一种靶向5T4的抗体及其应用

摘要

本发明提供了一种靶向5T4的抗体及其应用。本发明的5T4抗体表现出优异的特异性和结合能力，其衍生的嵌合抗原受体显示出了对肿瘤细胞优异的杀伤能力，而且细胞毒性较小，副作用低。

权利要求

1.一种靶向5T4的抗体或其抗原结合片段，其特征在于，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：SEQ ID NO:31所示的HCDR1，SEQ ID NO:32所示的HCDR2，和SEQ ID NO:33所示的HCDR3；

且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：SEQ ID NO:25所示的LCDR1，SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和SEQ ID NO:27所示的LCDR3；

其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案。

2.一种重组蛋白，其特征在于，所述的重组蛋白具有：(i) 如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段；

以及(ii)协助表达和/或纯化的标签序列。

3.一种嵌合抗原受体CAR，其特征在于，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域含有靶向

5T4的抗体单链可变区序列scFv，

所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：SEQ ID NO:31所示的HCDR1，SEQ ID NO:32所示的HCDR2，和SEQ ID NO:33所示的HCDR3；

且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：SEQ ID NO:25所示的LCDR1，SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和SEQ ID NO:27所示的LCDR3；

其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案。

4.一种多核苷酸，其特征在于，所述多核苷酸编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，如权利要求2所述的重组蛋白，或如权利要求3所述的嵌合抗原受体CAR。

5.一种载体，其特征在于，所述的载体含有权利要求4所述的多核苷酸。

6.一种宿主细胞，其特征在于，所述的宿主细胞中含有权利要求5所述的载体或染色体中整合有外源的权利要求4所述的多核苷酸。

7.一种制备CAR‑NK细胞或CAR‑T细胞的方法，其特征在于，所述的CAR‑NK细胞或CAR‑T细胞表达权利要求3所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：将权利要求4所述的多核苷酸或权利要求5所述的载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述CAR‑NK细胞或CAR‑T细胞。

8.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物含有权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求2所述的重组蛋白、权利要求3所述的嵌合抗原受体、如权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的载体、或权利要求6所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

9. 一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：(a) 抗体部分，所述抗体部分选自下组：如权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求2所述的重组蛋白、或其组合；和(b) 与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、放射性核素、或其组合。

10. 一种权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求2所述的重组蛋白、权利要求3所述的嵌合抗原受体、权利要求4所述的多核苷酸、权利要求5所述的载体、权利要求6所述的宿主细胞、权利要求8所述的药物组合物或权利要求9所述的免疫偶联物的用途，其特征在于，(a)制备用于检测5T4相关疾病的检测试剂或试剂盒；和/或(b)制备预防和/或治疗5T4相关疾病的药物或制剂；

所述5T4相关疾病为乳腺癌、卵巢癌、肺癌、胰腺癌。

11.如权利要求10所述的用途，其特征在于，所述5T4相关疾病为肺癌。

12.一种重组多肽的制备方法，其特征在于，该方法包含：(a) 在适合表达的条件下，培养权利要求6所述的宿主细胞；

(b) 从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求2所述的重组蛋白。

13.一种检测板，其特征在于，所述的检测板包括：基片和测试条，所述的测试条含有权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、如权利要求2所述的重组蛋白、权利要求9所述的免疫偶联物、或其组合。

14. 一种试剂盒，其特征在于，所述试剂盒中包括：(1) 第一容器，所述第一容器中含有权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段；和/或(2) 第二容器，所述第二容器中含有抗权利要求1所述的抗体的二抗；

或者，所述试剂盒含有权利要求13所述的检测板。

说明书

一种靶向5T4的抗体及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域。具体地，涉及一种靶向5T4的抗体及其应用。

背景技术

[0002] 5T4(也称为滋养层糖蛋白，TPBG或Wnt激活的抑制因子1，WAIF1)，是一种由TPBG基因编码的人类蛋白质。人类TPBG蛋白的分子量约为72kDa，包含420个氨基酸，其含有8个富亮氨酸重复序列(LRR)和7个潜在的N‑糖基化位点。

[0003] 5T4广泛表达于胚胎发育期的各种滋养层细胞。对于正常成人组织中，5T4只在有限的几种上皮细胞中有表达。但是，5T4在很多癌细胞中表达，如子宫癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌或肾癌组织中都检测到5T4的表达，在结肠癌、胃癌或卵巢癌中有证据表明5T4的表达量与癌症的低治愈率相关。肿瘤细胞中5T4的表达通过促进上皮向间质转化(EMT)以及抑制经典Wnt/beta‑连环蛋白信号传导途径和激活非经典Wnt途径来促进肿瘤发展。在5T4高表达的肿瘤中，高浓度的CXCL12可以通过CXCR4趋化肿瘤细胞的运动；而在5T4低表达的肿瘤中，低浓度的CXCL12可以提供CXCR7发挥抗凋亡的作用。在非小细胞肺癌、乳腺癌、肾癌或胰腺癌的组织中，5T4的表达高达90％以上。此外，有研究表明在急性髓系淋巴瘤(AML，Acute Myeloid Leukaemia)中，5T4也有广泛的表达。更重要的是，在某些肿瘤干细胞中，5T4也有较高的表达。因此，5T4是一个极具潜力的肿瘤相关抗原，利用包括抗体、肿瘤疫苗、CAR‑T、CAR‑NK等手段靶向5T4，具有非常广阔的应用前景。然而，现有技术中的靶向5T4相关的抗体、CAR‑T、CAR‑NK等的生物性能仍然难以令人满意。

[0004] 因此，本领域亟待开发具有优异性能的新的靶向5T4的抗体。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种靶向5T4的抗体及其应用。

[0006] 在本发明的第一方面，提供了一种靶向5T4的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：

[0007] (1)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0008] SEQ ID NO:31所示的HCDR1，

[0009] SEQ ID NO:32所示的HCDR2，和

[0010] SEQ ID NO:33所示的HCDR3；

[0011] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0012] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0013] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0014] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0015] (2)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0016] SEQ ID NO:22所示的HCDR1，

[0017] SEQ ID NO:23所示的HCDR2，和

[0018] SEQ ID NO:24所示的HCDR3；

[0019] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0020] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0021] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0022] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0023] (3)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0024] SEQ ID NO:28所示的HCDR1，

[0025] SEQ ID NO:29所示的HCDR2，和

[0026] SEQ ID NO:30所示的HCDR3；

[0027] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0028] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0029] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0030] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0031] (4)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0032] SEQ ID NO:16所示的HCDR1，

[0033] SEQ ID NO:17所示的HCDR2，和

[0034] SEQ ID NO:18所示的HCDR3；

[0035] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0036] SEQ ID NO:19所示的LCDR1，

[0037] SEQ ID NO:20所示的LCDR2，和

[0038] SEQ ID NO:21所示的LCDR3；其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案。

[0039] 在另一优选例中，所述抗体或其抗原结合片段的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：

[0040] (1)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0041] SEQ ID NO:40所示的HCDR1，

[0042] SEQ ID NO:41所示的HCDR2，和

[0043] SEQ ID NO:33所示的HCDR3；

[0044] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0045] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0046] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0047] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0048] (2)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0049] SEQ ID NO:36所示的HCDR1，

[0050] SEQ ID NO:37所示的HCDR2，和

[0051] SEQ ID NO:24所示的HCDR3；

[0052] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0053] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0054] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0055] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0056] (3)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0057] SEQ ID NO:38所示的HCDR1，

[0058] SEQ ID NO:39所示的HCDR2，和

[0059] SEQ ID NO:30所示的HCDR3；

[0060] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0061] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0062] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0063] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0064] (4)所述重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0065] SEQ ID NO:34所示的HCDR1，

[0066] SEQ ID NO:35所示的HCDR2，和

[0067] SEQ ID NO:18所示的HCDR3；

[0068] 且所述轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0069] SEQ ID NO:19所示的LCDR1，

[0070] SEQ ID NO:20所示的LCDR2，和

[0071] SEQ ID NO:21所示的LCDR3；其中，所述的CDR序列基于Chothia的编号方案。

[0072] 在另一优选例中，所述的抗体包括重链和轻链，所述的重链包括所述的三个重链CDR以及用于连接重链CDR的重链框架区；所述轻链包括所述的三个轻链CDR以及用于连接轻链CDR的轻链框架区。

[0073] 在另一优选例中，所述抗体的轻链还包括轻链恒定区。

[0074] 在另一优选例中，所述的轻链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

[0075] 在另一优选例中，所述的抗体的重链还包括重链恒定区。

[0076] 在另一优选例中，所述的重链恒定区为人源、鼠源或兔源的，较佳地为人源的。

[0077] 在另一优选例中，所述的抗体为双链抗体、或单链抗体。

[0078] 在另一优选例中，所述的抗体为单克隆抗体。

[0079] 在另一优选例中，所述的抗体包括单特异性、双特异性、或三特异性抗体。

[0080] 在另一优选例中，所述抗体特异性结合5T4。

[0081] 在另一优选例中，所述抗体对人5T4的亲和力的KD值(M)为1.0E‑7～2.0E‑9。

[0082] 在另一优选例中，所述抗体具有如SEQ ID NO:7所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:8所示的轻链可变区；或

[0083] 所述抗体具有如SEQ ID NO:3所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:4所示的轻链可变区；或

[0084] 所述抗体具有如SEQ ID NO:5所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:6所示的轻链可变区；或

[0085] 所述抗体具有如SEQ ID NO:1所示的重链可变区，和如SEQ ID NO:2所示的轻链可变区。

[0086] 在另一优选例中，所述抗体具有的重链可变区与SEQ ID NO:7、3、5、1所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性(其中CDR不变或基本不变)。

[0087] 在另一优选例中，所述抗体具有的轻链可变区与SEQ ID NO:8、4、6、2所示的氨基酸序列至少有80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的序列同源性或序列相同性(其中CDR不变或基本不变)。

[0088] 在本发明的第二方面，提供了一种重组蛋白，所述的重组蛋白具有：

[0089] (i)如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；

[0090] 以及(ii)任选的协助表达和/或纯化的标签序列。

[0091] 在另一优选例中，所述的标签序列包括6His标签。

[0092] 在另一优选例中，所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。

[0093] 在另一优选例中，所述的重组蛋白为单体、二聚体、或多聚体。

[0094] 在另一优选例中，所述的重组蛋白还包括与所述元件(i)融合在一起的额外的融合元件(或融合多肽片段)。

[0095] 在本发明的第三方面，提供了一种嵌合抗原受体CAR，所述嵌合抗原受体的抗原结合结构域含有靶向5T4的抗体单链可变区序列scFv，所述scFv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：

[0096] (1)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0097] SEQ ID NO:31所示的HCDR1，

[0098] SEQ ID NO:32所示的HCDR2，和

[0099] SEQ ID NO:33所示的HCDR3；

[0100] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0101] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0102] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0103] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0104] (2)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0105] SEQ ID NO:22所示的HCDR1，

[0106] SEQ ID NO:23所示的HCDR2，和

[0107] SEQ ID NO:24所示的HCDR3；

[0108] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0109] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0110] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0111] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0112] (3)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0113] SEQ ID NO:28所示的HCDR1，

[0114] SEQ ID NO:29所示的HCDR2，和

[0115] SEQ ID NO:30所示的HCDR3；

[0116] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0117] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0118] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0119] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0120] (4)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0121] SEQ ID NO:16所示的HCDR1，

[0122] SEQ ID NO:17所示的HCDR2，和

[0123] SEQ ID NO:18所示的HCDR3；

[0124] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0125] SEQ ID NO:19所示的LCDR1，

[0126] SEQ ID NO:20所示的LCDR2，和

[0127] SEQ ID NO:21所示的LCDR3；

[0128] 其中，所述的CDR序列基于Kabat的编号方案。

[0129] 在另一优选例中，所述scFv的重链可变区和轻链可变区包括选自下组的互补决定区CDR：

[0130] (1)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0131] SEQ ID NO:40所示的HCDR1，

[0132] SEQ ID NO:41所示的HCDR2，和

[0133] SEQ ID NO:33所示的HCDR3；

[0134] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0135] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0136] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0137] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0138] (2)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0139] SEQ ID NO:36所示的HCDR1，

[0140] SEQ ID NO:37所示的HCDR2，和

[0141] SEQ ID NO:24所示的HCDR3；

[0142] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0143] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0144] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0145] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0146] (3)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0147] SEQ ID NO:38所示的HCDR1，

[0148] SEQ ID NO:39所示的HCDR2，和

[0149] SEQ ID NO:30所示的HCDR3；

[0150] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0151] SEQ ID NO:25所示的LCDR1，

[0152] SEQ ID NO:26所示的LCDR2，和

[0153] SEQ ID NO:27所示的LCDR3；或

[0154] (4)所述scFv的重链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0155] SEQ ID NO:34所示的HCDR1，

[0156] SEQ ID NO:35所示的HCDR2，和

[0157] SEQ ID NO:18所示的HCDR3；

[0158] 且所述scFv的轻链可变区包括以下互补决定区CDR：

[0159] SEQ ID NO:19所示的LCDR1，

[0160] SEQ ID NO:20所示的LCDR2，和

[0161] SEQ ID NO:21所示的LCDR3；其中，所述的CDR序列基于Chothia的编号方案。

[0162] 在另一优选例中，所述scFv还包含重链可变区和轻链可变区之间的连接肽。

[0163] 在另一优选例中，所述的连接肽为(G4S)3或(G4S)4。

[0164] 在另一优选例中，所述scFv如下式A或式B所示：

[0165] VH‑VL,(A)；VL‑VH,(B)

[0166] 式中，VH为所述抗体重链可变区；VL为所述抗体轻链可变区；“‑”为连接肽或肽键；

[0167] 并且，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示；

[0168] 或者，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示；

[0169] 或者，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示；

[0170] 或者，VH的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，VL的氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示。

[0171] 在另一优选例中，所述的抗体单链可变区包括人源的、鼠源的、人鼠嵌合的抗体单链可变区。

[0172] 在另一优选例中，所述scFv如式A(VH‑VL)所示。

[0173] 在另一优选例中，所述抗原结合结构域靶向5T4的细胞外区域。

[0174] 在另一优选例中，所述的嵌合抗原受体具有下式I结构：

[0175] L‑scFv‑H‑TM‑C‑CD3ζ(I)

[0176] 式中，

[0177] 各“‑”独立地为连接肽或肽键；

[0178] L为无或信号肽序列；

[0179] scFv为靶向5T4的scFv；

[0180] H为任选的铰链区；

[0181] TM为跨膜结构域；

[0182] C为共刺激信号分子；

[0183] CD3ζ为CD3ζ胞浆信号传导序列。

[0184] 在另一优选例中，所述的L为选自下组蛋白的信号肽：CD8、CD4、CD16、CD56、CD137、CSF2、DAP12、EF1、GM‑CSF、IL‑8、IL‑21或其组合。

[0185] 在另一优选例中，所述的L来源为CD8来源的信号肽。

[0186] 在另一优选例中，所述scFv如下式A或式B所示：

[0187] VH‑VL,(A)；VL‑VH,(B)

[0188] 式中，VH为所述抗体重链可变区；VL为所述抗体轻链可变区；“‑”为连接肽或肽键。

[0189] 在另一优选例中，所述scFv如式A(VH‑VL)所示。

[0190] 在另一优选例中，所述的H为选自下组蛋白的铰链区：CD8、CD28、CD137、Fc、或其组合。

[0191] 在另一优选例中，所述的H为CD28来源的铰链区。

[0192] 在另一优选例中，所述的TM为选自下组的蛋白的跨膜区：CD27、CD28、CD3epsilon、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD37、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、或其组合。

[0193] 在另一优选例中，所述的TM为CD28来源的跨膜区。

[0194] 在另一优选例中，所述的C为选自下组的蛋白的共刺激信号分子：OX40、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD40、CD70、CD134、4‑1BB(CD137)、PD1、Dap10、CDS、ICAM‑1、LFA‑1(CD11a/CD18)、ICOS(CD278)、NKG2D、GITR、TLR2、或其组合。

[0195] 在另一优选例中，C为CD28来源的共刺激信号分子。

[0196] 在另一优选例中，所述CAR的氨基酸序列如SEQ ID NO:42‑45任一所示。

[0197] 在本发明的第四方面，提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸编码本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，如本发明的第二方面所述的重组蛋白，或如本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体CAR。

[0198] 在另一优选例中，所述多核苷酸为分离的。

[0199] 在本发明的第五方面，提供了一种载体，所述的载体含有本发明的第四方面所述的多核苷酸。

[0200] 在另一优选例中，所述的载体选自下组：DNA、RNA、质粒、慢病毒载体、腺病毒载体、逆转录病毒载体、转座子、或其组合。

[0201] 在另一优选例中，所述载体为逆转录病毒载体。

[0202] 在本发明的第六方面，提供了一种宿主细胞，所述的宿主细胞中含有本发明的第五方面所述的载体或染色体中整合有外源的本发明的第四方面所述的多核苷酸。

[0203] 在另一优选例中，所述细胞为分离的细胞，和/或所述细胞为基因工程化的细胞。

[0204] 在另一优选例中，所述细胞为哺乳动物细胞。

[0205] 在另一优选例中，所述细胞为NK细胞或T细胞。

[0206] 在另一优选例中，所述的宿主细胞为工程化的免疫细胞。

[0207] 在另一优选例中，所述的工程化的免疫细胞包括T细胞或NK细胞，较佳地为(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR‑T细胞)；或(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR‑NK细胞)，其中，NK细胞的来源包括外周血、脐带血、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)等。

[0208] 在另一优选例中，所述宿主细胞为免疫细胞，所述免疫细胞表达或在细胞膜外暴露有本发明的第一方面所述的抗体或本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体。

[0209] 在另一优选例中，所述的免疫细胞包括NK细胞、T细胞。

[0210] 在另一优选例中，所述的免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。

[0211] 在本发明的第七方面，提供了一种制备CAR‑NK细胞或CAR‑T细胞的方法，所述的CAR‑NK细胞或CAR‑T细胞表达本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体，包括以下步骤：

[0212] 将本发明的第四方面所述的多核苷酸或本发明的第五方面所述的载体转导入NK细胞或T细胞内，从而获得所述CAR‑NK细胞或CAR‑T细胞。

[0213] 在本发明的第八方面，提供了一种药物组合物，所述药物组合物含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体、如本发明的第四方面所述的多核苷酸、本发明的第五方面所述的载体、或本发明的第六方面所述的宿主细胞，以及药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。

[0214] 在另一优选例中，所述药物组合物为制剂，优选为液态制剂。

[0215] 在另一优选例中，所述药物组合物的剂型为注射剂。

[0216] 在另一优选例中，所述的药物组合物用于制备预防和/或治疗癌症或肿瘤的药物或制剂。

[0217] 在本发明的第九方面，提供了一种免疫偶联物，所述的免疫偶联物含有：

[0218] (a)抗体部分，所述抗体部分选自下组：如本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、本发明的第二方面所述的重组蛋白、或其组合；和

[0219] (b)与所述抗体部分偶联的偶联部分，所述偶联部分选自下组：可检测标记物、药物、毒素、细胞因子、放射性核素、酶、或其组合。

[0220] 在另一优选例中，所述偶联物选自：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL‑2)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如，DT‑心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶‑样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

[0221] 在本发明的第十方面，提供了一种本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体、本发明的第四方面所述的多核苷酸、本发明的第五方面所述的载体、本发明的第六方面所述的宿主细胞、本发明的第八方面所述的药物组合物或本发明的第九方面所述的免疫偶联物的用途，

[0222] (a)制备检测试剂或试剂盒；和/或

[0223] (b)制备预防和/或治疗5T4相关疾病的药物或制剂。

[0224] 在另一优选例中，所述5T4相关疾病为癌症或肿瘤。

[0225] 在另一优选例中，所述肿瘤选自下组：血液肿瘤、实体瘤、或其组合。

[0226] 在另一优选例中，所述血液肿瘤选自下组：急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、或其组合。

[0227] 在另一优选例中，所述实体瘤选自下组：胃癌、胃癌腹膜转移、肝癌、白血病、肾脏肿瘤、肺癌、小肠癌、骨癌、前列腺癌、结直肠癌、乳腺癌、大肠癌、宫颈癌、卵巢癌、淋巴癌、鼻咽癌、肾上腺肿瘤、膀胱肿瘤、非小细胞肺癌(NSCLC)、脑胶质瘤、子宫内膜癌、或其组合。

[0228] 在另一优选例中，所述的肿瘤为5T4阳性肿瘤；较佳地选自下组：子宫癌、乳腺癌、结肠癌、胃癌、卵巢癌、口腔癌、前列腺癌、肺癌、肾癌。

[0229] 在另一优选例中，所述检测为免疫测定法。

[0230] 在另一优选例中，所述免疫测定法是ELISA免疫测定法、免疫层析测定法、免疫细胞化学染色测定法或者免疫组化染色测定法。

[0231] 在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。

[0232] 在另一优选例中，所述的试剂包括芯片、包被抗体的免疫微粒。

[0233] 在本发明的第十一方面，提供了一种体外检测(包括诊断性或非诊断性)样品中5T4蛋白的方法，所述方法包括步骤：

[0234] (1)将样品与本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明的第二方面中的重组蛋白接触；

[0235] (2)检测是否形成抗原‑抗体复合物，其中形成复合物就表示样品中存在5T4蛋白。

[0236] 在另一优选例中，所述的诊断试剂为检测片或检测板。

[0237] 在另一优选例中，所述方法为细胞免疫化学(Immunocytochemistry staning，ICC)检测方法，或免疫组化(ImmunohistochemistryIHC)检测方法，或whole cell(全细胞)ELISA检测方法，cell lysate(细胞裂解物)ELISA检测方法。

[0238] 在本发明的第十二方面，提供了一种重组多肽的制备方法，该方法包含：

[0239] (a)在适合表达的条件下，培养本发明的第六方面所述的宿主细胞；

[0240] (b)从培养物中分离出重组多肽，所述的重组多肽是本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段，或本发明的第二方面所述的重组蛋白。

[0241] 在本发明的第十三方面，提供了一种检测板，所述的检测板包括：基片(支撑板)和测试条，所述的测试条含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第九方面所述的免疫偶联物、或其组合。

[0242] 在本发明的第十四方面，提供了一种试剂盒，所述试剂盒中包括：

[0243] (1)第一容器，所述第一容器中含有本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段；和/或

[0244] (2)第二容器，所述第二容器中含有抗本发明抗体的二抗；

[0245] 或者，所述试剂盒含有本发明的第一方面3所述的检测板。

[0246] 在本发明的第十五方面，提供了一种治疗疾病的方法，包括给需要治疗的对象施用适量的本发明的第一方面所述的抗体或其抗原结合片段、如本发明的第二方面所述的重组蛋白、本发明的第六方面所述的宿主细胞或本发明的第八方面所述的药物组合物。

[0247] 在另一优选例中，所述疾病为癌症或肿瘤。

[0248] 应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。

附图说明

[0249] 图1显示了抗5T4抗体BC‑B25A01(Ab01)、BC‑B33E03(Ab02)、BC‑B33E7A(Ab03)、BC‑B33CJC(Ab04)针对不同细胞的EC50结果，A1抗体(Ab05)为阳性对照。

[0250] 图2显示了5T4抗体BC‑B25A01(25A01)、BC‑B33E03(33E03)、BC‑B33E7A(33E7A)、BC‑B33CJC(33CJC)的对人(h5T4)、食蟹猴(fas5T4)、小鼠(m5T4)5T4抗原的亲和力检测，5T4‑PF06263507(A1)抗体为阳性对照。

[0251] 图3显示了5T4 CAR结构示意图。

[0252] 图4显示了流式检测细胞表面5T4表达的检测。

[0253] 图5显示了流式检测分选前后5T4‑CAR的表达情况。

[0254] 图6显示了检测5T4CAR‑NK92结合靶细胞的亲和力。

[0255] 图7显示了检测5T4CAR‑NK92对多种靶细胞的杀伤能力，分别为5T4CAR‑NK92对SKOV3(图7A)、BxPC3(图7B)、A549(图7C)及MDA‑MB‑468(图7D)靶细胞在效靶比为1：1和3：1的杀伤情况。

[0256] 图8显示了原代NK细胞的分离鉴定。

[0257] 图9显示了流式检测原代NK细胞5T4‑CAR的表达率。

[0258] 图10显示了检测5T4‑CAR NK对SKOV3及NCI‑H460靶细胞的杀伤能力。

[0259] 图11显示了5T4抗体免疫染色方法实验结果。

具体实施方式

[0260] 本发明人经过广泛而深入地研究，进行了大量的筛选，首次获得了一种靶向5T抗体。具体地，本发明从超过100株单抗序列中，筛选获得BC‑B25A01、BC‑B33E03、BC‑B33E7A、BC‑B33CJC四株单抗序列。进一步基于此构建了靶向5T4的嵌合型抗原受体结构，表达所述嵌合型抗原受体的NK细胞对靶细胞表现出优越的杀伤能力。在此基础上完成了本发明。

[0261] 术语

[0262] 为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

[0263] 术语“约”可以是指在本领域普通技术人员确定的特定值或组成的可接受误差范围内的值或组成，其将部分地取决于如何测量或测定值或组成。

[0264] 如本文所用，术语“含有”或“包括(包含)”可以是开放式、半封闭式和封闭式的。换言之，所述术语也包括“基本上由…构成”、或“由…构成”。

[0265] 术语“抗体”(Ab)应包括但不限于免疫球蛋白，其特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链，或其抗原结合部分。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(本文缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包含一个恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其散布有更保守的称为框架区(FR)的区域。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按照以下顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3，CDR3，FR4。重链和轻链的可变区含有与抗原相互作用的结合结构域。

[0266] 如本文所用，术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。

[0267] 如本文所用，术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。

[0268] 如本文所用，术语“抗原结合结构域”等包括特异性结合抗原以形成复合物的任何天然存在的、酶促可获得的、合成性或基因修饰的多肽或糖蛋白。可以使用任何合适的标准技术如蛋白酶解消化或涉及操作并表达编码抗体可变域和任选地抗体恒定域的DNA的重组基因工程技术，例如，从完整抗体分子衍生抗体的抗原结合片段。这类DNA是已知的和/或从例如商业来源、DNA文库(包括例如，噬菌体抗体文库)轻易可获得或可以合成。可以对所述DNA测序并化学地或通过使用分子生物学技术操作，例如以将一个或多个可变域和/或恒定域排列成合适布局，或以引入密码子、产生半胱氨酸残基、修饰、添加或缺失氨基酸等。

[0269] 如本文所用，抗原结合片段或抗原结合结构域的非限制性例子包括：(i)Fab片段；(ii)F(ab')2片段；(iii)Fd片段；(iv)Fv片段；(v)单链Fv(scFv)分子；(vi)dAb片段；和(vii)由模拟抗体高变区的氨基酸残基组成的最小识别单位(例如，独立的互补性决定区(CDR)如CDR3肽)或受约束的FR3‑CDR3‑FR4肽。

[0270] 如本文所用，抗原结合片段或抗原结合结构域一般将包含至少一个可变域。可变域可以具有任何尺寸或氨基酸组成并且通常将包含与一个或多个框架序列毗邻或符合可读框的至少一个CDR。在具有与VL结构域缔合的VH结构域的抗原结合片段中，VH和VL结构域可以按任何合适的排列彼此相对设置。例如，可变区可以是二聚体并含有VH‑VH、VH‑VL或VL‑VL二聚体。可选地，抗原结合结构域可以含有单体性VH或VL结构域。

[0271] 在一个给定的抗体的轻链可变区或重链可变区氨基酸序列中，各CDR的精确氨基酸序列边界可以使用许多公知的抗体CDR指派系统的任一种或其组合确定，所述指派系统包括例如：基于抗体的三维结构和CDR环的拓扑学的Chothia，基于抗体序列可变性的Kabat(Kabat,E.,et al.,U.S.Department of Health and Human Services,Sequences of Proteins of Immunological Interest,(1983)，AbM(University of Bath)，Contact(University College London)，国际Immuno GeneTics database(IMGT)，EU编号系统，以及基于loop结构位置的Chothia定义。

[0272] 应理解，本发明中的CDR的精确氨基酸序列边界可以任选地利用上述提及的不同指派系统定义。优选地，除非另有说明，否则在本发明中，当提及抗体可变区中的残基位置(包括重链可变区残基和轻链可变区残基)时，是指根据Kabat编号系统的编号位置。

[0273] 抗体

[0274] 如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL)，另一端有恒定区；轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对，轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。

[0275] 如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈β‑折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91‑3242,卷I，647‑669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

[0276] 本发明不仅包括完整的单克隆抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

[0277] 如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

[0278] 脊椎动物抗体(免疫球蛋白)的“轻链”可根据其恒定区的氨基酸序列归为明显不同的两类(称为κ和λ)中的一类。根据其重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分为不同的种类。主要有5类免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中一些还可进一步分成亚类(同种型)，如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。对应于不同类免疫球蛋白的重链恒定区分别称为α、δ、ε、γ、和μ。不同类免疫球蛋白的亚单位结构和三维构型是本领域人员所熟知的。

[0279] 本发明还提供了其他多肽，如包含人抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

[0280] 在本发明中，本发明抗体还包括其保守性变异体，指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表A进行氨基酸替换而产生。

[0281] 表A

[0282]

[0283]

[0284] 嵌合抗原受体(CAR)

[0285] 如本文所用，术语“本发明的嵌合抗原受体”、“本发明的CAR”可以互换使用，指本发明的第三方面所述的嵌合抗原受体。

[0286] 本发明的嵌合抗原受体(CAR)包括细胞外结构域、跨膜结构域、和细胞内结构域。胞外结构域包括靶‑特异性结合元件(也称为抗原结合结构域)。细胞内结构域包括共刺激信号传导区和ζ链部分。共刺激信号传导区指包括共刺激分子的细胞内结构域的一部分。共刺激分子为淋巴细胞对抗原的有效应答所需要的细胞表面分子，而不是抗原受体或它们的配体。

[0287] 在CAR的胞外结构域和跨膜结构域之间，或在CAR的胞浆结构域和跨膜结构域之间，可并入接头。如本文所用，术语“接头”通常指起到将跨膜结构域连接至多肽链的胞外结构域或胞浆结构域作用的任何寡肽或多肽。接头可包括0‑300个氨基酸，优选地2至100个氨基酸和最优选地3至50个氨基酸。

[0288] 在本发明的一个较佳的实施方式中，本发明提供的CAR的胞外结构域包括靶向5T4的抗原结合结构域。本发明的CAR当在T细胞中表达时，能够基于抗原结合特异性进行抗原识别。当其结合其关联抗原时，影响肿瘤细胞，导致肿瘤细胞不生长、被促使死亡或以其他方式被影响，并导致患者的肿瘤负荷缩小或消除。抗原结合结构域优选与来自共刺激分子和ζ链中的一个或多个的细胞内结构域融合。优选地，抗原结合结构域与4‑1BB信号传导结构域、和CD3ζ信号结构域组合的细胞内结构域融合。

[0289] 如本文所用，“抗原结合结构域”“单链抗体片段”均指具有抗原结合活性的Fab片段，Fab’片段，F(ab’)2片段，或单一Fv片段。Fv抗体含有抗体重链可变区、轻链可变区，但没有恒定区，并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的，Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头，且能够形成抗原结合所需的结构。抗原结合结构域通常是scFv(single‑chain variable fragment)。scFv的大小一般是一个完整抗体的1/6。单链抗体优选是由一条核苷酸链编码的一条氨基酸链序列。作为本发明的优选方式，所述scFv包含特异性识别5T4细胞外区域的抗体，尤其是特异性识别5T4序列的第24至41位氨基酸残基的抗体，较佳地为单链抗体。

[0290] 对于铰链区和跨膜区(跨膜结构域)，CAR可被设计以包括融合至CAR的胞外结构域的跨膜结构域。在一个实施方式中，使用天然与CAR中的结构域之一相关联的跨膜结构域。在一些例子中，可选择跨膜结构域，或通过氨基酸置换进行修饰，以避免将这样的结构域结合至相同或不同的表面膜蛋白的跨膜结构域，从而最小化与受体复合物的其他成员的相互作用。

[0291] 优选的，本发明的CAR的结构包括信号肽、抗原识别序列(抗原结合结构域)、连接区、跨膜区、共刺激因子信号区和CD3zeta信号传导区(ζ链部分)，连接顺序如下：

[0292] L‑scFv‑H‑TM‑C‑CD3ζ(I)

[0293] NK细胞

[0294] 自然杀伤(NK)细胞是一类主要的免疫效应细胞，通过非抗原特异性途径去保护机体免受病毒感染和肿瘤细胞侵袭。近年来，NK细胞在过继性细胞免疫治疗中表现出极大的应用前景。NK的来源广泛，包括外周血、脐带血、胚胎干细胞(ESC)、诱导多能干细胞(iPSC)等。

[0295] NK‑92细胞是一株白细胞介素‑2(IL2)依赖型NK细胞株，从一位患有急性非霍奇金淋巴瘤的50岁男性患者的外周血单核细胞衍生而来。NK‑92细胞是目前唯一被FDA批准的临床试验的NK细胞系，这株细胞的细胞毒性很强、经济、off‑the‑shelf、容易规模化制备，杀伤肿瘤细胞后生存时间短，体外易于扩增，绝大多数接受治疗的患者没有对NK‑92细胞产生排斥，没有移植物抗宿主反应的危险，不表达KIRs，处于组成型激活状态，到目前为止表现出很好的临床安全性。

[0296] 如本文所用，术语“CAR‑NK细胞”、“CAR‑NK”、“CARNK”、“本发明CAR‑NK细胞”均指表达本发明第一方面的嵌合抗原受体CAR的CAR‑NK细胞

[0297] 载体

[0298] 编码期望分子的核酸序列可利用在本领域中已知的重组方法获得，诸如例如通过从表达基因的细胞中筛选文库，通过从已知包括该基因的载体中得到该基因，或通过利用标准的技术，从包含该基因的细胞和组织中直接分离。可选地，感兴趣的基因可被合成生产。

[0299] 本发明也提供了其中插入本发明的表达盒的载体。源于逆转录病毒诸如慢病毒的载体是实现长期基因转移的合适工具，因为它们允许转基因长期、稳定的整合并且其在子细胞中增殖。慢病毒载体具有超过源自致癌逆转录病毒诸如鼠科白血病病毒的载体的优点，因为它们可转导非增殖的细胞，诸如肝细胞。它们也具有低免疫原性的优点。

[0300] 简单概括，通常可操作地连接本发明的表达盒或核酸序列至启动子，并将其并入表达载体。该载体适合于复制和整合真核细胞。典型的克隆载体包含可用于调节期望核酸序列表达的转录和翻译终止子、初始序列和启动子。

[0301] 本发明的表达构建体也可利用标准的基因传递方案，用于核酸免疫和基因疗法。基因传递的方法在本领域中是已知的。见例如美国专利号5,399,346、5,580,859、5,589,
466，在此通过引用全文并入。在另一个实施方式中，本发明提供了基因疗法载体。

[0302] 该核酸可被克隆入许多类型的载体。例如，该核酸可被克隆入如此载体，其包括但不限于质粒、噬菌粒、噬菌体衍生物、动物病毒和粘粒。特定的感兴趣载体包括表达载体、复制载体、探针产生载体和测序载体。

[0303] 进一步地，表达载体可以以病毒载体形式提供给细胞。病毒载体技术在本领域中是公知的并在例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)和其他病毒学和分子生物学手册中进行了描述。可用作载体的病毒包括但不限于逆转录病毒、腺病毒、腺伴随病毒、疱疹病毒和慢病毒。通常，合适的载体包含在至少一种有机体中起作用的复制起点、启动子序列、方便的限制酶位点和一个或多个可选择的标记(例如，WO01/96584；WO01/29058；和美国专利号6,326,193)。

[0304] 已经开发许多基于病毒的系统，用于将基因转移入哺乳动物细胞。例如，逆转录病毒提供了用于基因传递系统的方便的平台。可利用在本领域中已知的技术将选择的基因插入载体并包装入逆转录病毒颗粒。该重组病毒可随后被分离和传递至体内或离体的对象细胞。许多逆转录病毒系统在本领域中是已知的。在一些实施方式中，使用腺病毒载体。许多腺病毒载体在本领域中是已知的。在一个实施方式中，使用慢病毒载体。

[0305] 额外的启动子元件，例如增强子，可以调节转录开始的频率。通常地，这些位于起始位点上游的30‑110bp区域中，尽管最近已经显示许多启动子也包含起始位点下游的功能元件。启动子元件之间的间隔经常是柔性的，以便当元件相对于另一个被倒置或移动时，保持启动子功能。在胸苷激酶(tk)启动子中，启动子元件之间的间隔可被增加隔开50bp，活性才开始下降。取决于启动子，表现出单个元件可合作或独立地起作用，以起动转录。

[0306] 合适的启动子的一个例子为即时早期巨细胞病毒(CMV)启动子序列。该启动子序列为能够驱动可操作地连接至其上的任何多核苷酸序列高水平表达的强组成型启动子序列。合适的启动子的另一个例子为延伸生长因子‑1α(EF‑1α)。然而，也可使用其他组成型启动子序列，包括但不限于类人猿病毒40(SV40)早期启动子、小鼠乳癌病毒(MMTV)、人免疫缺陷病毒(HIV)长末端重复(LTR)启动子、MoMuLV启动子、鸟类白血病病毒启动子、艾伯斯坦‑巴尔(Epstein‑Barr)病毒即时早期启动子、鲁斯氏肉瘤病毒启动子、以及人基因启动子，诸如但不限于肌动蛋白启动子、肌球蛋白启动子、血红素启动子和肌酸激酶启动子。进一步地，本发明不应被限于组成型启动子的应用。诱导型启动子也被考虑为本发明的一部分。诱导型启动子的使用提供了分子开关，其能够当这样的表达是期望的时，打开可操作地连接诱导型启动子的多核苷酸序列的表达，或当表达是不期望的时关闭表达。诱导型启动子的例子包括但不限于金属硫蛋白启动子、糖皮质激素启动子、孕酮启动子和四环素启动子。

[0307] 为了评估CAR多肽或其部分的表达，被引入细胞的表达载体也可包含可选择的标记基因或报道基因中的任一个或两者，以便于从通过病毒载体寻求被转染或感染的细胞群中鉴定和选择表达细胞。在其他方面，可选择的标记可被携带在单独一段DNA上并用于共转染程序。可选择的标记和报道基因两者的侧翼都可具有适当的调节序列，以便能够在宿主细胞中表达。有用的可选择标记包括例如抗生素抗性基因，诸如neo等等。

[0308] 报道基因用于鉴定潜在转染的细胞并用于评价调节序列的功能性。通常地，报道基因为以下基因：其不存在于受体有机体或组织或由受体有机体或组织进行表达，并且其编码多肽，该多肽的表达由一些可容易检测的性质例如酶活性清楚表示。在DNA已经被引入受体细胞后，报道基因的表达在合适的时间下进行测定。合适的报道基因可包括编码荧光素酶、β‑半乳糖苷酶、氯霉素乙酰转移酶、分泌型碱性磷酸酶或绿色萤光蛋白的基因(例如，Ui‑Tei等，2000FEBS Letters479:79‑82)。合适的表达系统是公知的并可利用已知技术制备或从商业上获得。通常，显示最高水平的报道基因表达的具有最少5个侧翼区的构建体被鉴定为启动子。这样的启动子区可被连接至报道基因并用于评价试剂调节启动子‑驱动转录的能力。

[0309] 将基因引入细胞和将基因表达入细胞的方法在本领域中是已知的。在表达载体的内容中，载体可通过在本领域中的任何方法容易地引入宿主细胞，例如，哺乳动物、细菌、酵母或昆虫细胞。例如，表达载体可通过物理、化学或生物学手段转移入宿主细胞。

[0310] 将多核苷酸引入宿主细胞的物理方法包括磷酸钙沉淀、脂质转染法、粒子轰击、微注射、电穿孔等等。生产包括载体和/或外源核酸的细胞的方法在本领域中是公知的。见例如Sambrook等(2001,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Laboratory,New York)。将多核苷酸引入宿主细胞的优选方法为磷酸钙转染。

[0311] 将感兴趣的多核苷酸引入宿主细胞的生物学方法包括使用DNA和RNA载体。病毒载体，特别是逆转录病毒载体，已经成为最广泛使用的将基因插入哺乳动物例如人细胞的方法。其他病毒载体可源自慢病毒、痘病毒、单纯疱疹病毒I、腺病毒和腺伴随病毒等等。见例如美国专利号5,350,674和5,585,362。

[0312] 将多核苷酸引入宿主细胞的化学手段包括胶体分散系统，诸如大分子复合物、纳米胶囊、微球、珠；和基于脂质的系统，包括水包油乳剂、胶束、混合胶束和脂质体。用作体外和体内传递工具(delivery vehicle)的示例性胶体系统为脂质体(例如，人造膜囊)。

[0313] 在使用非病毒传递系统的情况下，示例性传递工具为脂质体。考虑使用脂质制剂，以将核酸引入宿主细胞(体外、离体(ex vivo)或体内)。在另一方面，该核酸可与脂质相关联。与脂质相关联的核酸可被封装入脂质体的水性内部中，散布在脂质体的脂双层内，经与脂质体和寡核苷酸两者都相关联的连接分子附接至脂质体，陷入脂质体，与脂质体复合，分散在包含脂质的溶液中，与脂质混合，与脂质联合，作为悬浮液包含在脂质中，包含在胶束中或与胶束复合，或以其他方式与脂质相关联。与组合物相关联的脂质、脂质/DNA或脂质/表达载体不限于溶液中的任何具体结构。例如，它们可存在于双分子层结构中，作为胶束或具有“坍缩的(collapsed)”结构。它们也可简单地被散布在溶液中，可能形成大小或形状不均一的聚集体。脂质为脂肪物质，其可为天然发生或合成的脂质。例如，脂质包括脂肪小滴，其天然发生在细胞质以及包含长链脂肪族烃和它们的衍生物诸如脂肪酸、醇类、胺类、氨基醇类和醛类的该类化合物中。

[0314] 在本发明的一个优选地实施方式中，所述载体为逆转录病毒载体。

[0315] 治疗性应用

[0316] 本发明包括用编码本发明抗体、CAR的逆转录病毒载体(RV)转导的细胞(例如，NK细胞、T细胞等)。转导的NK细胞可引起CAR‑介导的NK‑细胞或T细胞应答。

[0317] 因此，本发明也提供了刺激对哺乳动物的靶细胞群或组织的NK细胞‑介导的免疫应答的方法，其包括以下步骤：施用给哺乳动物表达本发明CAR的NK细胞。

[0318] 在一个实施方式中，本发明包括一类细胞疗法，其中NK细胞被基因修饰以表达本发明的CAR，和CAR‑NK细胞被注入需要其的接受者中。注入的细胞能够杀死接受者的肿瘤细胞。不像抗体疗法，CAR‑NK细胞能够在体内存续，产生可导致持续肿瘤控制的长期持久性。

[0319] 可治疗的癌症包括没有被血管化或基本上还没有被血管化的肿瘤，以及血管化的肿瘤。癌症可包括非实体瘤(诸如血液学肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)或可包括实体瘤。用本发明的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，和某些白血病或淋巴恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤、和恶性瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。也包括成人肿瘤/癌症和儿童肿瘤/癌症。

[0320] 血液学癌症为血液或骨髓的癌症。血液学(或血原性)癌症的例子包括白血病，包括急性白血病(诸如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞性、前髓细胞性、粒‑单核细胞型、单核细胞性和红白血病)、慢性白血病(诸如慢性髓细胞(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金氏疾病、非霍奇金氏淋巴瘤(无痛和高等级形式)、多发性骨髓瘤、瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、多毛细胞白血病和脊髓发育不良。

[0321] 实体瘤为通常不包含囊肿或液体区的组织的异常肿块。实体瘤可为良性或恶性的。不同类型的实体瘤以形成它们的细胞类型命名(诸如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤诸如肉瘤和癌的例子包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤间皮瘤、淋巴恶性肿瘤、胰腺癌卵巢癌。

[0322] 本发明的CAR‑修饰NK细胞也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地，哺乳动物为人。

[0323] 药物组合物

[0324] 本发明的抗体、融合蛋白、或CAR‑修饰的NK细胞可被单独施用或作为药物组合物与稀释剂和/或与其他组分诸如IL‑2、IL‑15、IL‑18、IL‑21或其他细胞因子或细胞群结合施用。简单地说，本发明的药物组合物可包括如本文所述的靶细胞群，与一种或多种药学或生理学上可接受载体、稀释剂或赋形剂结合。这样的组合物可包括缓冲液诸如中性缓冲盐水、硫酸盐缓冲盐水等等；碳水化合物诸如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸诸如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂诸如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)；和防腐剂。本发明的组合物优选配制用于静脉内施用。

[0325] 本发明的药物组合物可以以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定，如患者的病症、和患者疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。

[0326] 当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤‑抑制有效量”或“治疗量”时，待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定，其考虑患者(对象)的年龄、重量、肿瘤大小、感染或转移程度和病症的个体差异。可通常指出：包括本文描述的T细胞的药物组合物4 9 5 6
可以以10至10个细胞/kg体重的剂量，优选10至10个细胞/kg体重的剂量(包括那些范围内的所有整数值)施用。T细胞组合物也可以以这些剂量多次施用。细胞可通过使用免疫疗法中公知的注入技术(见例如Rosenberg等，NewEng.J.of Med.319:1676，1988)施用。对于具体患者的最佳剂量和治疗方案可通过监测患者的疾病迹象并因此调节治疗由医学领域技术人员容易地确定。

[0327] 本发明的主要优点包括

[0328] (1)本发明的嵌合抗原受体，其细胞外抗原结合结构域为特定的抗5T4 scFv，该特定的抗5T4 scFv结合特定的铰链区和胞内结构域，形成的CAR显示出了极大的对肿瘤细胞的杀伤能力，而且细胞毒性较小，副作用低。

[0329] (2)本发明的CAR‑NK细胞具有较高的活化程度，对5T4阳性的靶细胞具有优异的细胞毒性。

[0330] (3)本发明的5T4抗体表现出优异的结合能力，并进行了免疫染色的方法开发，可在大量组织样本上进行免疫染色检测，保证其特异性。

[0331] (4)本发明的嵌合抗原受体可以通过基因编辑等方式，插入到iPSCs的可编辑位点，进而将编辑后的iPSCs分化为NK，获得的NK携带编辑的特征并具备相应功能。

[0332] 下面结合具体实施例，进一步陈述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

[0333] 实施例1抗5T4抗体针对不同细胞的EC50结果

[0334] 利用5T4抗原对人源化小鼠免疫，通过Beacon对单个B细胞进行鉴定和测序，将相应的序列转入CHO细胞并进行蛋白表达，对获得的抗体纯化鉴定后进行流式筛选和检测，最后得到本发明涉及的4条抗体:BC‑B25A01(Ab01)、BC‑B33E03(Ab02)、BC‑B33E7A(Ab03)、BC‑B33CJC(Ab04)。这些抗体具有亲和力高、特异性强等特点。检测了这些抗体在5T4阳性肿瘤细胞SKOV3和NCI‑H1975上的半最大效应浓度EC50，并以A1抗体(Ab05,5T4‑PF06263507,EP3130356A1)为阳性对照，操作过程如下：

[0335] 1.抗体稀释，先将抗体10倍稀释，抗体二次稀释至20μg/mL2倍倍比稀释，10个梯度，4℃备用。

[0336] 2.细胞铺板，准备细胞，复苏后用PBS重悬至细胞密度为1×105/30μL，按30μL/孔转移至96孔圆底板中。

[0337] 3.按照规划取30μL抗体加入到细胞中，轻拍版边缘，4℃孵育30min，抗体最高工作浓度为20ug/mL。

[0338] 4.孵育结束后每孔加入200μL PBS洗涤，离心弃上清。

[0339] 5.除NC孔外每孔加入50μL 1：100稀释的R‑Phycoerythrin AffiniPure F(ab‘)2Fragment Goat Anti‑Human IgG,Fcγfragment specific，4℃孵育15min。

[0340] 6.孵育结束后每孔加入200μL PBS洗涤两遍，离心弃上清。

[0341] 7.每孔加入50μL PBS和0.5μL的7‑AAD死活染料重悬，孵育10min，上机检测。

[0342] 8.基于原始数据，采用FlowJo V10分析并导出不同浓度梯度抗体与细胞结合的MFI(Geom.Mean)。将MFI导入GraphPad Prism 7.00，对MFI和抗体浓度进行转换和拟合。先采用Transfrom分析将X轴(抗体浓度)转换为log(X)，即将Log(抗体浓度)作为横坐标，MFI作为纵坐标，再采用log(agonist)vs.response‑‑Variable slope(four parameters)分析最终拟合得出EC50值。

[0343] 结果表明，本发明的4条抗体均表现出优异的结合特性(图1)，其中BC‑B33CJC表现最优，最大MFI及EC50都优于A1。

[0344] 实施例2 5T4抗体亲和力检测

[0345] 1.打开操作软件确认仪器(Biacore 8k)状态良好。

[0346] 2.配制10×HBS‑EP+缓冲液，调pH值为7.4，以10×HBS‑EP+为母液配制1×HBS‑EP+缓冲液，调整pH值为7.4，配制Glycine再生液，调pH为2.0。

[0347] 3.取出浸泡在1×HBS‑EP+7.4缓冲液中的Protein A‑47芯片，经超纯水冲洗干净后风干，置入仪器并冲洗管路。

[0348] 4.将纯化抗体稀释至1ug/ml，抗原稀释至200nM，0nM为参比。

[0349] 5.使用Protein A‑47芯片在10uL/min的流速下捕获1μg/mL抗体50s，记录其响应值RU，按照目标捕获量进行二次稀释，令上机检测捕获值(目标捕获值)为50RU。

[0350] 6.根据既定参数编写上样程序，将样品、试剂放入软件所示指定孔位，使用Protein A‑47芯片在10uL/min的流速下捕获抗体50s，再以30uL/min的流速使抗体与抗原结合180s，解离400s,得到结合曲线。

[0351] 7.通过分析软件进行数据分析，使用1:1binding结合模型对结合、解离曲线进行拟合，获得亲和力动力学数据。

[0352] 结果表明，本发明的4条抗体对人5T4抗原均表现出优异的结合特性，KD值(M)为1.0E‑7～2.0E‑9(图2)，其中BC‑B33CJC(33CJC)、BC‑B33E03显著优于对照抗体A1。

[0353] 实施例3 5T4‑CAR结构设计

[0354] 5T4 CAR结构的scFv分别命名为BC‑B25A01、BC‑B33E03、BC‑B33E7A、BC‑B33CJC。5T4 CAR的结构如图3所示，包括信号肽(signal peptide)、scFv、Hinge区域、跨膜结构域(transmembrane,TM)、共刺激结构域(costimulatory domain,CD)和CD3ζ结构域，相应的CAR结构克隆至pMSCV载体上。其中信号肽可以选自以下序列(表1)。本发明中使用CD8αSP信号肽构建5T4 CAR结构。

[0355] 本发明的数据基于CD8αSP、CD28hinge、CD28TM以及CD28CD的5T4 CAR结构。其中，scFv可以由VL‑Linker‑VH或者VH‑Linker‑VL构成，其中linker可以是(G4S)3或(G4S)4等；VL、VH及相应的CDR1、CDR2、CDR3序列见表2、表3、表4。

[0356] 完整的CAR结构序列见表2。

[0357] 表1.信号肽序列

[0358]信号肽 序列 SEQ ID No:
IL‑21SP MRSSPGNMERIVICLMVIFLGTLV 9
CD8αSP MALPVTALLLPLALLLHAARP 10
CSF2SP MWLQSLLLLGTVACSIS 11
DAP12SP MGGLEPCSRLLLLPLLLAVSG 12
CD16SP MWQLLLPTALLLLVSA 13
CD56SP MLQTKDLIWTLFFLGTAVS 14
IL‑8SP MTSKLAVALLAAFLISAALC 15

[0359] 表2. 5T4 CAR的VL和VH序列

[0360]

[0361]

[0362]

[0363] 注：SEQ:SEQ ID NO.

[0364] BC‑B33E03轻链可变区(VL)、BC‑B33E7A轻链可变区(VL)、BC‑B33CJC轻链可变区(VL)相同(即SEQ ID NO.4、6、8相同)。

[0365] 表3.基于Kabat的CDR序列

[0366]

[0367] 注：SEQ:SEQ ID NO.

[0368] 表4.基于Chothia的CDR序列

[0369]

[0370] 注：SEQ:SEQ ID NO.

[0371] 实施例4肿瘤细胞表面5T4表达的检测

[0372] 发明人用流式检测了NCI‑H460、NCI‑H1975、SKOV3、NCI‑H226、A549、BxPC3、MDA‑MB‑231和MDA‑MB‑468肿瘤细胞表面5T4的表达情况，检测方法如下。

[0373] 2.1取1E5‑2E5待测肿瘤细胞，200g‑400g，4℃离心5min，弃掉上清。

[0374] 2.2加入200ul FACS Buffer(1％ FBS溶于PBS)，200g‑400g，4℃离心5min，弃上清。

[0375] 2.3加入100ul一抗(Invitrogen，MA5‑24229)，吹打混匀，4℃孵育30min‑60min。

[0376] 2.4孵育完成后，加入200ul/well FACS Buffer，200g‑400g，4℃离心5min，弃掉上清.

[0377] 2.5重复step4一次。

[0378] 2.6洗完后，加入100ul二抗(Jackson immunoresearch，115‑116‑072)吹打混匀，4℃孵育30min‑60min。

[0379] 2.7孵育完成后，加入200ul/well FACS Buffer，200g‑400g，4℃离心5min，弃掉上清。

[0380] 2.8重复step4两次。

[0381] 2.9洗完后，加入200ul/well FACS Buffer重悬，上流式仪检测。

[0382] 结果表明NCI‑H460不表达或低表达5T4，而其他几种细胞均有不同程度的5T4表达(图4)。

[0383] 实施例5.病毒包装及NK92细胞感染

[0384] 逆转录病毒的包装载体分别为BaEV、pCMV‑gag‑pol由本实验室设计后交于金唯智合成、抽提。病毒包装、细胞感染及分选过程如下：

[0385] 5.1将状态良好的HEK‑293T细胞消化后重悬于相应培养基中，以7‑8E5/ml的密度接种于10cm的培养皿中；

[0386] 5.2置于培养箱培养16h后，观察细胞密度，当密度为90％左右时开始进行质粒转染；

[0387] 5.3取2个1.5ml离心管，分别加入500ul Opti‑MEMTM I减血清培养基(Gibco,31985062)，在其中一个离心管中加入7.5ug BaEV、10ug pCMV‑gag‑pol以及20ug相应的表达CAR的pMSCV载体；在另一个离心管中加入40ul PEIpro溶液(polyplus,115‑010)；

[0388] 5.4将两个离心管的溶液轻轻混匀，室温放置15‑20min后形成转染复合物；

[0389] 5.5将上述转染复合物轻轻滴加至HEK‑293T培养上清中，置于培养基继续培养4‑6h；

[0390] 5.6更换预热的新鲜培养基，将细胞置于培养箱中继续培养48h；

[0391] 5.7收集细胞培养上清，利用Lenti‑X Concentrator(Takara,631232)对病毒进行浓缩；

[0392] 5.8用100ul培养基将病毒重悬，取4E5 NK92细胞于6孔板中，分别加入10ul病毒浓缩液，并添加终浓度为5ug/ml的polybrene；

[0393] 5.9将细胞在32℃，800g的条件下离心1h，随后置于培养箱过夜培养；

[0394] 5.10将细胞更换新鲜的培养基，继续培养3‑5天后进行流式检测。

[0395] 5.11培养中的5T4‑CAR NK92细胞吹吸数次使其分散为单个细胞，取200μL至1.5ml离心管中，用于NC‑200细胞计数。

[0396] 5.12取1E7待分选细胞于离心管中，300g离心5min，弃上清。

[0397] 5.13用10mL MACS Buffer(或PBS)重悬细胞，300g离心5min，弃上清。

[0398] 5.14用2mL 3ug/mL Unconjugated Human TPBG/5T4 Protein,His,AvitagTM(ACRO，TPG‑H52E5)稀释液(稀释于PBS)重悬细胞，4℃孵育30min。

[0399] 5.15孵育完成后，加入适量的MACS Buffer,300g离心5min，弃上清。

[0400] 5.16加入5mL MACS Buffer再洗一次。

[0401] 5.17加入80uL(80uL/1E7cells)MACS Buffer重悬细胞。

[0402] 5.18加入20μL(20μL/1E7cells)Anti‑Biotin MicroBeads(Order no.:130‑090‑485)。

[0403] 5.19混匀后4℃孵育15min。

[0404] 5.20孵育完成后，加入2mL(2mL/1E7cells)MACS Buffer洗一次。

[0405] 5.21 500uL MACS Buffer重悬(500uL buffer per 1E8 cells)。

[0406] 5.22将吸附柱LS装载在磁力架上，用3mL的MACS Buffer润洗柱子。

[0407] 5.23将处理好的细胞加到柱中。

[0408] 5.24加3mL MACS Buffer于柱中，未被磁吸的细胞被洗脱流出。

[0409] 5.25重复step3两次。

[0410] 5.26 3次洗脱完成后，取一个15mL离心管，将柱子从磁力架上取下，置于离心管上。

[0411] 5.27向柱中加入5mL MACS Buffer，将柱塞推入柱中，冲洗出被磁珠标记的细胞。

[0412] 5.28取适量分选得到的细胞进行NC‑200计数。

[0413] 5.29分选得到的细胞300g离心5min，弃上清。

[0414] 5.30用适量体积的完全培养基重悬，置于37℃，5％ CO2培养箱培养。

[0415] 流式结果表明(图5)，感染病毒后，各组NK92细胞5T4‑CAR的表达介于50％到85％，经过磁珠分选后，各组的阳性率基本一致，达到了98％以上。

[0416] 实施例6.检测5T4‑CAR NK92结合靶细胞的亲和力

[0417] 利用z‑Movi细胞亲和力分析仪对5T4‑CAR NK92结合靶细胞的亲和力(强度)进行了检测，检测流程如下，

[0418] 6.1靶细胞为过表达人5T4的HEK293T细胞(HEK293T‑h5T4)，在使用前，确保其处于健康状态。

[0419] 6.2Z‑Movi检测前一天，使用PBS1:5稀释Poly‑L‑Lysine(多聚左旋赖氨酸，Sigma‑Aldrich,P4707,0.01％)。加入200uL稀释后的Poly‑L‑Lysine，拉注射器，使其充满观察室并注意排出气泡，室温放置15分钟。随后抽出全部多聚赖氨酸溶液，并通过快速推动注射器去除观察室内的气泡，将芯片37℃烘箱烘干过夜。

[0420] 6.3Z‑Movi上机当天，取出z‑Movi实验所需培养基(DMEM+10％ FBS)，充分预热，组装芯片，向进样室中加入100uL预热的PBS溶液，拉注射器，使进样室中剩余10uL液体，关闭阀门，确认观察室中没有气泡。向进样室中加入100uL预热的靶细胞培养基，拉注射器，使进样室中剩余10uL液体，关闭阀门，确认观察室中没有气泡。

[0421] 6.4取出靶细胞，使用TrypLETM Select Enzyme(Gibco,12563029)消化细胞，计数之后确认细胞活率在95％以上，用培养基重悬为6E7/mL于1.5ml离心管中。

[0422] 6.5将芯片安装在z‑Movi仪器上，打开软件，进入monolayer test模式，将靶细胞充分吹吸，避免细胞聚集，然后向进样室中加入20uL细胞悬液，缓慢打开阀门。此时可以观察到有细胞流入观察室。关阀之后，调节焦平面，观察细胞贴壁后的覆盖情况，要求覆盖率在90％‑105％之间。

[0423] 6.6关闭阀门之后，缓慢吸出进样室中的细胞至剩余约5uL，使用3x200uL靶细胞培养基进行清洗。向进样室中加入300uL靶细胞培养基，将芯片放入37度烘箱进行细胞贴壁3小时。

[0424] 6.7在靶细胞贴壁2小时时开始进行效应细胞(5T4CAR NK92)染色。效应细胞染色TM使用CellTrace 远红外细胞增殖试剂盒(Invitrogen,C34564)。效应细胞计数，并按照6E6/mL密度，每个run使用效应细胞20uL，进行效应细胞取用。

[0425] 6.8细胞离心之后使用等体积PBS溶液洗一次，按1：1000配制Far Red in PBS染色缓冲液，使用染色缓冲液重悬细胞为1E6/mL，37℃避光染色20分钟。染色结束后，加入5倍染色缓冲液体积的培养基，孵育5分钟。离心之后，按照6E6/mL密度重悬细胞。

[0426] 6.9靶细胞贴壁结束后，安装检测芯片，使用monolayer test模块检测单层细胞贴壁效果。施加力之后打开阀门，冲走结合不牢固的靶细胞

[0427] 6.10加入染色的效应细胞，缓慢打开阀门，使效应细胞充入。打开荧光通道，观察效应细胞密度，合适之后关闭阀门，点击程序中的开始孵育。缓慢吸出进样室中的细胞至剩余约5uL，使用3x200uL靶细胞培养基进行清洗。关闭上盖，等待程序自动完成孵育、加力和数据记录。记录完成之后，根据机器提示进行再次加力，并打开阀门使用培养基进行冲洗，确保流过约50‑100uL培养基。开始下一个run。

[0428] 检测结果表明(图6)，NK92细胞在施加力之后，快速的从靶细胞上脱落，而表达5T4CAR的NK92细胞结合靶细胞的强度明显强于NK92细胞，其中，本发明涉及的CJC、E03、E7A、A01 5T4 CAR和靶细胞的亲和力强于对照组A1。综合性能比较如下：5T4 CAR‑CJC＞5T4 CAR‑E03，5T4 CAR‑E7A＞5T4 CAR‑A01。

[0429] 实施例7.检测5T4‑CAR NK92对多种靶细胞的杀伤能力

[0430] 用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，Real Time Cellular Analysis)检测了5T4‑CAR NK92对SKOV3靶细胞的杀伤能力，具体操作步骤如下，

[0431] 7.1提前24小时将NK92培养基中的IL‑2撤掉。

[0432] 7.2取出RTCA E96 Plate，每孔加入50uL对应的培养基，在RTCA程序中新建实验，完成实验相关设定，将E‑plate放入之后锁定，仪器自动进行基线测定，基线测定一般在一分钟内完成。

[0433] 7.3消化SKOV3靶细胞，按照2E4/孔的量接种于E‑plate中。

[0434] 7.4接种之后，室温放置30分钟，将E‑plate放入记录槽内，15分钟扫描一次记录细胞生长情况。

[0435] 7.5观察靶细胞电阻状况，在达到平台期前后补充5T4‑CAR NK92效应细胞。

[0436] 7.6按照实验设定效靶比(E:T)加入靶细胞，将E‑plate放置在板位上，10分钟后开始杀伤步骤的记录。

[0437] 7.7在第1轮杀伤5‑8小时后准备多轮靶细胞刺激，处理SKOV3靶细胞，添加2E4靶细胞，将E‑plate放置在板位上，10分钟后开始杀伤步骤的记录。

[0438] 结果表明(图7A)，在效靶比为1：1和3：1的条件下，和NK92细胞相比，各组5T4‑CAR NK92均能对SKOV3靶细胞表现出更明显的细胞毒性。在第一轮杀伤结束后，各组5T4‑CAR NK92对继续加入的SKOV3靶细胞仍能表现出优越的细胞毒性。

[0439] 利用类似的方法还检测了5T4‑CAR NK92对BxPC3(图7B)、A549(图7C)及MDA‑MB‑468(图7D)等靶细胞的杀伤能力，结果表明5T4‑CAR NK92对这些5T4阳性的靶细胞均能表现出强大的杀伤能力。

[0440] 实施例8.原代NK细胞的分离鉴定

[0441] 为了进一步在原代NK上验证5T4‑CAR的功能，从人外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell,PBMC)中利用NK细胞分离试剂盒(NK Cell Isolation Kit human，Cat：130‑092‑657，Miltenyi)分离了NK细胞，分离步骤如下，

[0442] 8.1用MACS Buffer重悬细胞，每107PBMC对应40μL MACS Buffer。

[0443] 8.2每107个PBMC加入10μL NK Cell Biotin‑Antibody Cocktail。

[0444] 8.3混合均匀，在冰箱(2℃‑8℃)中孵育5min。

[0445] 8.4每107个PBMC加入30μL MACS Buffer。

[0446] 8.5每107个PBMC加入20μL NK Cell MicroBead Cocktail。

[0447] 8.6混合均匀，在冰箱(2℃‑8℃)中孵育10min。

[0448] 8.7将吸附柱装载在磁力架上，用3mL的MACS Buffer润洗柱子。

[0449] 8.8将孵育结束的细胞转移至吸附柱上，收集流出的细胞。

[0450] 8.9用3mL的MACS Buffer洗柱子一次，同样收集流出的细胞。

[0451] 8.10将收集的细胞300g离心5min，弃上清。用3mL培养基重悬细胞。

[0452] 经过培养扩增后，对所获得的NK细胞进行鉴定。鉴定结果如图8所示。结果表明，通+ +过分离及扩增培养可以获得CD3CD56大于95％的NK细胞群体。

[0453] 实施例9.病毒感染原代NK细胞

[0454] 病毒生产过程及感染原代NK的步骤如前所述，在感染48小时后，用流式对各组5T4‑CAR表达情况进行了检测，图9的结果表明各组5T4‑CAR的感染效率介于53％‑85％。

[0455] 实施例10.检测5T4‑CAR NK对靶细胞的杀伤能力

[0456] 用实时无标记动态细胞分析技术(RTCA，Real Time Cellular Analysis)检测了5T4‑CAR NK对SKOV3及NCI‑H460靶细胞的杀伤能力，利用空白NK细胞将各组的5T4‑CAR阳性率调整一致(53.659％)，其余步骤参考前述操作。

[0457] 结果表明(图10)，在效靶比为1：1和3：1的条件下，和NK细胞相比，各组5T4‑CAR NK均能对SKOV3靶细胞表现出更明显的细胞毒性。由于NCI‑H460低表达5T4，和NK细胞相比，各组5T4‑CAR NK只能对其表现出微弱的细胞毒性。

[0458] 实施例11.5T4抗体免疫染色方法开发

[0459] 鉴于BC‑B33CJC的优异表现，进一步用BC‑B33CJC进行了免疫组化方法开发。为了最大化的和本发明的CAR结构相似，从而更准确的反映其性能。此外构建了CJC‑scFv‑mouse IgG1‑Fc形式的抗体，并通过以下步骤分别对54T阳性和阴性切片进行免疫组化染色。

[0460] 11.1将4μm切片60℃过夜，脱蜡水化：依次浸泡二甲苯I‑二甲苯II‑100％乙醇I‑100％乙醇II‑95％乙醇‑85％乙醇‑75％乙醇‑去离子水,各5min；

[0461] 11.2抗原修复：配制1x抗原修复液于Pt module中98℃孵育20min,室温冷却30min；PBST洗3min*3；

[0462] 11.3将切片置于100ul血清封闭液中室温静置孵育10min,PBST洗3min*3；

[0463] 11.4加一抗(1.48mg/ml,1:25稀释)4℃过夜静置孵育，PBST洗3min*3；

[0464] 11.5复温30min，将切片置于100ul过氧化物酶阻断剂中孵育15min,PBST洗3min*3；

[0465] 11.6加二抗(稀释比1:2000)室温静置孵育1h,PBST洗3min*3；

[0466] 11.7加30ul DAB Chromogen至1.5mL DAB Substrate中混匀加到组织切片上室温静置孵育5min，自来水流水冲洗；

[0467] 11.8苏木素复染3min，1％盐酸乙醇分化1‑3s，返蓝液返蓝5min；

[0468] 11.9梯度酒精脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。

[0469] 结果表明(图11)，针对5T4阳性的PDX样本LD1‑0025‑200636(RNA TPM:147)，CJC‑scFv‑mouse IgG1‑Fc表现出特异的膜阳性染色信号；而针对5T4阴性的PDX样本LD1‑0032‑361649(RNA TPM:0)，CJC‑scFv‑mouse IgG1‑Fc不会产生染色信号。同时，以mIgG作为系统阴性对照，对5T4阳性的PDX样本LD1‑0025‑200636(RNA TPM:147)也不会产生染色信号。以上数据说明，CJC‑scFv‑mouse IgG1‑Fc可以在免疫组化染色中特异的检测出肿瘤组织表面的5T4抗原。

[0470] 在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。