PGAM2变位酶及其在心肌细胞中的应用

摘要

本发明属于生物医药技术领域，涉及PGAM2变位酶及其在心肌细胞中的应用，PGAM2核酸序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1。本发明还探究了Ang II诱导的心肌细胞肥大的关键分子和信号通路，对于阐明心肌细胞肥大发生的内在机制意义重大。本发明提出了PGAM2在心肌细胞中的新功能，并且以PGAM2为研究对象，合成PGAM2的干扰小片段siRNA，转染心肌细胞，发现敲低PGAM2能够显著抑制心肌细胞肥大。基于PGAM2在心肌肥厚中的重要功能，其抑制剂或者siRNA将为临床预防或治疗心肌肥厚相关疾病提供新靶标。

权利要求

1.抑制PGAM2变位酶的siRNA在制备调控血管紧张素II诱导的心肌细胞肥大药物中的应用，其特征在于，靶向序列如SEQ ID No.1所示的PGAM2的siRNA序列如下：S1 靶序列：

CCAGGGAAAGGCAAAGTGAS2 靶序列：

CCATCATGGAACTGAATCT。

说明书

PGAM2变位酶及其在心肌细胞中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药技术领域，特别涉及一种PGAM2变位酶及其在心肌细胞中的应用。

背景技术

[0002] 心力衰竭（heart failure，HF），简称心衰，是指各种原因导致心脏泵血功能受损，心排血量不能满足全身组织基本代谢需要的综合征，主要表现为呼吸困难、活动受限、体液潴留等。目前，临床对于心衰的治疗仍缺乏有效策略。心衰是一种进展性的疾病，重在预防，将心衰防控的关口前移，将为临床心衰的预防和治疗提供重要思路。心肌肥厚是心衰发生的病理基础,是一种产生较缓慢但较有效的代偿功能，主要发生在长期压力负荷过重的情况下，心肌总量增加，收缩力加强，使心脏得以维持正常的血循环，同时有相当的储备力。但这种代偿功能也有其不利之处，主要因为肥大的心肌需氧增加，而冠状动脉的供血量往往不能予以满足，造成心肌缺血，这将最后导致心肌收缩力的减退。心肌肥厚的发病机理极为复杂，具体机制仍不明确。目前发现关键基因治疗具有重要意义，如利用AAV9将特定功能性基因递送到心肌细胞中发挥抗心肌肥大的功效。因此发现调控心肌肥厚的特异分子及信号通路，对于阐明心肌肥厚发生发展的内在机制，寻找防控心衰的新靶点具有十分重要的理论和临床意义。

[0003] 磷酸甘油酸变位酶肌肉特异性的亚基M型（PGAM2）是糖酵解途径的重要酶类，催化3‑磷酸甘油酸（3‑PG）转化为2‑磷酸甘油酸（2‑PG）的可逆反应。最近研究发现，PGAM2可在氧化应激条件下被激活，参与调控肿瘤细胞增殖，说明PGAM2不仅具有催化功能，还具有重要的调控功能，PGAM2主要在骨骼肌和心肌中表达。最近研究发现过表达PGAM2的小鼠中的糖酵解和三羧酸循环改变，从而更早的诱导心肌收缩功能受损，心脏对于压力负荷的耐受力下降。但PGAM2是否参与心肌细胞肥大的调控尚不清楚。

[0004] 热休克蛋白（HSPs）是普遍存在并高度保守的蛋白，能够被多种病理和环境刺激所诱导。HSP90是心肌细胞中含量最高的蛋白之一。HSP90在多种心肌肥厚模型和心衰患者中的表达增加，HSP90的抑制剂17‑AAG能够抑制心肌肥厚相关的纤维化，提示抑制HSP90在改善心肌肥厚中起到重要作用。目前，PGAM2是否通过调控HSP90的表达，来干预心肌肥厚，未见报道。

发明内容

[0005] 为了研究调控心肌肥厚的作用靶点及特异分子，阐明心肌肥厚发生发展的内在机制，本发明提出PGAM2变位酶及其在心肌细胞中的应用。

[0006] 本发明是通过如下技术方案实现的：

[0007] 第一方面，本发明提供了一种PGAM2变位酶， PGAM2变位酶核酸序列为核苷酸序列表中的SEQ ID No.1。

[0008] 第二方面，本发明提供了PGAM2变位酶在心肌细胞中的应用。

[0009] 此外，本发明运用IP、质谱分析，WB实验，qRT‑PCR以及后期实验进一步的分析证实，敲低PGAM2的表达能够显著改善血管紧张素II（Ang II）诱导的心肌肥厚。更具体的说，敲低PGAM2显著抑制血管紧张素 II诱导的心肌细胞肥大标志蛋白ANP、BNP以及β‑MHC的表达。其中所用的引物如下：

[0010] Hsp90AA1‑rat‑F 5’‑ CCAAGGACCAGGTTGCTAACTCA‑3’

[0011] Hsp90AA1‑rat‑R 5’‑ GACACCAAGGTCTTGCCCTCA‑ 3’

[0012] actin‑rat‑F    5’‑ CGTTGACATCCGTAAAGACC ‑3’

[0013] actin‑rat‑R    5’‑TAGAGCCACCAATCCACACA‑3’

[0014] nANP‑rat‑F     5’‑CCGGTACCGAAGATAACAGC‑3’

[0015] nANP‑rat‑R     5’‑CTCCAGGAGGGTATTCACCA‑3’

[0016] nBNP‑rat‑F     5’‑TCCTTAATCTGTCGCCGCTG‑3’

[0017] nBNP‑rat‑R     5’‑GGGCCTTGGTCCTTTGAGAG‑3’

[0018] β‑MHC‑rat‑F    5’‑ CGCTCAGTCATGGCGGAT‑3’

[0019] β‑MHC‑rat‑R    5’‑GCCCCAAATGCAGCCAT‑3’

[0020] PGAM2‑rat‑F    5’‑GTCCTTATTGCAGCCCATGG‑3’

[0021] PGAM2‑rat‑R    5’‑ACCCACTCTCACTTTGCCTT‑3’。

[0022] 第三方面，本发明的另一目的在于提供抑制PGAM2的小干扰RNA片段siRNA，靶向PGAM2的siRNA序列如下：

[0023] S1 靶序列：

[0024] CCAGGGAAAGGCAAAGTGA

[0025] S2 靶序列：CCATCATGGAACTGAATCT。

[0026] 与现有技术相比，本发明的优点和积极效果在于：

[0027] （1）本发明探究了Ang II诱导的心肌细胞肥大的关键分子和信号通路，对于阐明心肌细胞肥大发生的内在机制意义重大。本发明提出了PGAM2在心肌细胞中的新功能，并且以PGAM2为研究对象，合成PGAM2的干扰小片段siRNA，转染心肌细胞，发现敲低PGAM2能够显著抑制心肌细胞肥大。

[0028] （2）通过IP结合高分辨质谱，本发明找到PGAM2与心肌肥厚的负调控蛋白HSP90互作，并且调控HSP90的蛋白表达水平。本发明验证干扰PGAM2后，能够通过抑制HSP90的表达，达到抗心肌细胞肥大的目的。当敲低PGAM2，同时过表达HSP90则能够逆转敲低PGAM2对于心肌肥厚的影响，表明HSP90在心肌细胞中是PGAM2的一个重要功能靶标，PGAM2可通过HSP90来调节心肌细胞的功能。对于研究Ang II诱导的心肌细胞肥大具有很好的应用价值。

[0029] （3）基于PGAM2在心肌肥厚中的重要功能，其抑制剂或者siRNA将为临床预防或治疗心肌肥厚相关疾病提供新靶标。

附图说明

[0030] 图1. PGAM2在Ang II诱导的心肌细胞肥大及抑制心肌肥大后的表达情况。（A）蛋白免疫印迹实验检测不同浓度Ang II处理后，PGAM2的表达；（B）不同浓度Ang II处理后，PGAM2的表达量化图；（C）免疫荧光检测Ang II处理后PGAM2的分布及表达；（D）在心肌细胞肥大抑制剂脂联素处理后，PGAM2的表达下调。

[0031] 图2. 利用siRNA敲低PGAM2后显著抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。（A）qRT‑PCR检测siRNA介导的PGAM2的敲低效率检测；（B‑C）敲低PGAM2显著抑制Ang II诱导的心肌肥大标志蛋白ANP、BNP的表达。

[0032] 图3. PGAM2与HSP90互作并影响HSP90的蛋白水平。（A）Co‑IP检测PGAM2与HSP90的互作；（B）PLA技术检测PGAM2和HSP90的互作；（C）Western blot结果显示敲低PGAM2显著抑制HSP90的蛋白水平。

[0033] 图4. PGAM2通过HSP90调控Ang II诱导的心肌细胞肥大。在不同处理条件下，检测心肌肥大标志物（A）ANP和（B）BNP的表达水平。

具体实施方式

实施例1

[0034] 原代新生大鼠心肌细胞的分离提取：出生2‑3 d的Wistar乳鼠的心肌细胞，由北京维通利华公司提供，所用培养基为DMEM培养基。

[0035] (1)在无菌超净台中，取乳鼠的心室肌，采用II型胶原酶进行消化，在培养瓶中进5
行差速贴壁法，收集心肌细胞，按5×10 个细胞/ml的密度接种于培养板中，加入BRDU培养三天，去除成纤维细胞。

[0036] (2)弃上清，重新加入新鲜培养基，于37℃、5％CO2培养箱中静置培养24 h。实施例2

[0037] 心肌细胞的转染：

[0038] 转染步骤参照Invitrogen公司的转染试剂脂质体2000（Lipofectamine 2000）的试剂盒说明书进行，将相应的siRNA转染入心肌细胞。

[0039] 转染后，心肌细胞在培养箱中继续培养4‑6小时，换新鲜培养液，48 h后裂解细胞提取蛋白或RNA用于后续实验。实施例3

[0040] qRT‑PCR实验：

[0041] (1)冷PBS清洗贴壁细胞2～3次，吸弃PBS。加入1 mL的Trizol裂解液，裂解细胞，并转移到1.5 mL的无RNA酶的离心管中。

[0042] (2)每管加入200μL氯仿(Trizol组织液:氯仿为5：1)，剧烈震荡15～30 s，冰上静置5 min后，12000 rpm，4 ℃，离心15 min。静置后，小心吸取上层无色液相(避免触及中间相)。将上层液相(300μL)移入新的1.5 mL 离心管中，加入等量异丙醇溶液，轻轻上下颠倒摇匀10次，冰上静置10 min。然后在12000 rpm，4 ℃条件下，离心15 min。

[0043] (3)弃上清，加入预冷的1 mL的75％乙醇洗涤RNA沉淀，然后在4 ℃离心机12000 rpm，离心5 min后去上清，并重复洗RNA沉淀一次。

[0044] (4)将液体吸干，室温自然干燥5～10 min，同时避免RNA沉淀干燥过度。

[0045] (5)根据沉淀量，加入20μL的DEPC水以溶解RNA沉淀。超微量分光光度计测定RNA浓度和纯度。

[0046] qRT‑PCR采用Thermo公司的2×实时定量PCR扩增的预混合溶液（SYBR Green qRT‑‑△△CtPCR Master Mix(2X)，ROX Solution provided Mix）。以2 法计算mRNA与miRNA的相对表达量。

[0047] 所用到的qRT‑PCR引物为如下：

[0048] PGAM2‑rat‑F    5’‑GTCCTTATTGCAGCCCATGG‑3’

[0049] PGAM2‑rat‑R    5’‑ACCCACTCTCACTTTGCCTT‑3’

[0050] Hsp90AA1‑rat‑F 5’‑ CCAAGGACCAGGTTGCTAACTCA‑3’

[0051] Hsp90AA1‑rat‑R 5’‑ GACACCAAGGTCTTGCCCTCA‑ 3’

[0052] actin‑rat‑F    5’‑ CGTTGACATCCGTAAAGACC ‑3’

[0053] actin‑rat‑R    5’‑TAGAGCCACCAATCCACACA‑3’

[0054] nANP‑rat‑F     5’‑CCGGTACCGAAGATAACAGC‑3’

[0055] nANP‑rat‑R     5’‑CTCCAGGAGGGTATTCACCA‑3’

[0056] nBNP‑rat‑F     5’‑TCCTTAATCTGTCGCCGCTG‑3’

[0057] nBNP‑rat‑R     5’‑GGGCCTTGGTCCTTTGAGAG‑3’

[0058] β‑MHC‑rat‑F    5’‑ CGCTCAGTCATGGCGGAT‑3’

[0059] β‑MHC‑rat‑R    5’‑GCCCCAAATGCAGCCAT‑3’。

[0060] 实施例4

[0061] 免疫共沉淀实验

[0062] 具体操作步骤如下：

[0063] （1）将转染后或药物处理后的细胞，加入300 μl细胞裂解缓冲液RIPA（含蛋白酶抑制剂），冰上裂解30 min，细胞裂解液于4 ℃，12000 rpm，离心10 min后取上清；

[0064] （2）取50 μl裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液按1:100稀释比加入相应的抗体，于4 ℃冷库缓慢摇晃孵育过夜；

[0065] （3）取10 μl 蛋白A+G琼脂糖珠，用500 μl裂解缓冲液洗3次，每次3,000 rpm离心3 min；

[0066] （4）将预处理过的10 μl 蛋白 A+G琼脂糖珠加入到和抗体孵育过夜的细胞裂解液中，4 ℃冷库缓慢摇晃孵育4 h，使抗体与蛋白A+G琼脂糖珠偶连；

[0067] （5）免疫沉淀反应后，在4 ℃以3,000 rpm离心3 min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，琼脂糖珠用1 ml裂解缓冲液洗3 次；最后按相应稀释比例加入5 × SDS上样缓冲液，沸水煮10 min；

[0068] （6）SDS‑PAGE跑胶分析结合蛋白。

[0069] 实施例5

[0070] PLA实验

[0071] 按照Sigma‑Aldrich公司说明书开展实验。

[0072] 1.封闭：向每个样本中加入封闭液200 μL，室温封闭45 min。

[0073] 2.一抗孵育

[0074] 去除封闭液，用常规的抗体稀释液稀释抗体，分别加入PGAM2（兔来源，1:500稀释）和HSP90（鼠源，1:200稀释）的抗体，在湿盒中4℃孵育过夜。

[0075] 3. PLA探针孵育：使用与一抗相同的稀释液或者使用Duolink原位抗体稀释液。

[0076] ①按照1：5的比例混合和稀释连接二抗的PLA探针MINUS和PLUS，室温下静置20分钟（例如40μl反应液体系中，分别加入8μl MINUS和8μl PLUS PLA探针，以及24 μl抗体稀释液）。

[0077] ②去除抗体稀释液。

[0078] ③用洗涤缓冲液TBST洗片。

[0079] ④加入已稀释的PLA探针溶液。

[0080] ⑤预热的湿盒中于37℃孵育1h。

[0081] 4. 连接反应

[0082] ①用超纯水按照1：5比例稀释连接反应储液并混匀。

[0083] ②去除PLA探针溶液。

[0084] ③洗片：1×的洗涤缓冲液A洗片两次，每次5min。

[0085] ④从冰箱中取出连接酶，冰上放置。

[0086] ⑤将连接酶加入步骤①的连接缓冲液中，以1 : 40稀释并涡旋，然后加入样本中。

[0087] ⑥将玻片在湿盒中37 ℃孵育30 min。

[0088] 5. 扩增：避光进行。

[0089] ①用超纯水按照1：5比例稀释扩增储液并混匀。

[0090] ②去除连接反应‑连接酶溶液。

[0091] ③洗片：用1×的洗涤缓冲液A洗片两次，每次2 min。最后一次洗涤后，去除所有的洗涤液。

[0092] ④将聚合酶从冰箱中取出，冰上放置。将聚合酶加进步骤①的扩增液中，以1:80稀释并涡旋。

[0093] ⑤将扩增聚合酶溶液添加到每个样品中。

[0094] ⑥湿盒中37 ℃孵育100 min。

[0095] 6. 清洗步骤：避光进行。

[0096] ①去除上述扩增聚合酶溶液。

[0097] ②在1×洗涤缓冲液B中清洗玻片2 × 10min。

[0098] ③用0.01×清洗缓冲液B清洗载玻片1min。

[0099] ④让切片在室温下于黑暗中干燥。

[0100] 7.成像准备

[0101] 加入5 μl含有DAPI的Duolink原位试剂（Duolink In Situ Mounting Medium），用盖玻片封片，确保没有气泡。指甲油密封边缘。等待15分钟，然后在荧光显微镜或共聚焦显微镜下分析，使用至少20倍物镜。成像后，将载玻片保存在‑20℃避光保存。

[0102] 结果分析：

[0103] 本发明首先通过试验确定PGAM2表达与心肌细胞肥大之间的关系

[0104] 1. 在心肌细胞肥大过程中PGAM2表达显著上调，抑制心肌细胞肥大PGAM2的表达显著下调。

[0105] 本发明采用原代培养的新生Wistar大鼠的心肌细胞，利用Ang II处理48小时诱导心肌肥大，Western blot及免疫荧光检测PGAM2的表达和分布，发现在PGAM2的表达显著上调。qRT‑PCR结果显示在心肌肥厚抑制剂脂联素的处理下，Ang II诱导的PGAM2的上调表达被抑制（图1）。

[0106] 2. 沉默PGAM2的表达，显著抑制Ang II诱导的心肌细胞肥大。

[0107] 本发明采用靶向PGAM2的siRNA（S1、S2序列）转染原代心肌细胞，qRT‑PCR结果显示，S1和S2两段siRNA均能有效敲低PGAM2的表达（图2A）。沉默PGAM2的表达显著抑制心肌肥厚标志蛋白ANP、BNP的表达，提示PGAM2在心肌肥厚中发挥关键作用（图2B‑C）。

[0108] 3. PGAM2与心肌肥厚相关蛋白HSP90发生互作并调控后者的蛋白水平

[0109] 本发明运用免疫共沉淀（IP）结合高分辨质谱分析，筛选到与PGAM2发生互作且参与心肌肥厚调节的关键蛋白HSP90（图3A）。通过PLA技术（邻位连接技术），进一步阐明两者的相互作用（图3B）。Western blot结果显示，沉默PGAM2显著抑制HSP90的蛋白水平，提示二者之间存在重要的调控关系（图3C）。

[0110] 4. PGAM2通过HSP90调控心肌细胞肥大

[0111] 为了进一步阐释HSP90是否介导PGAM2对于心肌细胞肥大的作用，本发明运用腺病毒载体过表达技术结合RNAi沉默技术，探讨PGAM2是否通过HSP90调控心肌细胞肥大。qRT‑PCR结果显示，Ang II刺激后显著诱导心肌细胞肥大标志基因ANP、BNP的上调，敲低PGAM2抑制Ang II的促心肌肥大效应，而在敲低PGAM2同时过表达HSP90组，逆转了PGAM2沉默对于心肌肥大的保护作用，说明PGAM2通过HSP90参与心肌肥大的调控。

[0112] 因此，以上结果表明PGAM2是Ang II诱导心肌肥大的关键基因，敲低PGAM2的表达显著抑制心肌肥大。PGAM2可通过心肌肥大相关基因HSP90发挥作用，进而影响Ang II诱导心肌肥大的进程。因此，PGAM2基因可作为药物靶点，用于筛选防治心肌肥大疾病的药物；PGAM2基因也可作为基因治疗的靶基因，设计并制备防治心肌肥大的药物及生物学试剂（如siRNA），通过基因工程技术达到预防、改善或治疗心肌肥厚的目的。