一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白及其制备方法和应用

摘要

本发明提供了一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白及其制备方法和应用，属于食品乳化剂技术领域。本发明所述的制备方法包括以下步骤：为连续相，加入表面活性剂，混合后制成乳液；(2)调节所述乳液的pH，加入酰化试剂进行酰化反应；(3)反应完成后，收集固体部分并用水冲洗，对冲洗液进行超滤，收集截留液，得到非对称酰化修饰的菜籽球蛋白。本发明制备的非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的两亲性好，三相接触角(固‑液界面经过液体内部到气‑液界面之间的夹角)可调节，乳化性能超过了食品工业中常用的乳化剂卵磷脂和代表性植物蛋白大豆蛋白，乳化性能显著提升。(1)以熔融态石蜡为分散相，以菜籽球蛋白溶液

权利要求

1.一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）以熔融态石蜡为分散相，以菜籽球蛋白溶液为连续相，加入表面活性剂，混合后制成乳液；

（2）调节所述乳液的pH，加入酰化试剂进行酰化反应；

（3）反应完成后，收集固体部分并用水冲洗，对冲洗液进行超滤，收集截留液，得到非对称酰化修饰的菜籽球蛋白。

2.如权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述菜籽球蛋白溶液是将菜籽球蛋白溶于浓度为0.8 1.2%的NaCl水溶液中得到的，所述菜籽球蛋白与NaCl水溶液的质~量体积比为0.2 0.4g：18mL。

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3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述熔融态石蜡与所述菜籽球蛋白溶液的体积比为1：9 10。

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4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述表面活性剂为吐温‑20；

所述吐温‑20与菜籽球蛋白水溶液的质量体积比为0 0.82mg：18mL。

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5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中所述混合的速率为13000~

17000rpm，时间为1 3min，温度为60 70℃。

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6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中调节所述乳液的pH前还包括将乳液冷却至23 27℃，所述pH调节为9.5 10.2。

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7.如权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述酰化试剂为丁二酸酐；所述丁二酸酐的添加量为所述菜籽球蛋白质量的0.08 0.3%。

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8.如权利要求7所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述超滤时使用的超滤膜的截留分子量为8 14kDa；所述收集截留液后冷冻干燥；所述冷冻干燥的温度为‑30 ‑50℃，时~ ~间为40 56 h。

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9.权利要求1所述方法制备得到的非对称酰化修饰的菜籽球蛋白作为乳化剂的应用。

说明书

一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及食品乳化剂技术领域，尤其涉及一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 乳化剂在食品加工过程中发挥着重要作用，如稳定乳液、改善口感等。传统的乳化剂，如卵磷脂等，虽然在食品工业中得到广泛应用，但其来源有限且成本较高。因此，开发来源广泛、成本低廉的新型植物性乳化剂具有重要意义。

[0003] 植物蛋白被认为是一种具有潜力的乳化剂。然而，植物蛋白相比于食品常用乳化剂，其乳化性能仍然较差。因此，研发一种性能优越的植物蛋白乳化剂，是本领域技术人员亟需的问题。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于提供一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白及其制备方法和应用，提高菜籽球蛋白的乳化性能。

[0005] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0006] 本发明提供了一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的制备方法，包括以下步骤：

[0007] (1)以熔融态石蜡为分散相，以菜籽球蛋白溶液为连续相，加入表面活性剂，混合后制成乳液；

[0008] (2)调节所述乳液的pH，加入酰化试剂进行酰化反应；

[0009] (3)反应完成后，收集固体部分并用水冲洗，对冲洗液进行超滤，收集截留液，得到非对称酰化修饰的菜籽球蛋白。

[0010] 优选的，步骤(1)中所述菜籽球蛋白溶液是将菜籽球蛋白溶于浓度为0.8～1.2％的NaCl水溶液中得到的，所述菜籽球蛋白与NaCl水溶液的质量体积比为0.2～0.4g：18mL。

[0011] 优选的，步骤(1)中所述熔融态石蜡与所述菜籽球蛋白溶液的体积比为1：9～10。

[0012] 优选的，步骤(1)中所述表面活性剂为吐温‑20；所述吐温‑20与菜籽球蛋白水溶液的质量体积比为0～0.82mg：18mL。

[0013] 优选的，步骤(1)中所述混合的速率为13000～17000rpm，时间为1～3min，温度为60～70℃。

[0014] 优选的，步骤(2)中调节所述乳液的pH前还包括将乳液冷却至23～27℃，所述pH调节为9.5～10.2。

[0015] 优选的，步骤(2)中所述酰化试剂为丁二酸酐；所述丁二酸酐的添加量为所述菜籽球蛋白质量的0.08～0.3％。

[0016] 优选的，步骤(3)中所述超滤时使用的超滤膜的截留分子量为8～14kDa；所述干燥为冷冻干燥；所述冷冻干燥的温度为‑30～‑50℃，时间为40～56h。

[0017] 本发明提供了由所述的制备方法得到的非对称酰化修饰的菜籽球蛋白。

[0018] 本发明还提供了所述的菜籽球蛋白作为乳化剂的应用。

[0019] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0020] 本发明制备的非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的两亲性好，三相接触角(固‑液界面经过液体内部到气‑液界面之间的夹角)可调节，乳化性能超过了食品工业中常用的乳化剂卵磷脂和代表性植物蛋白大豆蛋白，乳化性能显著提升。

附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图获得其他的附图。

[0022] 图1为实施例2中菜籽球蛋白(a)、0.2％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(b)、0.23％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(c)、0.25％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(d)、0.23％全酰化菜籽球蛋白(e)的接触角；

[0023] 图2为实施例2中菜籽球蛋白、0.2％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白、0.23％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白、0.25％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白、0.23％全酰化菜籽球蛋白的乳化性能；

[0024] 图3为实施例2中菜籽球蛋白、0.2％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白、0.23％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白、0.25％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白、0.23％全酰化菜籽球蛋白在油水界面的界面蛋白浓度；

[0025] 图4为实施例2中附有亲水性CTAB金纳米颗粒的菜籽球蛋白(a)、0.23％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(b)、0.23％全酰化菜籽球蛋白(c)的TEM图像，其中，黑色颗粒为CTAB金纳米颗粒；

[0026] 图5为实施例3中菜籽球蛋白(a)、大豆蛋白(b)、0.23％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(c)、卵磷脂(d)、0.23％全酰化菜籽球蛋白(e)作为乳化剂制备的乳液中出现油水分离的时间和正置式显微镜下的图像，其中，图中的比例尺为50μm。

具体实施方式

[0027] 本发明提供了一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的制备方法，包括以下步骤：

[0028] (1)以熔融态石蜡为分散相，以菜籽球蛋白溶液为连续相，加入表面活性剂，混合后制成乳液；

[0029] (2)调节所述乳液的pH，加入酰化试剂进行酰化反应；

[0030] (3)反应完成后，收集固体部分并用水冲洗，对冲洗液进行超滤，收集截留液，得到非对称酰化修饰的菜籽球蛋白。

[0031] 在本发明中，所述菜籽球蛋白的制备方法为：将菜籽粕充分溶解在水中，收集固体部分后加水反复震荡2～4次，得到洗脱完清蛋白的脱脂菜籽粕；将脱脂菜籽粕用NaCl水溶液溶解提取，收集上清液，透析16～32h后冻干，得到菜籽球蛋白。

[0032] 在本发明中，所述菜籽粕与水的质量体积比优选为1g：8～12mL，进一步优选为1g:10mL。所述水优选为超纯水。

[0033] 在本发明中，所述菜籽粕溶解在水中时的温度优选为23～27℃，进一步优选为25℃，溶解的时间优选为30～50min，进一步优选为40min。

[0034] 在本发明中，所述菜籽粕溶解后优选在4000～6000rpm下离心8～12分钟，进一步优选在5000rpm下离心10分钟，收集固体部分，共重复2～4次，得到洗脱完清蛋白的脱脂菜籽粕。

[0035] 在本发明中，所述NaCl水溶液的浓度为4～6％，优选为5％。所述脱脂菜籽粕与NaCl溶液的质量体积比1g：13～17mL，优选为1g：15mL。

[0036] 在本发明中，所述溶解提取的温度为23～27℃，优选为25℃，时间为30～50min，优选为40min。

[0037] 在本发明中，优选采用离心的方式收集上清液。

[0038] 在本发明中，所述离心的转速优选为4000～6000rpm，进一步优选为5000rpm；离心的时间优选为8～12分钟，进一步优选为10分钟。

[0039] 在本发明中，所述透析的时间优选为20～28h，进一步优选为24h，所述透析用透析袋的截留分子量优选为8～14kDa，进一步优选为10kDa。

[0040] 在本发明中，所述冻干的温度优选为‑30～‑50℃，进一步优选为‑40℃，所述冻干的时间优选为40～56h，进一步优选为48h。

[0041] 在本发明中，步骤(1)中所述菜籽球蛋白溶液是将菜籽球蛋白溶于浓度为0.8～1.2％的NaCl水溶液中得到的，优选为将菜籽球蛋白溶于浓度为0.9～1.1％的NaCl水溶液中得到的，进一步优选为将菜籽球蛋白溶于浓度为1％的NaCl水溶液中得到的；所述菜籽球蛋白与NaCl水溶液的质量体积比为0.2～0.4g：18mL，优选为0.3g：18mL。

[0042] 在本发明中，步骤(1)中所述熔融态石蜡与所述菜籽球蛋白溶液的体积比为1：9～10，优选为1:9。

[0043] 在本发明中，步骤(1)中所述表面活性剂为吐温‑20；

[0044] 所述吐温‑20与菜籽球蛋白水溶液的质量体积比为0～0.82mg：18mL，优选为0.1～0.5mg：18mL，更优选为0.25mg：18mL。

[0045] 在本发明中，步骤(1)中所述混合的速率为13000～17000rpm，优选为14000～16000rpm，进一步优选为15000rpm；时间为1～3min，优选为2min，温度为60～70℃，优选为
62～68℃，进一步优选为64～66℃，更优选为65℃。

[0046] 在本发明中，步骤(2)中调节所述乳液的pH前还包括将乳液冷却至23～27℃，优选为冷却至25℃，所述pH调节为9.5～10.2，优选为10；pH调节时使用的溶液为NaOH溶液，优选为1mol/L的NaOH溶液。

[0047] 在本发明中，步骤(2)中所述酰化试剂为丁二酸酐；所述丁二酸酐的添加量为所述菜籽球蛋白质量的0.08～0.3％，优选为0.2～0.25％，更优选为0.23％；

[0048] 酰化过程中还使用NaOH溶液将酰化反应液的pH稳定在9.5～10.2，优选为使用1mol/L的NaOH溶液将酰化反应液的pH稳定在10；酰化过程中边搅拌边加入酰化试剂。

[0049] 在本发明中，步骤(3)中所述用水冲洗优选为用去离子水冲洗，冲洗的次数优选为4～5次。

[0050] 本发明还在步骤(3)进行超滤前使用真空泵0.8μm的水系膜对冲洗液进行抽滤，不再有液滴滴落时结束抽滤。

[0051] 在本发明中，步骤(3)中所述超滤时使用的超滤膜的截留分子量为8～14kDa，优选为10kDa；所述干燥为冷冻干燥；所述冷冻干燥的温度为‑30～‑50℃，优选为‑35～‑45℃，进一步优选为‑40℃，时间为40～56h，优选为44～52h，进一步优选为46～50h，更优选为48h。

[0052] 本发明提供了由所述的制备方法得到的非对称酰化修饰的菜籽球蛋白。

[0053] 本发明还提供了所述的菜籽球蛋白作为乳化剂的应用。

[0054] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

[0055] 实施例1

[0056] 1)菜籽球蛋白的制备

[0057] 将菜籽粕(购自江苏南京农贸市场)与超纯水按照1g:10mL混合，在25℃温度下搅拌振荡40min，5000rpm离心10min，收集沉淀，将收集的沉淀按照上述方法重复振荡和离心，共重复3次，得到洗脱完清蛋白的脱脂菜籽粕。将脱脂菜籽粕与5％的NaCl溶液按照1g:15mL混合后，在25℃温度下震荡40min，5000rpm离心10min，收集上清液，用截留分子量为10kDa的透析袋透析24h后，收取截留液，在‑40℃温度下冻干48h，得到菜籽球蛋白(RC)。

[0058] 2)非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的制备

[0059] 称取0.3g RC并将其充分分散于18mL的NaCl溶液(1％w/v)中，水浴加热形成65℃的蛋白溶液。在65℃条件下，将2mL熔融态的石蜡(购自国药集团化学试剂有限公司)和0.25mg的Tween‑20(调节油水界面张力)添加到蛋白溶液中，使用高速分散器在15000rpm对蛋白溶液均质2min后，将均质后的蛋白溶液快速冷却至25℃，用1mol/L的NaOH溶液将冷却后的蛋白溶液的pH调至10。共设置3个重复。

[0060] 分别向蛋白溶液中缓慢加入菜籽球蛋白质量的0.2％、0.23％、0.25％(即0.6、0.69、0.75mg)的丁二酸酐进行酰化反应。酰化反应在室温下进行，边搅拌边加入丁二酸酐，酰化过程中，用1mol/L的NaOH溶液将反应液的pH稳定在10。反应结束后，4000r/min离心
10min，取出固体部分，用20mL去离子水反复冲洗固体部分表面，冲洗4次，使用真空泵和0.8μm的水系膜抽滤，不再有液滴滴落时结束抽滤，最后利用分子量截止为10kDa的超滤膜在
0.1MPa压力条件下对滤液进行超滤，收集截留液，在‑40℃下冷冻干燥48h，得到0.2％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(0.2％AARC)、0.23％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(0.23％AARC)和0.25％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(0.25％AARC)。

[0061] 同时制备全酰化菜籽球蛋白作为对照

[0062] 称取0.3g RC并将其充分分散于18mL的NaCl溶液(1％w/v)中，得到蛋白溶液，用1mol/L的NaOH溶液将蛋白溶液的pH调至10后，缓慢加入菜籽球蛋白质量的0.23％(即
0.69mg)的丁二酸酐进行酰化反应。酰化反应在室温下进行，边搅拌边加入丁二酸酐，酰化过程中，用1mol/L的NaOH溶液将反应液的pH稳定在10。反应结束后，4000r/min离心10min，取出固体部分，用20mL去离子水反复冲洗固体部分表面，冲洗4次，使用真空泵和0.8μm的水系膜抽滤，不再有液滴滴落时结束抽滤，最后利用分子量截止为10kDa的超滤膜在0.1MPa压力条件下对滤液进行超滤，在‑40℃下冷冻干燥48h，得到0.23％全酰化菜籽球蛋白(0.23％TARC)。

[0063] 实施例2

[0064] 检测实施例1获得的菜籽球蛋白、非对称酰化修饰的菜籽球蛋白和全酰化菜籽球蛋白的三相接触角(固‑液界面经过液体内部到气‑液界面之间的夹角)、乳化活性(EAI)、界面蛋白浓度和表观形貌。

[0065] 1)接触角

[0066] 利用粉末压片机(购自天津市科器高新技术公司，型号：769YP‑15A)将上述菜籽球蛋白分别压缩成厚度约1mm、直径约15mm的薄片后，利用光学界面分析仪(购自宁波新边界仪器公司，型号：OSA60)测定其接触角大小。结果如图1所示。

[0067] 从图1可以看出：0.23％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(0.23％AARC；图1c)的接触角为89.4°‑90.5°，相比于未酰化修饰的RC(图1a)、0.2％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(0.2％AARC；图1b)、0.25％非对称酰化修饰的菜籽球蛋白(0.25％AARC；图1d)和0.23％全酰化菜籽球蛋白(0.23％TARC；图1e)，其接触角最接近90°，表明0.23％AARC的两亲性最好。

[0068] 2)乳化活性

[0069] 以大豆油为油相，以大豆蛋白(SPI，市售)以及上述菜籽球蛋白作为乳化剂，制备乳液。利用分光光度计测定其在500nm处的吸光值A0，并计算各类蛋白乳化剂的乳化活性。乳化活性的计算公式为：

[0070]

[0071] 其中，T—2.303；A0—初始吸光值；D—稀释倍数，101；C—样品浓度(g/mL)；φ—乳化液中油相的比例，0.2；L—比色皿宽度，1cm。

[0072] 采用SPSS 22.0统计软件进行差异显著性分析(Duncantest)，结果以平均值+标准差(SD)来表示。不同字母代表组间具有显著性差异(P＜0.05)。乳化活性结果如图2所示。由图2可知，非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的乳化活性均显著高于SPI、RC以及0.23％TARC，且0.23％AARC乳化活性最高。

[0073] 3)界面蛋白浓度

[0074] 利用超滤离心管(分子量截止：30kDa)对制备的蛋白乳液(1mL)进行离心(5000r/min，5min)，计算各蛋白在油水界面的界面蛋白浓度(Γ)。界面蛋白浓度(Γ)的计算公式为：

[0075] Γ(mg/m2)＝(Ct‑Cs)/(6φ×d(3,2))

[0076] 其中，Ct和Cs分别为总蛋白浓度和下清液蛋白浓度(蛋白试剂盒测试)；φ是油相体积分数，(0.1)；d(3,2)是水作为分散溶剂由粒度分布仪NanoZS90测得乳液面积加权平均直径。

[0077] 采用SPSS 22.0统计软件进行差异显著性分析(Duncantest)，结果以平均值+标准差(SD)来表示。不同字母代表组间具有显著性差异(P＜0.05)。界面蛋白浓度如图3所示。Γ值越高，乳化效率越高，乳液抗凝结的稳定性越强。从图3可以看出，非对称酰化修饰的菜籽球蛋白的Γ值显著高于SPI、RC以及0.23％TARC，且随着酰化度的增加，乳液的Γ值呈现出先升高后下降的趋势，0.23％AARC的Γ值最高。表明0.23％AARC的乳化效率最高，乳液抗凝结的稳定性最强。

[0078] 4)表观形貌

[0079] 0.23％AARC的乳化活性和乳化效率都最高，故选取0.23％AARC并对其表观形貌进行拍摄。

[0080] 在40℃条件下，将5mL浓度为0.05mg/mL的CTAB金纳米颗粒滴加在15mL 1％(w/v)的蛋白样品中充分震荡搅拌30min，后冻干得到附有CTAB金纳米颗粒的蛋白粉末。利用透射电子显微镜对表面附有CTAB金纳米颗粒(5nm)的RC、0.23％AARC和0.23％TARC形貌进行观察。

[0081] 结果如图4所示，可以看出，相比RC(图4a)和0.23％TARC(图4c)，0.23％AARC(图4b)仅有一半被亲水性CTAB金纳米颗粒附着(黑色颗粒为金纳米颗粒)，表明0.23％AARC一半亲水一半疏水，说明0.23％AARC具备极佳的两亲性能。

[0082] 实施例3

[0083] 在5个透明玻璃瓶中分别装入18mL超纯水，然后将0.036g实施例1中制备的RC、0.23％AARC、0.23％TARC和市售的SPI、卵磷脂添加到不同的玻璃瓶中，再在各瓶中各2mL加入的大豆油。利用高速分散器(15000rpm，2min)将各玻璃瓶中的原料分散制成均匀的乳液(pH7.2‑7.4)。计时确定各乳液分层的时间。

[0084] 同时按十倍稀释条件，取1mL分散均匀的乳液加入9mLPBS缓冲溶液(购自Solarbio，工作浓度0.01mol/L，pH7.2‑7.4)进行稀释后，置于载玻片上，在正置式显微镜下观察不同乳化剂稳定乳液的形貌特征。

[0085] 通过乳液分层时间和乳液粒径大小评价各组的乳化效率，分析乳化剂对乳液的稳定性能。乳液粒径越小表明乳化剂乳化效率越高。结果如图5所示。

[0086] 从图5可知，非对称酰化修饰的菜籽球蛋白作为乳化剂时，乳液出现油水分层所需的时间为8分08秒，这一性能是SPI的3.75倍，卵磷脂的1.51倍。即0.23％AARC对乳液稳定时间最长，其具有最好的乳化稳定性。同时，与RC(图5a)和0.23％TARC(图5e)相比，0.23％AARC(图5c)作为乳化剂制备的乳液粒径最小，分散最均匀，说明其乳化效率最好，甚至高于SPI(图5b)和卵磷脂(图5d)。可见，非对称酰化修饰的菜籽球蛋白显著提高了乳液的稳定性和分散效果，具有很好的乳化效果。

[0087] 由以上实施例可知，本发明提供了一种非对称酰化修饰的菜籽球蛋白及其制备方法和应用。本发明制备得到的非对称酰化修饰的菜籽球蛋白两亲性好，三相接触角(固‑液界面经过液体内部到气‑液界面之间的夹角)可调节，乳化性能超过了食品工业中常用的乳化剂卵磷脂和代表性植物蛋白大豆蛋白，乳化性能显著提升。

[0088] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。