理。样本的采集时间为分娩后第31天。

[0119] 血清样本的采集：饲喂第7、14、21、31天早晨空腹采血。用不抗凝采血管进行前腔静脉采血各3mL，静置1h，经3000rpm，4℃离心20min后取上清，即为血清，‑20℃保存以备免疫和激素指标以及NMR代谢物的测定。

[0120] 免疫和激素指标的测定：使用ELISA试剂盒测定仔猪血清免疫因子和激素水平变化，主要包括5‑羟色胺（5‑HT）、多巴胺（DA）、肾上腺素（EPI）、去甲肾上腺素（NE）、甲状旁腺激素相关蛋白（PTHrP）、2,5‑羟基维生素D3（HVD3）、IgA、IgG、IgG1、早期生长应答因子1（EGR1）等。

[0121] 血清NMR代谢物的测定：样本在13,000rpm下离心2min，540μL水层被转移到2ml离心管。加入60μL DSS标准溶液（Anachro，加拿大）。然后预混并转移至5mm NMR管（Norwell，美国）。利用NMR波谱（Bruker AV III 600 mhz）收集光谱。使用Chenomx NMR Suite 8.1（Chenomx Inc.，Edmonton，加拿大）进行后续的信号处理。然后进行分段积分和基线校正。所有的光谱都以内标DSS为参考，并参考了Chenomx化合物谱库。从NMR光谱学平台上共计获得了67种代谢物。这些代谢物包括多种类型的代谢产物，包括维生素/辅因子、有机酸、氨基酸、氨基酸衍生物、酮、核酸成分、氨化合物、胺、糖、醇和酰胺。

[0122] 对不同喂养方式31日龄仔猪血清免疫因子和激素水平进行Kruskall‑Wallis差异检验并作图（图4）。可以看出，婴幼儿配方奶粉能够正常促进仔猪的生长发育，添加MFGM的婴幼儿配方粉显著增加了仔猪IgA水平和血清甜菜碱的含量。IgA、IgG、早期生长应答因子1（EGR1）在两个奶粉组显著高于母乳组，且FF2组中的IgG和IgG1均高于FF1组。

[0123] 由图5和图6可以看出，所有仔猪血清合计测到了67种代谢物，在第一周，膳食处理尚未开始前，母乳组和两个婴幼儿配方组的血清代谢物谱基本一致，21日龄仔猪血清样本和其他时间点样本显著分开。通过Kruskal‑Wallis差异检验发现，添加MFGM的婴幼儿配方粉显著增加了仔猪血清IgA水平。和母乳喂养相比，婴幼儿配方粉喂养仔猪中，抗坏血酸（维生素C）、三甲胺‑N‑氧化物（TMAO）和半乳糖的含量显著增加。其中FF2组抗坏血酸和半乳糖含量均高于FF1组。

[0124] 综上所述，经过上述的实验验证，得分较高的FF2组在喂养显著增加了仔猪IgA水平和血清甜菜碱的含量，IgG、IgG1、抗坏血酸和半乳糖含量也高于得分较低的FF1组，说明FF2组喂养的仔猪在免疫力、抗氧化性、营养代谢方面优于FF1组。

[0125] （2）采用临床实验进行营养学验证。

[0126] 依托医院招募刚出生的健康足月新生儿，其法定监护人需要仔细阅读知情同意书，并告知研究者参加研究的决定。将志愿者随机均匀分成3组，分别为母乳组（BF组）、普通配方奶粉组（FF1组）和实验配方奶粉组（FF2组）。研究期间母乳组坚持纯母乳喂养，奶粉组坚持食用给予的配方粉喂养，按照随机分组，随机分配普通配方奶粉或实验配方奶粉，研究期间不得食用其他品牌的奶粉。样本采集时间分别为1月龄、4月龄、6月龄。

[0127] 由图7可以看出，各月龄下，FF2组婴儿的身长均高于FF1组，与母乳组之间的差距逐渐减小，并在6月龄时，身长差距基本消失，且FF2组和母乳组婴儿的身长显著高于FF1组。FF2组婴儿的体重在6月龄时已经超过FF1组体重并与母乳组体重相近。由此可见，FF2组的喂养效果优于FF1组，且与母乳的喂养效果更加接近。

[0128] 采用ASQ‑3儿童神经发育评估系统评价上述三组婴儿在4月龄和6月龄时的神经心理发育情况，结果如图8所示。可以看出，FF2组婴儿在沟通、粗大动作、个人‑社交、解决问题的分数均高于FF1组，且更接近于母乳组，并与母乳组不存在显著性差异，而FF1组婴儿在4月龄时粗大动作的分数显著低于母乳组，在6月龄时的个人‑社交显著低于母乳组。上述结果说明，评分较高的FF2在促进婴儿神经发育上要明显优于评分较低的FF1，并与母乳的喂养效果更加接近。

[0129] 综上所述，经过各项实验，得分较高的FF2组在促进婴儿发育、增强婴儿抵抗力、促进婴儿神经发育上均优于得分较低的FF1组，且与母乳组更加接近。因此，本发明提供的根据神经节苷脂评价乳类产品与母乳相似度的评估方法可以在分子水平上客观地评价乳类产品或原辅料的营养水平，并对后续在分子水平上对母乳的模拟有一定的指导意义。

[0130] 以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合，这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容，均属于本发明的保护范围。