一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法

摘要

本发明公开了一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，属于养殖水体处理技术领域。所述修复方法为：以芜萍为载体，对植物生长促进菌进行负载，然后将其投放于养殖尾水中，即完成养殖尾水的原位修复。本发明的修复方法可以使养殖尾水中不同类型的污染物均得到原位净化，极大地提高了养殖尾水的净化效果和处理效率，同时在修复完成后对芜萍进行回收，收集的芜萍可进一步进行资源化利用。

权利要求

1.一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，其特征在于，所述修复方法为：以芜萍为载体，对植物生长促进菌进行负载，然后将其投放于养殖尾水中，即完成养殖尾水的原位修复；

所述植物生长促进菌包括光合细菌和醋酸钙不动杆菌；

其中，所述光合细菌和醋酸钙不动杆菌的添加量之比为1∶1。

2.根据权利要求1所述的一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，其特征在于，所述修复方法具体为：(1)在富含氨氮磷的培养液中对所述芜萍进行驯化和扩大培养，然后将得到的经过驯化和扩大培养后的芜萍置于植物生长促进菌菌液中再次培养，得到负载有植物生长促进菌的芜萍；

(2)将所述负载有植物生长促进菌的芜萍投放于所述养殖尾水中进行处理，即完成所述养殖尾水的原位修复。

3.根据权利要求2所述的一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，其特征在于，步骤(1)中所述驯化和扩大培养的温度为30℃，时间为9天。

4.根据权利要求2所述的一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位

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修复方法，其特征在于，步骤(1)中所述植物生长促进菌菌液中含有2×10～2×10CFU/mL菌体浓度；

所述再次培养的温度为30℃，时间为5～15天。

5.根据权利要求2所述的一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，其特征在于，步骤(2)中所述投放时保持面积覆盖率为40～60％；

所述处理的时间为5～15天。

说明书

一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位

修复方法

技术领域

[0001] 本发明属于养殖水体处理技术领域，具体涉及一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法。

背景技术

[0002] 随着渔业的高速发展，养殖户为了有较高的产量，在养殖过程中投入了大量的饲料。各种水产品的排泄物、残饵等经过长时间累积，严重破坏了养殖水体的生态平衡，失去水体本该存在的自然调节功能，致使发生大规模的传染性疾病，给养殖户带来严重的损失。

[0003] 一般情况下，水体的氮磷循环处于一种稳定的状态，水体中总的氮磷维持在正常水平。但是，在水产养殖中，由于高密度养殖，致使水体的生态失衡、水质恶化、水体缺氧，进而造成养殖水体中氮磷含量超标。总氮和总磷是衡量水体富营养化的重要指标之一，然而水产养殖尾水产出的大量氮、磷排放到环境中，会导致湖泊、河流或近岸海域的水体产生富营养化，浮游生物大量繁殖，水中的溶解氧下降，水质恶化，进而导致鱼类及其他生物的大量死亡。

[0004] 目前，常见的养殖尾水的处理方法为人工湿地尾水处理模式、生态圈养模式和岸基一体化处理模式等方式，但是，均对场地及用电等提出了一定要求，存在成本高等缺陷，因此开发经济、环保的养殖尾水原位处理的方法是十分必要的。

发明内容

[0005] 为解决现有技术中的上述问题，本发明提供了一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

[0007] 本发明提供了一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，所述修复方法为：以芜萍为载体，对植物生长促进菌进行负载，然后将其投放于养殖尾水中，即完成养殖尾水的原位修复。

[0008] 有益效果：本发明中以芜萍为载体，芜萍是一种生长速率快、分布广的小型水生植物，具备优良的氨氮、总磷降解能力，而且易进行收割回收以实现固液分离等优良特点。而且芜萍对富营养化环境的耐受性较好，具有较为优秀的温度适应性及生长性能，由于芜萍无根系，生长较迅速，使芜萍的生物密度较大，能够为植物生长促进菌(PGPB(plant growth‑promotingbacteria))提供良好的生存环境。此外，芜萍中还富含丰富的淀粉、纤维素、维生素、蛋白质、脂肪酸、氨基酸等营养物质，可作为生物能源，是鱼类、禽类的优质饲料来源，具有较大的应用潜力。并且，由于其含有大量的高营养价值成分，在对污染水体完成水质净化后将芜萍进行回收，可实现资源化利用。

[0009] 进一步地，所述植物生长促进菌包括光合细菌和醋酸钙不动杆菌；其中，所述光合细菌和醋酸钙不动杆菌的添加量之比为1∶1。

[0010] 有益效果：本发明中采用的光合细菌种属为假单胞菌属，不仅具有良好的氨氮去除效果，还能够在好氧及厌氧条件下进行反效果作用，并可在较大的溶氧环境(0.1～7.0mg/L)中生存。而且假单胞菌属对有机污染物有高效降解能力，生长周期短、对环境适应性强。因此，通过对芜萍负载适量的植物生长促进菌PGPB以增强水体硝态氮、亚硝态氮和难降解有机物的处理效果，以弥补芜萍趋于利用氨氮带来的不足。

[0011] 本发明利用芜萍负载植物生长促进菌处理养殖尾水，其特点在于利用芜萍分泌有机质，为微生物提供碳源，并通过芜萍的高个体密度为光合细菌提供良好的生存环境，从而促进污染物的降解效率。芜萍和植物生长促进菌两者的联合应用可极大提高水质的净化效果和速率。

[0012] 本发明以醋酸钙不动杆菌作为植物生长促进菌之一，其是第一个从水生生物中分离出的PGPB菌株，能够使芜萍的每周产量大量增加，并且该菌种能够对包括芳香酚和脂肪族烷烃在内的碳氢化合物进行降解，是优质的植物生长促进菌。

[0013] 进一步地，所述植物生长促进菌的筛选过程为：

[0014] 从养殖基地(中国水产科学研究院珠江水产研究所精准养殖基地)中的尾水处理池中收集成熟芜萍，使用无菌水清洗后于含有100mL Hoagland培养基(pH 7.0)的300mL烧瓶中进行培养。在烧瓶中添加200mg/L的苯酚，设置温度为25℃，日夜光周期为16小时/8小时，光照强度为8500lx。富集培养3周后，使用无菌水洗涤芜萍，然后转移至旱藕1mL 5mg/L的三聚磷酸钠的离心管中进行超声处理，以分散附着的植物生长促进菌。将植物生长促进菌悬浮液用无菌水稀释并铺在基础盐培养基(BM)上，添加20mg/L苯酚作为唯一碳源的琼脂平板。挑取平板上出现的植物生长促进菌并传代培养数次以获得纯分离株，将获得的纯分离株在‑80℃下保存在补充有15％灭菌甘油的LB培养基中，待使用。

[0015] 进一步地，所述修复方法具体为：

[0016] (1)在富含氨氮磷的培养液中对所述芜萍进行驯化和扩大培养，然后将得到的经过驯化和扩大培养后的芜萍置于植物生长促进菌菌液中再次培养，得到负载有植物生长促进菌的芜萍；

[0017] (2)将所述负载有植物生长促进菌的芜萍投放于所述养殖尾水中进行处理，即完成所述养殖尾水的原位修复。

[0018] 更进一步地，步骤(1)中所述驯化和扩大培养的具体步骤为：

[0019] (1)先配制驯化营养液，配方为：MgSO4·7H2O：246mg/L，Ca(NO3)2·4H2O：543mg/L，KH2PO4：34mg/L，KNO3：303mg/L，H3BO3：1.43mg/L，MnCl2·4H2O：0.91mg/L，ZnSO4·7H2O：0.11mg/L，Na2MoO4·2H2O：0.045mg/L，CuSO4·5H2O：0.045mg/L，FeSO4·7H2O：9.92mg/L，Na2EDTA：30mg/L。

[0020] (2)然后向营养液中加入氨氮和总磷，并按照40、60、80mg/L的氨氮浓度梯度和10、15、20mg/L的总磷浓度梯度逐步提高培养液中氨氮和总磷的浓度，以3天为一个驯化阶段，对芜萍进行耐高浓度氨氮和总磷的驯化，并同时完成扩大培养。

[0021] 有益效果：本发明在进行负载前对芜萍进行高浓度氨氮和总磷的耐受驯化，在浓度为40～80mg/L氨氮和浓度为10～20mg/L总磷的浓度范围内逐渐提高芜萍培养液中的氨氮和总磷含量，经过筛选后，提高了芜萍的负载能力，得到了具有高负载能力的芜萍个体。

[0022] 更进一步地，步骤(1)中所述菌液的添加量按照每亩(平均水深1m)芜萍覆盖面积添加2L菌液，将菌液均匀泼洒在芜萍释放区域内。

[0023] 所述驯化和扩大培养的温度为30℃，时间为9天。本发明中将驯化和扩大培养的温度设为30℃，为芜萍的最佳生长温度，在此温度下芜萍每天可以扩增1倍。驯化和扩大培养9天，能够筛选出生长性能以及对氨氮和总磷耐受性最好的芜萍群体。

[0024] 所述植物生长促进菌菌液中含有2×106～2×108CFU/mL菌体浓度；所述再次培养的温度为30℃，时间为5～15天。

[0025] 更进一步地，步骤(2)中所述投放时保持面积覆盖率为40～60％；所述处理的时间为5～15天。

[0026] 更进一步地，在芜萍及植物生长促进菌联合处理完成后，回收芜萍。

[0027] 本发明净化养殖尾水的原理：本发明利用具备优秀氮磷去除效果以及高生长速度的芜萍在含有植物生长促进菌菌液的培养液中培养一定时间，使植物生长促进菌在芜萍上定植，在这一过程中能够对芜萍个体进行筛选，选择定植效果好且生长迅速的个体。再将定植有上述菌种的芜萍投放入养殖尾水当中，利用植物生长促进菌中的光合细菌的反硝化作用，降低养殖尾水中的有机物、硝态氮和亚硝态氮浓度，同时利用芜萍对氨氮和总磷的利+用，将二者联合，实现对养殖尾水的高效净化作用，可极大提高水体中COD、NH4 ‑N、NO2‑N、NO3‑N和TP的处理效果和速率。

[0028] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0029] 本发明中的利用芜萍负载植物生长促进菌PGPB联合处理养殖尾水的原位修复方法，利用芜萍和植物生长促进菌联合处理养殖尾水，使不同类型的污染物均得到原位净化，极大提高了养殖尾水的处理效率和净化效果；其中的光合细菌可以有效去除水体中的有机物、硝态氮和亚硝态氮；芜萍可以有效去除养殖尾水中的氨氮和总磷，并为植物生长促进菌提供良好的生存环境；醋酸钙不动杆菌可以促进芜萍的高效生长，提高养殖尾水中污染物的处理速度，加速氨氮和总磷等的利用。而且本发明还可以在水质净化完成后，对芜萍进行回收，重新进行资源化利用。本发明的修复方法操作简单、成本低廉、绿色无污染。

具体实施方式

[0030] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。

[0031] 另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0032] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0033] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0034] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0035] 本发明的实施例和对比例中的养殖尾水均属于同一池塘，该池塘位于中国水产科学研究院珠江水产研究所精准养殖基地的淡水鱼类养殖池。

[0036] 实施例1

[0037] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，包括以下步骤：

[0038] (1)先配制驯化营养液，配方为：MgSO4·7H2O：246mg/L，Ca(NO3)2·4H2O：543mg/L，KH2PO4：34mg/L，KNO3：303mg/L，H3BO3：1.43mg/L，MnCl2·4H2O：0.91mg/L，ZnSO4·7H2O：0.11mg/L，Na2MoO4·2H2O：0.045mg/L，CuSO4·5H2O：0.045mg/L，FeSO4·7H2O：9.92mg/L，Na2EDTA：30mg/L。然后向营养液中加入氨氮和总磷，并按照40、60、80mg/L的氨氮浓度梯度和10、15、20mg/L的总磷浓度梯度逐步提高培养液中氨氮和总磷的浓度，以3天为一个驯化阶段，对芜萍进行耐高浓度氨氮和总磷的驯化，共进行3个阶段，共9天，选择生长性能以及对氨氮和总磷耐受性最好的芜萍，并同时完成扩大培养，该扩大培养的温度为30℃；

[0039] (2)将步骤(1)中得到的经过驯化和扩大培养后的芜萍置于含有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的菌液中，在温度30℃下再次培养10天，其中，菌液中含有菌体(光合细菌和醋7
酸钙不动杆菌)浓度为3×10CFU/mL，菌液中光合细菌和醋酸钙不动杆菌的添加量之比为1∶1，以实现光合细菌和醋酸钙不动杆菌的有效搭载，得到负载有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的芜萍；

[0040] (3)将上述负载有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的芜萍以50％的面积覆盖率投放于2
面积为100m 的养殖尾水中进行原位修复10天，并在处理期间对芜萍进行定期收割，使其浮萍面积覆盖率保持为50％。

[0041] 实施例2

[0042] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，包括以下步骤：

[0043] (1)先配制驯化营养液，配方为：MgSO4·7H2O：246mg/L，Ca(NO3)2·4H2O：543mg/L，KH2PO4：34mg/L，KNO3：303mg/L，H3BO3：1.43mg/L，MnCl2·4H2O：0.91mg/L，ZnSO4·7H2O：0.11mg/L，Na2MoO4·2H2O：0.045mg/L，CuSO4·5H2O：0.045mg/L，FeSO4·7H2O：9.92mg/L，Na2EDTA：30mg/L。然后向营养液中加入氨氮和总磷，并按照40、60、80mg/L的氨氮浓度梯度和10、15、20mg/L的总磷浓度梯度逐步提高培养液中氨氮和总磷的浓度，以3天为一个驯化阶段，对芜萍进行耐高浓度氨氮和总磷的驯化，共进行3个阶段，共9天，并同时完成扩大培养，该扩大培养的温度为30℃；

[0044] (2)将步骤(1)中得到的经过驯化和扩大培养后的芜萍置于含有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的菌液中，在温度30℃下再次培养6天，其中，菌液中含有菌体(光合细菌和醋酸6
钙不动杆菌)浓度为2×10CFU/mL，菌液中光合细菌和醋酸钙不动杆菌的添加量之比为1∶
1，以实现光合细菌和醋酸钙不动杆菌的有效搭载，得到负载有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的芜萍；

[0045] (3)将上述负载有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的芜萍以40％的面积覆盖率投放于2
面积为100m 的养殖尾水中进行原位修复15天，并在处理期间对芜萍进行定期收割，使其浮萍面积覆盖率保持为40％。

[0046] 实施例3

[0047] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，包括以下步骤：

[0048] (1)先配制驯化营养液，配方为：MgSO4·7H2O：246mg/L，Ca(NO3)2·4H2O：543mg/L，KH2PO4：34mg/L，KNO3：303mg/L，H3BO3：1.43mg/L，MnCl2·4H2O：0.91mg/L，ZnSO4·7H2O：0.11mg/L，Na2MoO4·2H2O：0.045mg/L，CuSO4·5H2O：0.045mg/L，FeSO4·7H2O：9.92mg/L，Na2EDTA：30mg/L。然后向营养液中加入氨氮和总磷，并按照40、60、80mg/L的氨氮浓度梯度和10、15、20mg/L的总磷浓度梯度逐步提高培养液中氨氮和总磷的浓度，以3天为一个驯化阶段，对芜萍进行耐高浓度氨氮和总磷的驯化，共进行3个阶段，共9天，并同时完成扩大培养，该扩大培养的温度为30℃；

[0049] (2)将步骤(1)中得到的经过驯化和扩大培养后的芜萍置于含有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的菌液中，在温度30℃下再次培养15天，其中，菌液中含有菌体(光合细菌和醋8
酸钙不动杆菌)浓度为2×10CFU/mL，菌液中光合细菌和醋酸钙不动杆菌的添加量之比为1∶1，以实现光合细菌和醋酸钙不动杆菌的有效搭载，得到负载有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的芜萍；

[0050] (3)将上述负载有光合细菌和醋酸钙不动杆菌的芜萍以60％的面积覆盖率投放于2
面积为100m 的养殖尾水中进行原位修复5天，并在处理期间对芜萍进行定期收割，使其浮萍面积覆盖率保持为60％。

[0051] 对比例1

[0052] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，与实施例1的区别在于：将光合细菌等量替换为蓝细菌；

[0053] 其余步骤同实施例1。

[0054] 对比例2

[0055] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，与实施例1的区别在于：将醋酸钙不动杆菌等量替换为鲁菲不动杆菌；

[0056] 其余步骤同实施例1。

[0057] 对比例3

[0058] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，与实施例6
1的区别在于：将步骤(2)菌液中的菌体浓度替换为1.991×10CFU/mL；

[0059] 其余步骤同实施例1。

[0060] 对比例4

[0061] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，与实施例8
1的区别在于：将步骤(2)菌液中的菌体浓度替换为2.005×10CFU/mL；

[0062] 其余步骤同实施例1。

[0063] 对比例5

[0064] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，与实施例1的区别在于：将步骤(3)中的面积覆盖率替换为36％；

[0065] 其余步骤同实施例1。

[0066] 对比例6

[0067] 一种利用芜萍负载植物生长促进菌联合处理养殖尾水的原位修复方法，与实施例1的区别在于：将步骤(3)中的面积覆盖率替换为65％；

[0068] 其余步骤同实施例1。

[0069] 对实施例1‑3和对比例1‑6中经过原位修复后的养殖尾水中的污染物浓度进行检测，检测结果如表1所示(在修复前对整个池塘中的污染物浓度检测结果为：氨氮19.3mg/L、COD 52.1mg/L、总磷3.87mg/L、硝态氮8.5mg/L、亚硝态氮7.3mg/L)。

[0070] 表1

[0071]

[0072] 由表1可知，本发明的养殖尾水的原位修复方法使养殖尾水中不同类型的污染物，即氨氮、COD、总磷、硝态氮和亚硝态氮均得到原位净化，且净化效率较高，均达到了90％以上，极大地提高了养殖尾水的净化效果和处理效率，同时在修复完成后对芜萍进行回收，收集的芜萍可进一步进行资源化利用。

[0073] 以上，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。