快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法及相应质粒

摘要

本发明涉及快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法及相应质粒。该方法包括构建质粒骨架pLevoB1，合成目的mRNA基因片段并添加酶切位点，将目的mRNA基因片段插入质粒骨架pLevoB1中，即得到多聚腺苷酸polyA质粒成品，用作目标mRNA的模板质粒DNA。本发明能稳定、高效地为目的mRNA基因片段添加多聚腺苷酸polyA序列，且提高了正确克隆比例，所得多聚腺苷酸polyA质粒成品可用作目标mRNA的模板质粒DNA；还能便捷地更换线性化位点或增加多聚腺苷酸polyA序列。

权利要求

1.快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法，其特征是，包括以下步骤：

第一步、构建质粒骨架pLevoB1；所述质粒骨架pLevoB1的序列结构从5’端至3’端依次为：第一多克隆位点区域序列‑多聚腺苷酸polyA序列‑质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列‑启动子序列‑抗性基因序列‑第一过渡连接序列‑pUC复制起始位点序列‑第二过渡连接序列；

所述第一多克隆位点区域序列含有一组酶切位点，用于通过酶切连接或通过Golden Gate克隆法插入目的mRNA基因片段；所述第一多克隆位点区域序列如SEQ ID NO.1所示；

所述多聚腺苷酸polyA序列由预定数量的腺苷酸构成，所述预定数量的取值范围为80‑

150bp；

所述质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列从5’端至3’端依次含有线性化位点以及一个酶切位点，用于将质粒经酶切线性化后作为IVT反应模板；所述线性化位点与各酶切位点均不相同；所述质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列如SEQ ID NO.3所示；

第二步、合成目的mRNA基因片段；在目的mRNA基因片段的5’端添加与第一多克隆位点区域序列中一酶切位点相对应的酶切位点，并在目的mRNA基因片段的3’端添加与第一多克隆位点区域序列中另一酶切位点相对应的酶切位点；

其中，所述目的mRNA基因片段的序列结构从5’端至3’端依次为：启动子序列‑5’端UTR序列‑Kozak序列‑开放阅读框序列‑3’端UTR序列；添加酶切位点时，在启动子序列的5’端添加酶切位点，并在3’端UTR序列的3’端添加酶切位点；

第三步、通过酶切连接或通过Golden Gate克隆法，将第二步所得目的mRNA基因片段插入质粒骨架pLevoB1的第一多克隆位点区域序列中，即得到多聚腺苷酸polyA质粒成品。

2.质粒骨架pLevoB1，其特征是，所述质粒骨架pLevoB1由权利要求1所述快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法的第一步构建获得。

3.多聚腺苷酸polyA质粒，其特征是，所述多聚腺苷酸polyA质粒由权利要求1所述快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法构建获得。

4.权利要求3所述多聚腺苷酸polyA质粒用于作为目标mRNA的模板质粒DNA的应用。

5.含有权利要求2所述质粒骨架pLevoB1或权利要求3所述多聚腺苷酸polyA质粒的宿主细胞。

说明书

快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法及相应质粒

技术领域

[0001] 本发明涉及快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法及相应质粒，属于生物技术领域。

背景技术

[0002] mRNA技术作为一种极具潜力的通用技术平台，不仅应用于疫苗开发，在传染病的预防、肿瘤治疗、蛋白替代（罕见病疗法）、CAR‑T、基因编辑等基因治疗领域也有巨大的应用潜力。目前体外转录（IVT）制备mRNA使用的模板质粒DNA分成两类，其主要区别是在开放阅读框3'末端有无多聚腺苷酸polyA序列，含有多聚腺苷酸polyA序列的质粒DNA能控制mRNA的3'末端多聚腺苷酸polyA序列的长度，提高mRNA的均质性。目前常规合成多聚腺苷酸polyA序列的现有技术方案成功率低、稳定性差，无法满足批量合成需求，因此亟待研发出能快速构建含有多聚腺苷酸polyA高稳定性质粒的方法，能提高质粒DNA构建的成功率，缩短合成周期，适合进行批量实验。

发明内容

[0003] 本发明的主要目的是：克服现有基因合成技术中合成多聚腺苷酸polyA序列成功率低、稳定性差和周期长的问题，提供一种快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法，能稳定、高效地为目的mRNA基因片段添加多聚腺苷酸polyA序列，并能便捷地更换线性化位点或增加多聚腺苷酸polyA序列。同时还提供相应的质粒。

[0004] 本发明解决其技术问题的技术方案如下：

[0005] 快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法，包括以下步骤：

[0006] 第一步、构建质粒骨架pLevoB1；所述质粒骨架pLevoB1的序列结构从5’端至3’端依次为：第一多克隆位点区域序列‑多聚腺苷酸polyA序列‑质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列‑启动子序列‑抗性基因序列‑第一过渡连接序列‑pUC复制起始位点序列‑第二过渡连接序列。

[0007] 所述第一多克隆位点区域序列含有一组酶切位点，用于通过酶切连接或通过Golden Gate克隆法插入目的mRNA基因片段；所述多聚腺苷酸polyA序列由预定数量的腺苷酸构成；所述质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列从5’端至3’端依次含有线性化位点以及至少一个酶切位点，用于将质粒经酶切线性化后作为IVT反应模板、或用于更换线性化位点、或用于增加多聚腺苷酸polyA序列的长度；所述线性化位点与各酶切位点均不相同。

[0008] 第二步、合成目的mRNA基因片段；在目的mRNA基因片段的5’端添加与第一多克隆位点区域序列中一酶切位点相对应的酶切位点，并在目的mRNA基因片段的3’端添加与第一多克隆位点区域序列中另一酶切位点相对应的酶切位点。

[0009] 第三步、通过酶切连接或通过Golden Gate克隆法，将第二步所得目的mRNA基因片段插入质粒骨架pLevoB1的第一多克隆位点区域序列中，即得到多聚腺苷酸polyA质粒成品。

[0010] 该方法中通过利用专门设计的质粒骨架pLevoB1，可以稳定且高效地构建得到多聚腺苷酸polyA质粒，用作目标mRNA的模板质粒DNA，且相比于现有技术提高了正确克隆比例；该多聚腺苷酸polyA质粒中含有由预定数量的腺苷酸构成多聚腺苷酸polyA序列。同时，可根据实际需求，快速更换线性化位点、或增加多聚腺苷酸polyA序列的长度。

[0011] 优选地，所述第一多克隆位点区域序列的酶切位点为非平末端的限制性内切酶位点；所述非平末端的限制性内切酶位点选自EcoRI位点、HindIII位点、XhoI位点、BamHI位点、SphI位点、PstI位点、KpnI位点、SacI位点、SalI位点、PciI位点；所述第一多克隆位点区域序列中最靠近多聚腺苷酸polyA序列的酶切位点为IIS型限制性内切酶位点；所述IIS型限制性内切酶位点选自BsaI位点、BbsI位点、BsmBI位点、BspQI位点、SapI位点、PaqCI位点、Esp3I位点。

[0012] 更优选地，所述第一多克隆位点区域序列如SEQ ID NO.1所示。

[0013] 优选地，在多聚腺苷酸polyA序列中，所述预定数量的取值范围为70‑200bp。

[0014] 优选地，在质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列中，所述线性化位点为IIS型限制性内切酶位点；所述IIS型限制性内切酶位点选自BsaI位点、BbsI位点、BsmBI位点、BspQI位点、SapI位点、PaqCI位点、Esp3I位点；所述酶切位点为非平末端的限制性内切酶位点，且与第一多克隆位点区域序列的酶切位点不同；所述非平末端的限制性内切酶位点选自EcoRI位点、HindIII位点、XhoI位点、BamHI位点、SphI位点、PstI位点、KpnI位点、SacI位点、SalI位点、PciI位点。

[0015] 更优选地，所述质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列如SEQ ID NO.3所示。

[0016] 优选地，第二步还包括：针对第一步所得质粒骨架pLevoB1，通过引物退火连接的方式更换线性化位点或增加多聚腺苷酸polyA序列的长度。

[0017] 优选地，第二步中，所述目的mRNA基因片段的序列结构从5’端至3’端依次为：启动子序列‑5’端UTR序列‑Kozak序列‑开放阅读框序列‑3’端UTR序列；添加酶切位点时，在启动子序列的5’端添加酶切位点，并在3’端UTR序列的3’端添加酶切位点。

[0018] 本发明还提供：

[0019] 质粒骨架pLevoB1，所述质粒骨架pLevoB1由前文所述快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法的第一步构建获得。

[0020] 多聚腺苷酸polyA质粒，所述多聚腺苷酸polyA质粒由前文所述快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法构建获得。

[0021] 前文所述多聚腺苷酸polyA质粒用于作为目标mRNA的模板质粒DNA的应用。

[0022] 含有前文所述质粒骨架pLevoB1或前文所述多聚腺苷酸polyA质粒的宿主细胞。

[0023] 与现有技术相比，本发明能稳定、高效地为目的mRNA基因片段添加多聚腺苷酸polyA序列，且提高了正确克隆比例，所得多聚腺苷酸polyA质粒成品可用作目标mRNA的模板质粒DNA；本发明还能便捷地更换线性化位点或增加多聚腺苷酸polyA序列。

附图说明

[0024] 图1为本发明实施例1中质粒骨架pLevoB1的图谱。

[0025] 图2为本发明实施例2中不同长度多聚腺苷酸polyA的质粒DNA正确比例示意图。

具体实施方式

[0026] 本发明具体实施的快速构建多聚腺苷酸polyA质粒的方法，包括以下步骤：

[0027] 第一步、构建质粒骨架pLevoB1；

[0028] 质粒骨架pLevoB1的序列结构从5’端至3’端依次为：第一多克隆位点区域序列‑多聚腺苷酸polyA序列‑质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列‑启动子序列‑抗性基因序列‑第一过渡连接序列‑pUC复制起始位点序列‑第二过渡连接序列；

[0029] 第一多克隆位点区域序列含有一组酶切位点，用于通过酶切连接或通过Golden Gate克隆法插入目的mRNA基因片段；多聚腺苷酸polyA序列由预定数量的腺苷酸构成；质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列从5’端至3’端依次含有线性化位点以及至少一个酶切位点，用于将质粒经酶切线性化后作为IVT反应模板、或用于更换线性化位点、或用于增加多聚腺苷酸polyA序列的长度；线性化位点与各酶切位点均不相同（既不同于第一多克隆位点区域序列的酶切位点，也不同于质粒线性化位点及第二多克隆位点区域序列的酶切位点）。

[0030] 具体而言，（1）第一多克隆位点区域（记作MCS1）序列的酶切位点任选非平末端的限制性内切酶位点。具体可以选用如EcoRI位点（g^aattc）、HindIII位点（a^agctt）、XhoI位点（c^tcgag）、BamHI位点（g^gatcc）、SphI位点（gcatg^c）、PstI位点（ctgca^g）、KpnI位点（ggtac^c）、SacI位点（gagct^c）、SalI位点（g^tcgac）、PciI位点（a^catgt）等。^表示酶剪切点。

[0031] 同时，第一多克隆位点区域MCS1序列中最靠近多聚腺苷酸polyA序列的酶切位点优先选择IIS型限制性内切酶位点，如BsaI位点（^gagacc或ggtctc^）、BbsI位点（^gtcttc或gaagac^）、BsmBI位点（^gagacg或cgtctc^）、BspQI位点或SapI位点（^gaagagc或gctcttc^）、PaqCI位点（^gcaggtg或cacctgc^）、Esp3I位点（^gagacg或cgtctc^）等，如此即可避免在构建质粒过程中引入多余碱基。

[0032] 作为一个具体示例，第一多克隆位点区域MCS1的序列如SEQ ID NO.1所示：

[0033] acagg[gagacc][gagctc][ggtacc]tcgcgaatgcatcta[ggatcc]c[gggccc][gtcgac]tgcagaggcctgcatgc[aagctt]gg[ctcgag][ggtctc]gaaaa

[0034] 其中，各括号[ ]内为各个酶切位点，用于向目的mRNA基因片段提供插入位置。自5’端起，第一个酶切位点为IIS型限制性内切酶BsaI位点，序列为^gagacc，并且最后一个酶切位点为IIS型限制性内切酶BsaI位点，序列为ggtctc^。第二个至第八个酶切位点依次为：
SacI位点，序列为gagct^c；KpnI位点，序列为ggtac^c；BamHI位点，序列为g^gatcc；ApaI位点，序列为gggcc^c；SalI位点，序列为g ^ tcgac；HindIII位点，序列为a^agctt；XhoI位点，序列为c^tcgag。^表示酶剪切点。

[0035] （2）作为一个具体示例，长度为80bp的多聚腺苷酸polyA的序列如SEQ ID NO.2所示：

[0036] aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaa

[0037] （3）在质粒线性化位点及第二多克隆位点区域（记作MCS2）序列中：

[0038] 线性化位点优先选择IIS型限制性内切酶位点，可产生5’端突出序列，如BsaI位点（^gagacc或ggtctc^）、BbsI位点（^gtcttc或gaagac^）、BsmBI位点（^gagacg或cgtctc^）、BspQI位点或SapI位点（^gaagagc或gctcttc^）、PaqCI位点（^gcaggtg或cacctgc^）、Esp3I位点（^gagacg或cgtctc^）等。

[0039] 酶切位点任选非平末端的限制性内切酶位点，且与第一多克隆位点区域序列的酶切位点不同。具体可以选用如EcoRI位点（g^aattc）、HindIII位点（a^agctt）、XhoI位点（c^tcgag）、BamHI位点（g^gatcc）、SphI位点（gcatg^c）、PstI位点（ctgca^g）、KpnI位点（ggtac^c）、SacI位点（gagct^c）、SalI位点（g ^ tcgac）、PciI位点（ttaat^taa）等。

[0040] 如此，通过上述线性化位点和酶切位点可在将质粒线性化后，通过引物退火连接方案，增加多聚腺苷酸polyA序列的长度（即增加腺苷酸数量），或更换线性化位点。

[0041] 作为一个具体示例，质粒线性化位点及第二多克隆位点区域MCS2的序列如SEQ ID NO.3所示：

[0042] aaag[gaagagc]ttaattaacatatg[acatgt]c

[0043] 其中，自5’端起，第一个括号[ ]内为线性化位点，采用IIS型限制性内切酶BspQI位点，序列为^gaagagc；第二个括号[ ]内为酶切位点，采用PciI位点，序列为a^catgt。^表示酶剪切点。

[0044] （4）启动子序列、抗性基因序列、pUC复制起始位点序列分别采用现有序列即可。

[0045] 第二步、合成目的mRNA基因片段；在目的mRNA基因片段的5’端添加与第一多克隆位点区域序列中一酶切位点相对应的酶切位点，并在目的mRNA基因片段的3’端添加与第一多克隆位点区域序列中另一酶切位点相对应的酶切位点。

[0046] 具体而言，目的mRNA基因片段的序列结构从5’端至3’端依次为：启动子序列‑5’端UTR序列‑Kozak序列‑开放阅读框序列‑3’端UTR序列；添加酶切位点时，在启动子序列的5’端添加酶切位点，并在3’端UTR序列的3’端添加酶切位点。

[0047] 第三步、通过酶切连接或通过Golden Gate克隆法，将第二步所得目的mRNA基因片段插入质粒骨架pLevoB1的第一多克隆位点区域序列中，即得到多聚腺苷酸polyA质粒成品。

[0048] 下面参照附图并结合实施例对本发明作进一步详细描述。但是本发明不限于所给出的例子。实施例1

[0049] 本实施例为构建质粒骨架pLevoB1的一个具体示例。

[0050] 本实施例要构建的质粒骨架pLevoB1中多聚腺苷酸polyA序列长度为80bp，通过Golden Gate克隆法构建。

[0051] 先将质粒骨架pLevoB1序列划分为3个片段并添加合适的IIS型限制性内切酶：片段A（SEQ ID NO.4）是去除多聚腺苷酸polyA序列的其余序列；片段B（SEQ ID NO.5）和片段C（SEQ ID NO.6）分别包含44bp的多聚腺苷酸polyA序列。

[0052] 片段A序列，SEQ ID NO.4：

[0053] acagggagaccgagctcggtacctcgcgaatgcatctagatatcggatcccgggcccgtcgactgcagaggcctgcatgcaagcttggctcgagggtctcgttgtcttcccaatgaagacttagcttaattaacatatgacatgtctggaacgaaaactcacgttaagggattttggtcgtgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgtgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgccgctgccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatcccagggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatatcgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgaccgcgtatttcgcttggctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaactgataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaactgtcagagcaaggattgaggatctaggtgaagatcctttttgcgcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaaaacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcata

[0054] 片段B序列：SEQ ID NO.5：

[0055] acgaagacttctcgaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaattgtcttcgg[0056] 片段C序列：SEQ ID NO.6：

[0057] acgaagacttaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaggaagagctttgtcttcgg

[0058] 片段A划分成Fragment1、2和3，并利用PCR获得这些片段；再利用单片段无缝克隆试剂盒将这些片段拼接；将拼接产物转化感受态细胞后，以含有相应抗生素的LB平板进行筛选，抗生素与片段A中的抗性基因对应，挑取单克隆，进行测序验证，序列正确者即为目标片段A。

[0059] 之后，将合成的片段B和片段C通过Golden Gate克隆法一步构建进片段A，即得到质粒骨架pLevoB1，其图谱如图1所示。实施例2

[0060] 本实施例为以质粒骨架pLevoB1快速构建多聚腺苷酸polyA质粒，该多聚腺苷酸polyA质粒用作eGFP mRNA的模板质粒DNA。本实施例采用实施例1获得的质粒骨架pLevoB1。

[0061] 首先，合成包含T7 启动子序列、5’端UTR序列、Kozak序列、eGFP开放阅读框序列和3’端UTR序列的eGFP mRNA基因片段（SEQ ID NO.7）；

[0062] 然后，使用PCR的方式在该基因片段的两端添加IIS型限制性内切酶位点（SEQ ID NO.8），该位点不能在eGFP mRNA基因片段中存在。

[0063] 最后，使用Golden Gate克隆法将eGFP mRNA基因片段构建进质粒骨架pLevoB1中，得到多聚腺苷酸polyA质粒成品，即eGFP mRNA的模板质粒DNA（SEQ ID NO.9）。

[0064] eGFP mRNA基因片段序列：SEQ ID NO.7：

[0065] taatacgactcactatagggaaataagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagaccccggcgccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgataataggctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc

[0066] 添加IIS型限制性内切酶位点的eGFP mRNA基因片段序列：SEQ ID NO.8：

[0067] ggtctcgacagtaatacgactcactatagggaaataagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagaccccggcgccgccaccatggtgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtgataataggctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggcaaaaggagacc

[0068] eGFP mRNA的模板质粒DNA序列：SEQ ID NO.9：

[0069] acag[taatacgactcactataggg]aaataagagagaaaagaagagtaagaagaaatataagaccccggc[gccgccaccatgg]tgagcaagggcgaggagctgttcaccggggtggtgcccatcctggtcgagctggacggcgacgtaaacggccacaagttcagcgtgtccggcgagggcgagggcgatgccacctacggcaagctgaccctgaagttcatctgcaccaccggcaagctgcccgtgccctggcccaccctcgtgaccaccctgacctacggcgtgcagtgcttcagccgctaccccgaccacatgaagcagcacgacttcttcaagtccgccatgcccgaaggctacgtccaggagcgcaccatcttcttcaaggacgacggcaactacaagacccgcgccgaggtgaagttcgagggcgacaccctggtgaaccgcatcgagctgaagggcatcgacttcaaggaggacggcaacatcctggggcacaagctggagtacaactacaacagccacaacgtctatatcatggccgacaagcagaagaacggcatcaaggtgaacttcaagatccgccacaacatcgaggacggcagcgtgcagctcgccgaccactaccagcagaacacccccatcggcgacggccccgtgctgctgcccgacaaccactacctgagcacccagtccgccctgagcaaagaccccaacgagaagcgcgatcacatggtcctgctggagttcgtgaccgccgccgggatcactctcggcatggacgagctgtacaagtg[ataataggctggagcctcggtggcctagcttcttgccccttgggcctccccccagcccctcctccccttcctgcacccgtacccccgtggtctttgaataaagtctgagtgggcggc]aaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaaag[gaagagcttaattaacatatgacatgt]ctg[gaacgaaaactcacgttaagggattttggtcgtgaacaataaaactgtctgcttacataaacagtaatacaaggggtgttatgagccatattcaacgggaaacgtcttgctctaggccgcgattaaattccaacatggatgctgatttatatgggtataaatgggctcgtgataatgtcgggcaatcaggtgcgacaatctatcgcttgtatgggaagcccgatgcgccagagttgtttctgaaacatggcaaaggtagcgttgccaatgatgttacagatgagatggtcagactaaactggctgacggaatttatgccgctgccgaccatcaagcattttatccgtactcctgatgatgcatggttactcaccactgcgatcccagggaaaacagcattccaggtattagaagaatatcctgattcaggtgaaaatatcgttgatgcgctggcagtgttcctgcgccggttgcattcgattcctgtttgtaattgtccttttaacagcgaccgcgtatttcgcttggctcaggcgcaatcacgaatgaataacggtttggttgatgcgagtgattttgatgacgagcgtaatggctggcctgttgaacaagtctggaaagaaatgcataaacttttgccattctcaccggattcagtcgtcactcatggtgatttctcacttgataaccttatttttgacgaggggaaactgataggttgtattgatgttggacgagtcggaatcgcagaccgataccaggatcttgccatcctatggaactgcctcggtgagttttctccttcattacagaaacggctttttcaaaaatatggtattgataatcctgatatgaataaattgcagtttcatttgatgctcgatgagtttttctaa]ctgtcagagcaaggattgaggatctaggtgaagatcctttttgcgcgttccactgagcgtcagaccccgtagaaaagatcaaaggatcttc[ttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctgcttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagctaccaactctttttccgaaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttcttctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacctcgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccgggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggggttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctacagcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatccggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaacgcctggtatctttatagtcctgtcgggtttcgccacctctgacttgagcgtcgatttttgtgatgctcgtcaggggggcggagcctatggaaa]aacgccagcaacgcggcctttttacggttcctggccttttgctggccttttgctcata[0070] 该序列自起5’端起，第一个括号[ ]内为T7启动子序列，第一个括号[ ]与第二个括号[ ]之间为5’端UTR序列，第二个括号[ ]内为Kaozak序列，第二个括号[ ]与第三个括号[ ]之间为eGFP开放阅读框序列，第三个括号[ ]内为3’端UTR序列，第三个括号[ ]与第四个括号[ ]之间为多聚腺苷酸polyA序列，第四个括号[ ]内为质粒线性化位点及第二多克隆位点区域MCS2序列，第五个括号[ ]内为质粒骨架的启动子序列和抗性基因序列，第六个括号[ ]内为质粒骨架的pUC复制起始位点序列（也即复制子ori序列）。

[0071] 本实施例方案可使质粒骨架pLevoB1中的多聚腺苷酸polyA序列稳定且高效地连接到目的eGFP mRNA基因片段的3’端。

[0072] 按实施例1及本实施例方案，分别合成含有80bp、100bp、120bp和150bp多聚腺苷酸polyA序列的质粒DNA进行实验，随机选择8个克隆进行Sanger测序验证，虽然得到正确多聚腺苷酸polyA质粒DNA比例逐步降低，但均能在一次实验得到正确的质粒DNA（如图2所示），整个实验最短只需要5天时间。结合以上结果，多聚腺苷酸polyA序列中，腺苷酸的预定数量为70‑200bp或80‑150bp。实施例3

[0073] 本实施例为更换质粒骨架pLevoB1中质粒线性化位点及多克隆位点区域MCS2序列的线性化位点。

[0074] 本实施例基于实施例1。实施例1所得质粒骨架pLevoB1中的线性化位点为BspQI位点（^gaagagc），本实施例将其更换为XbaI位点（t^ctaga）。

[0075] （1）使用限制性内切酶BspQI和限制性内切酶PciI处理，暴露出相关粘性末端。

[0076] （2）采用设计好的退火引物1、退火引物2进行引物退火连接，将XbaI位点序列连接进（1）的产物中，通过T4 DNA连接酶组装得到最终的质粒DNA。

[0077] 退火引物1：SEQ ID NO.10：

[0078] aaatctagattaattaacatatga

[0079] 退火引物2：SEQ ID NO.11：

[0080] catgtcatatgttaattaatctaga

[0081] 经以上述实施例为代表的实践研究验证，本发明具有如下优势：

[0082] 1、本发明可以快速构建多聚腺苷酸polyA质粒，用作目标mRNA的模板质粒DNA，且相比于现有技术提高了正确克隆比例。该多聚腺苷酸polyA质粒中含有由预定数量（70‑200bp或80‑150bp）的腺苷酸构成多聚腺苷酸polyA序列。

[0083] 2、本发明可根据实际需求，快速更换线性化位点、或增加多聚腺苷酸polyA序列的长度。

[0084] 除上述实施例外，本发明还可以有其他实施方式。凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案，均落在本发明要求的保护范围。