一种治疗HER2高表达肿瘤的药物

摘要

本发明公开了一种高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物，属于医用配制品技术领域。本发明为HER2阳性的肿瘤患者提供一种新的治疗药物，将设计针对HER2基因的脱氧核糖核酸特异性序列，包裹于脂质体纳米颗粒中注射至体内，导致TFO结构的形成，进而诱导HER2的肿瘤细胞DNA损伤，破坏HER2信号传导，进而导致细胞周期停滞和抑制细胞的生长和增殖，达到治疗肿瘤的效果。本发明采用的脂质体纳米颗粒，可以优化有效载荷包封和核酸的细胞内传递，只需小剂量就能产生良好的免疫刺激效果。以上脂质体纳米颗粒载体包裹的特异性核酸所形成的纳米颗粒，本发明定义为“HER2‑TFO核酸纳米药物”。

权利要求

1.一种治疗HER2高表达肿瘤的药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：S1、称取胆甾烯基甲酸酯25～85mg加入到5～15mL二氯甲烷中，再加入3‑咪唑基‑1‑基正丁胺10～25mg、4‑二甲氨基吡啶14～24mg、二环己基碳二亚胺15～35mg，在0～5℃下搅拌

8～16h，反应结束后过滤，滤液减压浓缩至干后加水洗涤，再加入二氯甲烷萃取，分液，有机相干燥后浓缩得到甲基咪唑‑胆甾醇；

S2、称取步骤S1中的甲基咪唑‑胆甾醇5～20mg、胆固醇20～35mg加入到圆底烧瓶中，随后取200～350μL的二油酰磷脂酰胆碱溶于10～15mL氯仿中，溶解后经减压浓缩除去溶剂，将残余物干燥至恒重后加入pH＝6.5的PBS缓冲液25～45mL，在25～45℃下振荡水化，超声处理15～25min，经0.45μm微孔滤膜过滤后旋转蒸发处理20～40min即得脂质体纳米颗粒；

S3、向所述脂质体纳米颗粒中加入靶向HER2的TFO片段并作用2～4min；

S4、将负载TFO片段的脂质体纳米颗粒称重，冷藏保存，得到所述治疗HER2高表达肿瘤的药物；

步骤S3中所述靶向HER2的TFO片段采用如下方法设计得到：M1、设计TFO片段，一方面选择在基因的启动子部位，一方面选择在基因内部，包括外显子和内含子；

M2、确定target区域，设计平行或反平行片段；

M3、根据具体序列设计得到靶向HER2的TFO片段；

步骤S3中所述TFO片段为16～35碱基；

步骤S3中TFO片段与脂质体纳米颗粒的质量比为0.01～5:1～5。

2.根据权利要求1所述的一种治疗HER2高表达肿瘤的药物的制备方法，其特征在于：步骤S4中所述冷藏保存的温度为2～8℃。

3.一种治疗HER2高表达肿瘤的药物，其特征在于：由权利要求1～2任一项所述的方法制备而成。

说明书

一种治疗HER2高表达肿瘤的药物

技术领域

[0001] 本发明涉及医用配制品技术领域，尤其涉及一种高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物。

背景技术

[0002] 酪氨酸激酶受体erb‑2是由原癌基因ERBB2基因编码的一种蛋白，常被称为人表皮生长因子2，简称HER2(Human epidermal growth factor receptor 2)。HER2扩增或过表达与肿瘤高侵袭性、易复发、死亡率增加密切相关。研究显示，在乳腺癌、胃癌、卵巢癌、肺癌和前列腺癌中均存在不同程度的HER2过表达，HER2过表达往往预示患者预后差。HER2的表达水平对肿瘤靶向治疗具有指导作用，HER2过表达的患者能够从HER2靶向治疗中获益。

[0003] 中国专利CN1908015A提供了一种能抑制HER2高表达肿瘤细胞增殖的稳定的小分子多肽，该发明的小分子多肽PL45为自行设计的靶向HER2S1‑L2功能域的拮抗分子，由全合成的基因编码，克隆入表达质粒pET‑22b；同时将TrxA插入pET‑22b，以辅助PL45折叠，实现可溶性共表达。现阶段已经有多种抗HER2靶向治疗药物获美国食品药品监督管理局批准用于HER2阳性肿瘤治疗。尽管靶向扩增致癌基因的蛋白质产物的药物已被证明是有效的抗癌疗法，但耐药性限制了它们的整体成功。随着该类型药物的临床应用，当出现抗HER2治疗耐药时，如何阻止或逆转耐药性的发展成为临床关注的重点。根据目前所研究的抗HER2治疗的耐药机制，可通过更换新的药物，如新型ADC、单抗、TKI，来替代当前的抗HER2疗法；或抗HER2治疗联合其他治疗方式，如免疫疗法、CDK4/6抑制剂、PI3K/AKT/mTOR抑制剂，来改善抗HER2治疗的耐药情况。

[0004] Tiwari及其同事开发了一种替代策略，通过使用三链体形成寡核苷酸(Triplex‑forming oligonucleotide，TFO)来靶向扩增的癌基因，TFO识别扩增染色体区域内的多聚嘌呤位点并导致双链断裂(Double‑strand break，DSB)形成和细胞凋亡，进而驱动肿瘤的凋亡。没有扩增特征的细胞则处于较低的DNA损伤水平。TFO在双螺旋结构内的结合会导致DNA损伤，从而阻碍复制叉进展，导致叉折叠和DNA双链断裂。因此，TFO结构的形成可以诱导足够的DNA损伤，从而激活细胞的凋亡。而核苷酸切除修复则可解决低水平的TFO诱导的DNA损伤，因此，正常细胞可以耐受TFO处理。当靶向HER2(乳腺肿瘤中高度过表达的基因)的TFO引入HER2阳性的乳腺癌细胞时，它们会特异性结合HER2染色体区域并增加DNA损伤和细胞凋亡的水平。此外，将TFO腹膜内给予免疫抑制小鼠的HER2扩增异种移植物可将肿瘤生长限制在与目前治疗HER2阳性乳腺癌的曲妥珠单抗相当的水平。TFO的功效不受多聚嘌呤靶位点基因组位置的限制，与HER2的内含子区域的结合也会诱导DNA损伤和细胞凋亡。为了增强药物递送，聚合的、可生物降解的纳米颗粒(Nanoparticle,NP)被用于递送靶向HER2的TFO。NPs递送的TFO在给药后12小时在癌细胞内显着积累，在24小时略有减少。此外，与对照组相比，具有HER2阳性的乳腺癌异种移植物的小鼠肿瘤体积显着减少。这项工作描述了一种靶向肿瘤中扩增的致癌基因的新方法以及有效的药物递送，并为靶向治疗提供了另一种设计。

[0005] 2021年耶鲁大学医学院的研究团队在《自然生物技术》杂志也发表了一种靶向癌症相关基因扩增的治疗策略，即通过激活三链形成寡核苷酸(Ttriplex‑forming oligonucleotides，TFOs)的DNA损伤反应，进而驱动肿瘤的凋亡。TFO在双螺旋结构内的结合会导致DNA损伤，从而阻碍复制叉进展，导致叉折叠和DNA双链断裂。因此，TFO结构的形成可以诱导足够的DNA损伤，从而激活细胞的凋亡。以HER2为靶点，通过破坏HER2信号传导，进而导致细胞周期停滞和抑制细胞的生长和增殖，为TFO诱导的细胞凋亡为开发特异性靶向基因扩增产生的癌症的治疗方法提供了理论基础。

[0006] 在实际应用中，形成三螺旋DNA的第三条链的抗酶活性、水溶性、脂溶性和毒副作用等因素直接影响其作为治疗药物的可能性，因而合成能抗核酸酶能力强、水溶性和脂溶性适当、毒副作用小的寡聚核苷酸片段和提高三螺旋DNA稳定性的主链修饰方法仍是目前的研究热点。纳米医学具有提高药物功效、降低毒性、优化药物特性、递送生物大分子药物和克服肿瘤驱动的免疫抑制信号等独特特征，在解决诸如单克隆抗体等生物制剂的缺点方面具有巨大潜力。

[0007] 中国专利CN104535772A公开了一种HER2高表达的循环肿瘤细胞的多肽‑磁性纳米颗粒及其制备方法和应用，该发明设计了一系列多肽片段，通过筛选得到了具有特异性识别HER2特异性的多肽片段；随后利用生物素‑链亲和素的强相互作用，将生物素修饰的特异性识别多肽与链亲和素修饰的磁性纳米颗粒偶联，制备了一种多肽‑磁性纳米颗粒。

[0008] 广州中山大学第三附属医院的团队提出制备A10适配体修饰的PLGA(D，L‑lactic‑co‑glycolic acid，PLGA)纳米粒子负载靶向雄激素受体(androgen receptors，AR)的TFO用于靶向前列腺癌治疗。他们合成了PLGA‑PEG‑Apt共聚物，并采用双乳液溶剂蒸发法合成了负载TFO的PLGA‑PEG‑Apt纳米颗粒(PLGA‑PEG‑Apt nanoparticles，NP‑Apt)，制备了羧基荧光素标记的TFO‑NP‑Apt、TFO‑NP和TFO细胞摄取实验；细胞计数试剂盒8(CCK‑8)试验用于测定TFO‑NP‑Apt抑制前列腺癌细胞增殖的能力。通过RT‑PCR和Western blot分析AR基因表达，然后，使用前列腺癌小鼠模型来评估TFO‑NP‑Apt在体内的抗癌作用，确认了PLGAPEG‑Apt共轭是成功的。TFO包封率和载药率分别为46.1±3.6％和40.8±5.3％。TFO‑NP‑Apt在前列腺癌细胞中显示出比TFO‑NP或TFO更有效的细胞摄取。在CCK‑8测试中，TFO‑NP‑Apt的细胞毒性明显高于TFO‑NP和TFO。TFO‑NP‑Apt比未结合的Apt、裸TFO、NP或盐水更好地沉默AR基因。TFO‑NP‑Apt在抑制体内前列腺癌生长方面比TFO‑NP、裸TFO、NP和生理盐水更有效。适配体修饰的TFO负载PLGA纳米颗粒被证明可用于晚期前列腺癌的靶向治疗。

[0009] 现阶段纳米颗粒负载TFO的应用中，依旧存在针对HER2设计的TFO片段有限的技术问题；同时，纳米颗粒包裹的TFO稳定性差、包封率、载药率低，如前文所述，负载TFO的PLGA‑PEG‑Apt纳米颗粒的包封率和载药率均未超过50％；TFO‑NP‑Apt的细胞毒性大，对正常细胞造成损害也限制了其应用范围，而现有技术均尚未在人源动物模型及临床患者中进行验证有效。

发明内容

[0010] 有鉴于现有技术的上述缺陷，本发明所要解决的问题是提供一种高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物。

[0011] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：

[0012] 一种高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物，将与HER2相结合的TFO包裹在脂质体纳米颗粒中，得到所述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物。

[0013] 具体的，靶向HER2的TFO的设计如下：

[0014] Her‑2基因位于人17号染色体，位置在39668094‑39728660，长度为40566bp，2733F，2733R：25nt，在17号染色体的Her‑2基因第6个外显子区域，位置39710099‑39710123处，基本上按照Watson‑Crick配对原则，中间部分碱基按照Hoogsteen配对原则调整，用snapgene，dnaman，NovoPro比较计算配对自由能大小；用Primer Premier 5去除发夹和其它二级结构以防误沾。

[0015] 4428F，4428R：27nt，在17号染色体的Her‑2基因第9个外显子和第10个外显子之间区域，位置39712572‑39712598处，基本上按照Watson‑Crick配对原则，中间部分碱基按照Hoogsteen配对原则调整，用snapgene，dnaman，NovoPro比较计算配对自由能大小；用Primer Premier 5去除发夹和其它二级结构以防误沾。

[0016] 11074F，11074R：26nt，在17号染色体的Her‑2基因第23外显子和第24个外显子之间区域，位置39725858‑39725883处，基本上按照Watson‑Crick配对原则，中间部分碱基按照Hoogsteen配对原则调整，用snapgene，dnaman，NovoPro比较计算配对自由能大小。

[0017] 所述脂质体纳米颗粒为商用制品Thermo Scientific DharmaconFECT；优选的，所述脂质体纳米颗粒的制备方法为：通风条件下，称取5.0～15.0mg二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、5.0～15.0mg胆固醇加入至容器中，随后取200～300μL的二油酰磷脂酰胆碱溶液，50～150μL的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液至该容器中，将各组分混合均匀，得到混合液；对所述混合液进行超声处理15～45s，随后取4～8mL超纯水至该容器中，继续进行超声处理至总时间为4～8min；最后经真空旋转蒸发处理20～40min，得到脂质体纳米颗粒。

[0018] 优选的，所述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物，采用如下方法制备而成：

[0019] S1、称取胆甾烯基甲酸酯25～85mg加入到5～15mL二氯甲烷中，再加入3‑咪唑基‑1‑基正丁胺10～25mg、4‑二甲氨基吡啶14～24mg、二环己基碳二亚胺15～35mg，在0～5℃下搅拌8～16h，反应结束后过滤，滤液减压浓缩至干后加水洗涤，再加入二氯甲烷萃取，分液，有机相干燥后浓缩得到甲基咪唑‑胆甾醇；

[0020] S2、称取步骤S1中的甲基咪唑‑胆甾醇5～20mg、胆固醇20～35mg加入到圆底烧瓶中，随后取200～350μL的二油酰磷脂酰胆碱溶液溶于10～15mL氯仿中，溶解后经减压浓缩除去溶剂，将残余物干燥至恒重后加入pH＝6.5的PBS缓冲液25～45mL，在25～45℃下振荡水化，超声处理15～25min，经0.45μm微孔滤膜过滤后旋转蒸发处理20～40min即得脂质体纳米颗粒；

[0021] S3、向所述脂质体纳米颗粒中加入靶向HER2的TFO片段并作用2～4min；

[0022] S4、将负载TFO片段的脂质体纳米颗粒称重，冷藏保存，得到所述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物。

[0023] 优选的，上述方法中所述脂质体纳米颗粒还可以采用商用制品Thermo Scientific DharmaconFECT。

[0024] 优选的，步骤S3中所述靶向HER2的TFO片段采用如下方法设计得到：

[0025] M1、设计TFO片段，一方面选择在基因的启动子部位，一方面选择在基因内部，包括外显子和内含子；

[0026] M2、确定target区域，设计平行或反平行片段；

[0027] M3、根据具体序列设计得到靶向HER2的TFO片段。

[0028] 优选的，步骤S3中所述TFO片段为16～35碱基。

[0029] 优选的，步骤S3中TFO片段与脂质体纳米颗粒的质量比为0.01～5:1～5。

[0030] 优选的，步骤S4中所述冷藏保存的温度为2～8℃。

[0031] 脂质体是能使多种药物有效传递到靶细胞的载体，药物与脂质体结合可以显著改善药物的药代动力学，使药物毒性降低和治疗效果提高，因此脂质体制剂在抗肿瘤药物传递方面具有广阔的发展前景。在纳米医学领域，主动靶向是克服低选择性和全身毒性、提高治疗效果的重要策略。具有可控和靶向功能的药物传递装置可以理想地将高剂量的治疗剂特异性地传递给病变细胞，减少对健康细胞的干扰，从而产生预期的药代动力学和生物分布，达到更高的治疗效果和更少的副作用。

[0032] 本发明中，靶向HER2的TFO免疫脂质体是一种靶向给药治疗HER2过度表达癌症很有前途的策略。本发明制备的一种脂质体纳米颗粒，可以优化有效载荷包封和核酸的细胞内传递，它们只需小剂量和很少的注射，就能产生良好的免疫刺激效果。发明人所制备的甲基咪唑‑胆甾醇是在4‑二甲氨基吡啶的催化作用下，3‑咪唑基‑1‑基正丁胺与胆甾烯基甲酸酯反应得到的，所得到的甲基咪唑‑胆甾醇由于具有咪唑基其在低pH条件下发生质子化的改变，因此脂质体膜和核内体膜融合，导致膜内包合内容物的快速释放，因此其在低pH条件下的释放更快，能够更快速地作用于肿瘤部位从而更快起到治疗效果。

[0033] 在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可以任意组合，即得本发明各较佳实施例。

[0034] 本发明的有益效果：

[0035] 本发明为HER2阳性的肿瘤患者提供一种新的治疗药物，将设计针对HER2基因的TFO包裹于脂质体纳米颗粒中注射至体内，TFO结构的形成可以诱导HER2的DNA损伤，破坏HER2信号传导，进而导致细胞周期停滞和抑制细胞的生长和增殖，达到治疗肿瘤的效果。

附图说明

[0036] 图1是片段2733F在表达不同HER2水平的乳腺癌细胞株MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474中在24h、48h、72h时对细胞的抑制作用图；

[0037] 图2是片段2733R在表达不同HER2水平的乳腺癌细胞株MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474中在24h、48h、72h时对细胞的抑制作用图；

[0038] 图3是片段4428F在表达不同HER2水平的乳腺癌细胞株MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474中在24h、48h、72h时对细胞的抑制作用图；

[0039] 图4是片段4428R在表达不同HER2水平的乳腺癌细胞株MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474中在24h、48h、72h时对细胞的抑制作用图；

[0040] 图5是片段11074F在表达不同HER2水平的乳腺癌细胞株MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474中在24h、48h、72h时对细胞的抑制作用图；

[0041] 图6是片段11074R在表达不同HER2水平的乳腺癌细胞株MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474中在24h、48h、72h时对细胞的抑制作用图；

[0042] 图7是阳离子脂质体纳米颗粒的电镜图；

[0043] 图8是阳离子脂质体纳米颗粒的直径大小分布图；

[0044] 图9是测试例1对小鼠建立肿瘤模型的实验图，包括：A.建立BT474荷瘤小鼠抗肿瘤作用模型的示意图；B.肿瘤的照片；C.肿瘤体积生长曲线；D.肿瘤的重量；E.不同组别的体重变化曲线。

[0045] 图10是测试例1中对不同治疗组荷瘤小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行不同治疗后的H&E染色图片。

具体实施方式

[0046] 下面通过实施例的方式进一步说明本发明，但并不因此将本发明限制在所述的实施例范围之中。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，按常规方法和条件，或按照商品说明书选择。

[0047] 实施例1

[0048] 将设计的靶向HER2的TFO片段2mg包裹于5mg脂质体纳米颗粒中：

[0049] 开启通风橱，将称量好的10.0mg二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、10.0mg胆固醇加入到梨形瓶中，用移液管取250μL的二油酰磷脂酰胆碱溶液，100μL的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液至梨形瓶中，混匀；将梨形瓶快速移到超声波细胞粉碎仪中，超声功率为27％，超声2s，间隔1s，温度25℃，超声处理30s，用定量移液器取6mL超纯水至梨形瓶中，继续超声至总时间6min。取出梨形瓶至真空旋转蒸发仪上进行真空旋转蒸发30min；加入靶向HER2的TFO片段作用3min，取一个1.5mL的离心管称重，2～8℃保存，得到高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物。所得阳离子脂质体纳米颗粒的电镜图片见图7，粒径、电位数据见图8。

[0050] 将上述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物分别在表达不同HER2水平的肿瘤细胞中验证抗肿瘤作用，并与未包裹的裸TFO对比使用剂量及效果：

[0051] 将上述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物分别按不同浓度(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)转染至表达不同HER2水平的肿瘤细胞(BT20、MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474)，分别在0h、24h、48h、72h进行CCK8分析实验，检测吸光度值，统计评价细胞增殖活力；按将上述转染方法转染后收集细胞，通过Western blot检测cleaved‑caspase3、cleaved‑PARP的表达水平评估细胞的早期凋亡情况；将实施例3和本实施例中达到相同抗肿瘤作用所用裸TFO片段或高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物剂量进行对比。

[0052] 实施例2

[0053] 将设计的靶向HER2的TFO片段2mg包裹于5mg脂质体纳米颗粒中：

[0054] 开启通风橱，将称量好的10.0mg二甲基十八烷基环氧丙基氯化铵、10.0mg胆固醇加入到梨形瓶中，用移液管取250μL的二油酰磷脂酰胆碱溶液，100μL的羧甲基壳聚糖十六烷基季铵盐溶液至梨形瓶中，混匀；将梨形瓶快速移到超声波细胞粉碎仪中，超声功率为27％，超声2s，间隔1s，温度25℃，超声处理30s，用定量移液器取6mL超纯水至梨形瓶中，继续超声至总时间6min。取出梨形瓶至真空旋转蒸发仪上进行真空旋转蒸发30min；加入靶向HER2的TFO片段作用3min，取一个1.5mL的离心管称重，2～8℃保存，得到高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物。

[0055] 将上述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物注射入人源肿瘤移殖瘤模型中观察疗效，并与未包裹的裸TFO对比使用剂量及效果：将高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物注射入与实施例4相同的人源肿瘤移殖瘤模型中，观察肿瘤大小变化；将实施例4和本实施例中达到相同抗肿瘤作用所用裸TFO片段或高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物剂量进行对比。

[0056] 实施例3

[0057] 分别在表达不同HER2水平的肿瘤细胞中验证所设计的靶向HER2的TFO片段的抗肿瘤作用：

[0058] 将设计得到的靶向HER2的TFO片段分别按不同浓度(25nM、50nM、100nM、200nM、400nM)转染至表达不同HER2水平的肿瘤细胞(MCF‑7、MDA‑MB‑453、SK‑BR‑3、BT474)，分别在
0h、24h、48h、72h进行CCK8分析实验，检测吸光度值，统计评价细胞增殖活力(图1～6)；

[0059] 按将上述转染方法转染后收集细胞，通过Western blot检测cleaved‑caspase3、cleaved‑PARP的表达水平评估细胞的早期凋亡情况。

[0060] 实施例4

[0061] 将所设计靶向HER2的TFO片段注射入人源肿瘤移殖瘤模型中观察疗效：

[0062] 构建HER2高表达的人源肿瘤移殖瘤模型；

[0063] 将设计的靶向HER2的TFO片段注射入上述人源肿瘤移殖瘤模型中，观察肿瘤大小变化。

[0064] 实施例5

[0065] 将实施例1及实施例2得到的高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物注射入高表达HER2且经常规化疗、靶向治疗耐药的晚期肿瘤患者，观察疗效及安全性：

[0066] 临床招募20～30例经化疗、靶向治疗耐药的HER2阳性的晚期肿瘤患者；在上述患者体内注射高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物，观察患者的肿瘤退缩情况及血液学、心脏等相关毒副反应。

[0067] 实施例6

[0068] 所述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物，采用如下方法制备而成：

[0069] S1、称取胆甾烯基甲酸酯45mg加入到10mL二氯甲烷中，再加入3‑咪唑基‑1‑基正丁胺15mg、4‑二甲氨基吡啶14.5mg、二环己基碳二亚胺15mg，在4℃下搅拌12h，反应结束后过滤，滤液在38℃，﹣0.9MPa减压浓缩至干后加水洗涤，再加入二氯甲烷萃取，分液，有机相干燥后在38℃，﹣0.9MPa下浓缩得到甲基咪唑‑胆甾醇；

[0070] S2、称取步骤S1中的甲基咪唑‑胆甾醇15mg、胆固醇25mg加入到圆底烧瓶中，随后取300μL的二油酰磷脂酰胆碱溶于15mL氯仿中，溶解后经减压浓缩除去溶剂，将残余物干燥至恒重后加入pH＝6.5的PBS缓冲液30mL，在38℃下振荡水化，在25W下超声处理20min，经0.45μm微孔滤膜过滤后旋转蒸发处理30min即得脂质体纳米颗粒；

[0071] S3、向所述脂质体纳米颗粒5mg中加入靶向HER2的TFO片段2mg并作用3min；

[0072] S4、将负载TFO片段的脂质体纳米颗粒称重，2～8℃冷藏保存，得到所述高效安全的治疗HER2高表达肿瘤的药物。

[0073] 测试例1

[0074] 对实施例1中所制备的药物进行测试，实验用5周龄雌性BALB/C裸鼠均购自上海7
Slake实验动物有限公司。为建立BT474裸鼠肿瘤模型，将BT474细胞(2.5×10)皮下注射于
3
裸鼠右后肢。当肿瘤体积增加到约100mm 时，荷瘤裸鼠随机分为四组，包括(1)空白对照组(PBS)，(2)TFO组，直接注射靶向HER2的TFO片段，(3)ZW‑128组，直接注射实施例1中的脂质体颗粒和(4)TFO@ZW‑128组，直接注射包裹有脂质体颗粒的TFO片段药物。每组4只。第0、2、
4、6、8、10、12天分别注射不同制剂(100μL)。治疗后每隔一天记录肿瘤大小和体重。治疗后第38天时处死裸鼠，收集肿瘤、重要脏器(心、肝、脾、肺、肾脏)标本。按不同组别分别测量肿瘤大小，并绘制时间‑肿块大小曲线。绘制不同组别肿块体重。绘制不同组别裸鼠体重‑时间曲线，见图9。对不同治疗组荷瘤小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行不同治疗后的H&E染色，然后进行拍片，见图10。

[0075] 从不同组别的小鼠的肿瘤生长情况可以看到，将TFO片段直接或者进行脂质体包裹后用于肿瘤的治疗均能够起到抑制肿瘤生长的作用，从不同治疗组荷瘤小鼠的主要脏器(心、肝、脾、肺、肾)进行不同治疗后的H&E染色图可以看出不同组别的药物均具有较高的体外安全性。

[0076] 测试例2

[0077] 将实施例1及实施例6中的脂质体包裹后的药物各分为2组，分别置于透析袋(＜1000Da)中，然后将透析袋分别悬浮于含有10mL PBS缓冲液(pH＝7.4)及10mLPBS缓冲液(pH＝5.0)的释放介质中，在37℃下以500rpm恒转孵育，24h、120h后采用荧光分析测定每组释放的药物含量，以计算药物释放量，测试结果见表1.

[0078] 表1体外释放结果表

[0079]

[0080] 由于在肿瘤、感染或发生炎症的区域，其组织pH值往往低于正常组织，因此对于脂质体进行结构进行改造使得其具有pH敏感性十分有意义。在实施例6中由于甲基咪唑‑胆甾醇的pH敏感性，当脂质体所处环境的pH发生变化时，其能够产生质子化转变，这促使脂质体膜和核内体膜融合，导致其水内容物的快速释放，因此其在低pH条件下的释放更快，能够更快速地作用于肿瘤部位从而更快起到治疗效果。

[0081] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。