一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂盒

摘要

本发明涉及检测试剂盒技术领域，提出了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂盒，包括第一检测试剂条和第二检测试剂条；所述第一检测试剂条为甲型流感病毒和乙型流感病毒抗原检测试剂条；所述第二检测试剂条为呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂条。通过上述技术方案，解决了现有技术中同时检测四种病毒的技术空白的问题。

权利要求

1.一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂盒，其特征在于，包括第一检测试剂条和第二检测试剂条；

所述第一检测试剂条为甲型流感病毒和乙型流感病毒抗原检测试剂条；

所述第二检测试剂条为呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂条；

所述第一检测试剂条包括第一反应垫和第一结合垫；

所述第一反应垫包括甲型流感病毒抗原检测线、乙型流感病毒抗原检测线和第一质控线；所述甲型流感病毒抗原检测线、所述乙型流感病毒抗原检测线的包被液为50mM HEPES缓冲液、1% Tetronic 1307、0.02% BSA；

所述第一结合垫包括胶体金标记甲型流感病毒单克隆抗体和胶体金标记乙型流感病毒单克隆抗体；

所述第二检测试剂条包括第二反应垫和第二结合垫；

所述第二反应垫包括呼吸道合胞病毒抗原检测线、新型冠状病毒抗原检测线和第二质控线；所述呼吸道合胞病毒抗原检测线和所述新型冠状病毒抗原检测线的包被液为TRIS‑HCl缓冲液；

所述第二结合垫包括胶体金标记呼吸道合胞病毒单克隆抗体和胶体金标记新型冠状病毒单克隆抗体；

还包括样本处理液，所述样本处理液包括磷酸盐缓冲液和吐温‑20；所述吐温‑20的质量浓度为0.5%；

还包括样品垫，所述样品垫上添加有鼠IgG阻断剂。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一质控线和第二质控线上均包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述甲型流感病毒抗原检测线上包被有甲型流感病毒单克隆抗体，浓度为0.8‑1.2mg/mL；

所述乙型流感病毒抗原检测线上包被有乙型流感病毒单克隆抗体，浓度为1.0‑1.5mg/mL。

4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述呼吸道合胞病毒抗原检测线上包被有呼吸道合胞病毒单克隆抗体，浓度为1.0‑1.5mg/mL；

所述新型冠状病毒抗原检测线上包被有新型冠状病毒单克隆抗体，浓度为1.2‑1.8mg/mL。

5.根据权利要求2所述的试剂盒，其特征在于，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为

1.0‑1.5mg/mL。

6.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磷酸盐缓冲液的pH为7.4，浓度为

0.1mol/L。

说明书

一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠

状病毒抗原检测试剂盒

技术领域

[0001] 本发明涉及检测试剂盒技术领域，具体的，涉及一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂盒。

背景技术

[0002] 流行性感冒病毒简称流感病毒，是引起流行性感冒的病原体，流行性感冒是由甲（A）、乙（B）、丙（C）三型流感病毒引起的急性呼吸道传染病，它传染性强、传播快、潜伏期短、发病率高。目前感染人的主要是甲型流感病毒中的H1N1、H3N2亚型及乙型流感病毒中的Victoria和Yamagata系，其临床表现以高热、乏力、头痛、咳嗽、全身肌肉酸痛等全身中毒症状为主，而呼吸道症状较轻。

[0003] 呼吸道合胞病毒（RSV）属于副黏病毒科的肺病毒属，只有一种血清型，主要引起6个月以下婴儿患细支气管炎和肺炎等下呼吸道感染，以及较大儿童和成人的鼻炎、感冒等上呼吸道感染。

[0004] 新型冠状病毒是以前从未在人体中发现的冠状病毒，人体感染了以后常见体征有呼吸道症状、发热、咳嗽、气促和呼吸困难等。

[0005] 目前，建立一种快速简便的同时检测甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒的试剂盒对于及时诊治病毒感染尤为重要。

发明内容

[0006] 本发明提出一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂盒，解决了现有技术中同时检测四种病毒的技术空白的问题。

[0007] 本发明的技术方案如下：

[0008] 一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂盒，包括第一检测试剂条和第二检测试剂条；

[0009] 所述第一检测试剂条为甲型流感病毒和乙型流感病毒抗原检测试剂条；

[0010] 所述第二检测试剂条为呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂条。

[0011] 作为进一步的技术方案，所述第一检测试剂条包括第一反应垫和第一结合垫；

[0012] 所述第一反应垫包括甲型流感病毒抗原检测线、乙型流感病毒抗原检测线和第一质控线；所述甲型流感病毒抗原检测线、所述乙型流感病毒抗原检测线的包被液为50mM HEPES缓冲液、1% Tetronic 1307、0.02% BSA；所述第一结合垫包括胶体金标记甲型流感病毒单克隆抗体和胶体金标记乙型流感病毒单克隆抗体。

[0013] 作为进一步的技术方案，所述第二检测试剂条包括第二反应垫和第二结合垫；

[0014] 所述第二反应垫包括呼吸道合胞病毒抗原检测线、新型冠状病毒抗原检测线和第二质控线；

[0015] 所述第二结合垫包括胶体金标记呼吸道合胞病毒单克隆抗体和胶体金标记新型冠状病毒单克隆抗体。

[0016] 作为进一步的技术方案，所述第一质控线和第二质控线上均包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体。

[0017] 其中，甲型流感病毒抗原检测线、乙型流感病毒抗原检测线分别为A线和B线，呼吸道合胞病毒抗原检测线、新型冠状病毒抗原检测线分别为R线和S线，第一质控线和第二质控线均为C线。

[0018] 作为进一步的技术方案，所述甲型流感病毒抗原检测线上包被有甲型流感病毒单克隆抗体，浓度为0.8‑1.2mg/mL，优选的浓度为1.0mg/mL；

[0019] 所述乙型流感病毒抗原检测线上包被有乙型流感病毒单克隆抗体，浓度为1.0‑1.5mg/mL，优选的浓度为1.2mg/mL。

[0020] 作为进一步的技术方案，所述呼吸道合胞病毒抗原检测线上包被有呼吸道合胞病毒单克隆抗体，浓度为1.0‑1.5mg/mL，优选的浓度为1.2mg/mL；

[0021] 所述新型冠状病毒抗原检测线上包被有新型冠状病毒单克隆抗体，浓度为1.2‑1.8mg/mL，优选的浓度为1.5mg/mL。

[0022] 作为进一步的技术方案，所述羊抗鼠IgG多克隆抗体的浓度为1.0‑1.5mg/mL，优选的浓度为1.2mg/mL。

[0023] 作为进一步的技术方案，所述的试剂盒还包括样本处理液，所述样本处理液包括磷酸盐缓冲液和吐温‑20。

[0024] 作为进一步的技术方案，所述磷酸盐缓冲液（PBS溶液）的pH为7.4，浓度为0.1mol/L，所述吐温‑20的质量浓度为0.5%。

[0025] 本发明中选用pH为7.4、浓度为0.1mol/L的PBS溶液和0.5wt%吐温‑20作为样本稀释液的成分，能够避免检测样本时出现假阳性或假阴性的结果，提高检测准确度。

[0026] 作为进一步的技术方案，所述试剂盒还包括样品垫，所述样品垫上添加有鼠IgG阻断剂。

[0027] 本发明中将呼吸道合胞病毒与新型冠状病毒做到一根试剂条上面，且实验过程中发现，在检测时出现假阳情况，在样品垫中添加鼠IgG阻断剂消除了假阳现象，提高检测准确度。

[0028] 本发明的工作原理及有益效果为：

[0029] 本发明提出了一种用于体外定性检测鼻拭子样本中甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原的试剂盒，可用于医疗机构使用和家庭自测。本发明的试剂盒包含两个试剂条，分别为甲型流感病毒/乙型流感病毒抗原检测试剂条以及呼吸道合胞病毒/新型冠状病毒抗原检测试剂条，一次加样就可以同时检测人鼻拭子样本中存在的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原，采样便捷，无需抽血，提高了采样效率，节省了时间，降低了暴露风险。而且本发明的检测方法操作简单，一次加样检测四种产品，10～30min可以判读结果，相比于现有的检测试剂盒，最快十分钟就可以读取检测结果，缩短了检测时间。

附图说明

[0030] 下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。

[0031] 图1为本发明试剂盒的示意图；

[0032] 图2为本发明试剂盒的检测结果。

具体实施方式

[0033] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都涉及本发明保护的范围。

[0034] 甲型流感病毒的英文简称为Flu A，乙型流感病毒的英文简称为Flu B，新型冠状病毒的英文简称为2019‑nCoV，呼吸道合胞病毒的英文简称为RSV。

[0035] 实施例1

[0036] 如图1所示，本实施例提供了一种甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒抗原检测试剂盒，包括第一检测试剂条和第二检测试剂条；

[0037] 第一检测试剂条包括第一反应垫和第一结合垫，第一反应垫包括甲型流感病毒抗原检测线（记为A线）、乙型流感病毒抗原检测线（记为B线）和第一质控线（记为C线），第一结合垫包括胶体金标记甲型流感病毒单克隆抗体和胶体金标记乙型流感病毒单克隆抗体；

[0038] 第二检测试剂条包括第二反应垫和第二结合垫，第二反应垫包括呼吸道合胞病毒抗原检测线（记为R线）、新型冠状病毒抗原检测线（记为S线）和第二质控线（记为C线），第二结合垫包括胶体金标记呼吸道合胞病毒单克隆抗体和胶体金标记新型冠状病毒单克隆抗体；

[0039] 第一质控线和第二质控线均包被有羊抗鼠IgG多克隆抗体；

[0040] 试剂盒还包括样品垫，所述样品垫上添加有鼠IgG阻断剂；

[0041] 试剂盒还包括500μL的样本处理液，样本处理液包括pH为7.4，浓度为0.1mol/L磷酸盐缓冲液和0.5wt%吐温‑20。

[0042] 按照如下方法制备试剂盒：

[0043] （1）制备金标抗体：

[0044] 按照如下方法分别制备胶体金标记Flu A单克隆抗体、胶体金标记Flu B单克隆抗体、胶体金标记2019‑nCoV单克隆抗体、胶体金标记RSV单克隆抗体：

[0045] A1、向胶体金溶液中加入12μL/mL pH调节液（2wt% K2CO3溶液），即每mL胶体金溶液加入12μL pH调节液，摇匀10min；

[0046] A2、按15μg抗体/mL胶体金的比例，将抗体加入上述溶液中，加完摇匀30min；

[0047] A3、按10μL封闭剂/mL胶体金的比例，加入封闭剂（1wt% BSA），边加封闭剂边搅拌，加完静置15min；

[0048] A4、经10000rpm、30min、4℃离心后，弃去上清液，用复溶液将红色沉淀复溶至原体积的50%，得到标记好的胶体金。

[0049] 复溶液配制方法：称取0.50±0.01g Tris，5.00±0.01g蔗糖，0.50±0.01g PVP，0.30±0.01g Casein，加工艺用水至100mL，备用。

[0050] （2）制备试剂盒：

[0051] B1、将NC膜粘贴在PVC板上，吸水纸贴到PVC板上压住膜；

[0052] B2、设置划膜仪参数为C线1.0μL/cm，A/B/R/S线1.0μL/cm；按照《胶体金包被岗位操作规程》调整仪器参数及C/A/B/R/S线位置，将贴好的PVC板放在划膜仪上进行划线，干燥，得到膜板；

[0053] 其中C线：包被液浓度为1.2mg/mL的羊抗鼠IgG多抗；

[0054] R线：包被液浓度为1.2mg/mL的RSV单抗；包被液为TRIS‑HCl缓冲液

[0055] S线：包被液浓度为1.5mg/mL的COVID‑19单抗；包被液为TRIS‑HCl缓冲液；

[0056] A线：包被液浓度为1.0mg/mL的Flu A单抗；包被液为50mM HEPES缓冲液、1wt% Tetronic 1307、0.02wt%BSA；

[0057] B线：包被液浓度为1.2mg/mL的Flu B单抗；包被液为50mM HEPES缓冲液、1wt% Tetronic 1307、0.02wt%BSA；

[0058] B3、将金标抗体按照20μL/cm2铺在结合垫上，干燥；

[0059] B4、将鼠IgG阻断剂按照3.2μg/cm2铺在样品垫上，干燥；

[0060] B5、将膜板、结合垫、样品垫、吸水垫、样本处理液组装成成品。

[0061] 实施例2

[0062] 试剂盒的检测方法：

[0063] 将采集样本后的拭子立即置于含样本处理液的采样容器中，将拭子头紧贴收集管底部和侧面，旋转拭子10次（至少30秒）；

[0064] 轻轻挤压采样容器滴加6滴样本到检测卡的加样孔；

[0065] 10 30分钟判读结果，10分钟前和30分钟后判读的结果无效。~

[0066] 检测时遇到的几种检测结果如图2所示，具体分析如下：

[0067] （1）阳性：每个测试条中两条或三条红色条带出现。一条或两条位于检测区内，另一条位于质控区内。检测区条带颜色可深可浅，均为阳性结果。

[0068] ①甲型流感病毒、乙型流感病毒抗原测试条

[0069] 甲型流感阳性：C线和A线显示红色条带，表明甲型流感病毒抗原阳性。

[0070] 乙型流感阳性：C线和B线显示红色条带，表明乙型流感病毒抗原阳性。

[0071] 甲型流感和乙型流感阳性：C线、A线和B线均显示红色条带，表明甲型流感病毒和乙型流感病毒抗原阳性。

[0072] ②呼吸道合胞病毒、新型冠状病毒（2019‑nCoV）抗原测试条

[0073] 呼吸道合胞病毒阳性：C线和R线显示红色条带，表明呼吸道合胞病毒抗原阳性。

[0074] 新型冠状病毒阳性：C线和S线显示红色条带，表明新型冠状病毒抗原阳性。

[0075] 呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒阳性：C线、R线和S线均显示红色条带，表明新型冠状病毒和呼吸道合胞病毒抗原阳性。

[0076] （2）阴性：仅C线显示红色条带，表示结果为阴性。

[0077] （3）无效：如果测试之后，C线在窗口中不可见，则该结果被认为是无效的。出现无效结果说明操作过程不正确或试剂盒失效。建议使用新的检测卡重复测试。

[0078] 实验组一、样本处理液的影响

[0079] 对比例1

[0080] 与实施例1相比，样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液，其他与实施例1相同。

[0081] 对比例2

[0082] 与实施例1相比，样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液＋0.50wt% BSA，其他与实施例1相同。

[0083] 对比例3

[0084] 与实施例1相比，样本处理液为0.1mol/L的PBS+0.30wt%吐温‑20，其他与实施例1相同。

[0085] 对比例4

[0086] 与实施例1相比，样本处理液为0.1mol/L的PBS+0.80wt%吐温‑20，其他与实施例1相同。

[0087] 实验方法：

[0088] 分别准备Flu A、Flu B、RSV和2019‑nCoV的中阳性和弱阳性样本以及阴性样本各3种，将拭子头紧贴收集管底部和侧面，旋转拭子10次（至少30秒），用手隔着收集器外壁将拭子头液体挤干后，将拭子弃去，盖上收集器滴头。分别使用实施例1、对比例1、对比例2、对比例3、对比例4中的样本处理液处理拭子样本，按照实施例2的检测方法进行测试，每个样本重复3次。

[0089] 表1 实施例1、对比例1、对比例2的检测结果

[0090]

[0091] 说明：“＋＋＋”表示实际检测结果为强阳性；“＋＋”表示实际检测结果为中阳性；“＋”表示实际检测结果为弱阳性；“‑” 表示实际检测结果为阴性。

[0092] 通过实验结果可知，当样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液检测时阴性样本出现假阳性结果；样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液+0.5wt%BSA时，产品的灵敏度有所降低，出现假阴性结果；样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液+0.5wt%吐温‑20时检测样本未出现假阴性或假阳性结果。因此选用0.1mol/L的PBS溶液、0.5wt%吐温‑20作为样本处理液。

[0093] 表2 实施例1、对比例3、对比例4的检测结果

[0094]

[0095] 说明：“＋＋＋”表示实际检测结果为强阳性；“＋＋”表示实际检测结果为中阳性；“＋”表示实际检测结果为弱阳性；“‑” 表示实际检测结果为阴性。

[0096] 通过实验结果可知，当样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液+0.30wt%吐温‑20处理样本检测时阴性样本出现假阳性结果；样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液+0.80wt%吐温‑20时，产品的灵敏度有所降低，出现假阴性结果；样本处理液为0.1mol/L的PBS溶液+0.5wt%吐温‑20时检测样本未出现假阴性或假阳性结果。因此选用0.1mol/L的PBS溶液、0.5wt%吐温‑20作为样本处理液。

[0097] 实验组二、阻断剂的影响

[0098] 目前市场上的产品，呼吸道合胞病毒与新型冠状病毒分别在两根试剂条上面，而本发明在实验过程中发现呼吸道合胞病毒与新型冠状病毒做到一根试剂条上面，在检测时出现假阳情况。

[0099] 为了消除新型冠状病毒和呼吸道合胞病毒联合检测时产品出现的假阳现象，对产品中样品垫的成分进行研究。

[0100] 对比例5

[0101] 在样品垫中不加鼠IgG阻断剂，其他与实施例1相同。

[0102] 实验方法：

[0103] 对120份健康人鼻拭子样本分别使用对比例5和实施例1的试剂盒进行检测，来研究在样品垫中加入鼠IgG阻断剂后，检测结果能否消除假阳或者降低假阳显色。

[0104] 表3 健康人鼻拭子样本检测结果

[0105]编号 对比例5 实施例1 编号 对比例5 实施例1 编号 对比例5 实施例1
N1 + ‑ N41 ‑ ‑ N81 ‑ ‑
N2 ‑ ‑ N42 ‑ ‑ N82 ‑ ‑
N3 + ‑ N43 ‑ ‑ N83 + ‑
N4 ‑ ‑ N44 ‑ ‑ N84 ‑ ‑
N5 + ‑ N45 ‑ ‑ N85 ‑ ‑
N6 ‑ ‑ N46 ‑ ‑ N86 ‑ ‑
N7 ‑ ‑ N47 ‑ ‑ N87 ‑ ‑
N8 ‑ ‑ N48 ‑ ‑ N88 + ‑
N9 ‑ ‑ N49 ‑ ‑ N89 ‑ ‑
N10 ‑ ‑ N50 ‑ ‑ N90 ‑ ‑
N11 ‑ ‑ N51 + ‑ N91 ‑ ‑
N12 ‑ ‑ N52 + ‑ N92 ‑ ‑
N13 ‑ ‑ N53 ‑ ‑ N93 ‑ ‑
N14 ‑ ‑ N54 ‑ ‑ N94 ‑ ‑
N15 ‑ ‑ N55 ‑ ‑ N95 ‑ ‑
N16 ‑ ‑ N56 ‑ ‑ N96 ‑ ‑
N17 ‑ ‑ N57 + ‑ N97 ‑ ‑
N18 ‑ ‑ N58 ‑ ‑ N98 ‑ ‑
N19 ‑ ‑ N59 ‑ ‑ N99 + ‑
N20 ‑ ‑ N60 ‑ ‑ N100 ‑ ‑
N21 + ‑ N61 + ‑ N101 ‑ ‑
N22 ‑ ‑ N62 ‑ ‑ N102 ‑ ‑
N23 ‑ ‑ N63 ‑ ‑ N103 ‑ ‑
N24 ‑ ‑ N64 ‑ ‑ N104 ‑ ‑
N25 ‑ ‑ N65 ‑ ‑ N105 ‑ ‑
N26 + ‑ N66 ‑ ‑ N106 ‑ ‑
N27 ‑ ‑ N67 + ‑ N107 ‑ ‑
N28 ‑ ‑ N68 ‑ ‑ N108 ‑ ‑
N29 ‑ ‑ N69 ‑ ‑ N109 ‑ ‑
N30 ‑ ‑ N70 ‑ ‑ N110 ‑ ‑
N31 ‑ ‑ N71 ‑ ‑ N111 ‑ ‑
N32 ‑ ‑ N72 ‑ ‑ N112 ‑ ‑
N33 ‑ ‑ N73 ‑ ‑ N113 + ‑
N34 ‑ ‑ N74 ‑ ‑ N114 ‑ ‑
N35 ‑ ‑ N75 ‑ ‑ N115 ‑ ‑
N36 ‑ ‑ N76 ‑ ‑ N116 ‑ ‑
N37 ‑ ‑ N77 ‑ ‑ N117 ‑ ‑
N38 ‑ ‑ N78 ‑ ‑ N118 ‑ ‑
N39 ‑ ‑ N79 + ‑ N119 ‑ ‑
N40 ‑ ‑ N80 ‑ ‑ N120 ‑ ‑

[0106] 对比例5中有15例样本显示为阳性结果，其余样本为阴性结果，而实施例1中的试剂盒检测结果均为阴性结果。样品垫中加入鼠IgG阻断剂后能消除新型冠状病毒和呼吸道合胞病毒联合检测时产品出现的假阳现象，因此在样品垫的处理液中添加鼠IgG阻断剂。

[0107] 实验组三、A线和B线包被液的影响

[0108] 对比例6

[0109] 与实施例1相比，A线和B线包被液均为TRIS‑HCl缓冲液。

[0110] 实验方法：

[0111] 分别准备Flu A、Flu B中阳性和弱阳性样本以及阴性样本，将拭子头紧贴收集管底部和侧面，旋转拭子10次（至少30秒），用手隔着收集器外壁将拭子头液体挤干后，将拭子弃去，盖上收集器滴头。分别使用实施例1、对比例5的试剂盒，按照实施例2的检测方法进行测试，每个样本重复3次。

[0112] 表4 实施例1和对比例5检测结果对比

[0113]

[0114] 说明：“＋＋＋”表示实际检测结果为强阳性；“＋＋”表示实际检测结果为中阳性；“＋”表示实际检测结果为弱阳性；“‑” 表示实际检测结果为阴性。

[0115] 通过实验结果可知，对比例5中采用TRIS‑HCl缓冲液作为包被液，将甲型流感病毒、乙型流感病毒在同一根试剂条上面，检测阴性样本，出现假阳，但是采用实施例1中的包被液，假阳消除。

[0116] 采用实施例1得到的试剂盒进行实验例1‑4的实验。

[0117] 实验例1、最低检出限

[0118] （1）最低检出限的初始LOD

[0119] 选择1份病毒样本使用鼻拭子阴性样本进行梯度稀释，得到每个浓度梯度的样本各1份。对每个梯度的样本使用1个批号的产品检测，每个浓度重复检测3人份。

[0120] Flu A灭活病毒A1（2009H1N1）、Flu B灭活病毒B1（B/Victoria）、RSV灭活病毒R1（呼吸道合胞病毒B型）、2019‑nCoV灭活病毒L1（新冠病毒培养物1#）四种病毒样本的检测结果分别如表5‑8所示。

[0121] 表5 Flu A初始LOD检测结果

[0122]

[0123] 表6 Flu B初始LOD检测结果

[0124]

[0125] 表7 RSV初始LOD检测结果

[0126]

[0127] 表8 2019‑nCoV初始LOD检测结果

[0128]

[0129] 不同浓度梯度的样本检测结果可得出，Flu A初始LOD为2×103TCID50/mL，Flu B初4
始LOD为500TCID50/mL，RSV初始LOD为2.4×10TCID50/mL，2019‑nCoV初始LOD为800TCID50/mL。

[0130] （2）最低检出限的确定

[0131] 选择3份Flu A灭活病毒A1（2009H1N1）、A2（季节性H1N1）、A3（甲型H3N2），使用鼻拭3 3 3
子阴性样本进行梯度稀释，稀释后浓度为4×10TCID50/mL、2×10 TCID50/mL、1×10TCID50/mL、500TCID50/mL、250TCID50/mL，重复3次，得到每个病毒样本的每个浓度梯度的样本各3份。每个浓度重复3次得到的3份样本依次使用3个批次的产品检测，每份样本重复检测20人份，甲型流感病毒最低检出限确定检测结果如表9所示。

[0132] 表9 甲型流感病毒最低检出限确定检测结果

[0133]

[0134] 选择2份Flu B灭活病毒B1（B/Victoria）、B2（B/Yamagata），使用鼻拭子阴性样本3
进行梯度稀释，稀释后浓度为1×10 TCID50/mL、500TCID50/mL、250TCID50/mL、125TCID50/mL、
62.5TCID50/mL，重复3次，得到每个病毒样本的每个浓度梯度的样本各3份。每个浓度重复3次得到的3份样本依次使用3个批次的产品检测，每份样本重复检测20人份，乙型流感病毒最低检出限确定检测结果如表10所示。

[0135] 表10 乙型流感病毒最低检出限确定检测结果

[0136]

[0137] 选择2份RSV灭活病毒R1（呼吸道合胞病毒B型）、R2（呼吸道合胞病毒A型），使用鼻4 4
拭子阴性样本进行梯度稀释，稀释后浓度为4.8×10TCID50/mL、2.4×10 TCID50/mL、1.2×
4 3 3
10TCID50/mL、6×10TCID50/mL、3×10 TCID50/mL，重复3次，得到每个病毒样本的每个浓度梯度的样本各3份。每个浓度重复3次得到的3份样本依次使用3个批次的产品检测，每份样本重复检测20人份，呼吸道合胞病毒最低检出限确定检测结果如表11所示。

[0138] 表11 呼吸道合胞病毒最低检出限确定检测结果

[0139]

[0140] 选择3份2019‑nCoV灭活病毒L2（新型冠状病毒Alpha病毒株）、L3（新型冠状病毒Beta病毒株）、L4（新型冠状病毒Delta病毒株），使用鼻拭子阴性样本进行梯度稀释，稀释后3
浓度为1.6×10TCID50/mL、800TCID50/mL、400TCID50/mL、200TCID50/mL、100TCID50/mL，重复3次，得到每个病毒样本的每个浓度梯度的样本各3份。每个浓度重复3次得到的3份样本依次使用3个批次的产品检测，每份样本重复检测20人份，新型冠状病毒最低检出限确定检测结果如表12所示。

[0141] 表12 新型冠状病毒最低检出限确定检测结果

[0142]

[0143] Flu A灭活病毒使用鼻拭子阴性样本稀释到1×103TCID50/mL时，阳性检出率均可3
达95%以上，故将1×10 TCID50/mL作为Flu A的最低检出限。Flu B灭活病毒使用鼻拭子阴性样本稀释到250TCID50/mL时，阳性检出率均可达95%以上，故将250TCID50/mL作为Flu B的最
4
低检出限。RSV灭活病毒使用鼻拭子阴性样本稀释到1.2×10 TCID50/mL时，阳性检出率均可
4
达95%以上，故将1.2×10 TCID50/mL作为RSV的最低检出限。2019‑nCoV灭活病毒使用鼻拭子阴性样本稀释到200TCID50/mL时，阳性检出率可达95%以上，故将200TCID50/mL作为2019‑nCoV的最低检出限。

[0144] （3）最低检出限的验证

[0145] 选择3份Flu A灭活病毒A1（2009H1N1）、A2（季节性H1N1）、A3（甲型H3N2流感病毒）3
使用鼻拭子阴性样本稀释至最低检出限1×10TCID50/mL。使用3批产品分别对稀释后样本检测20人份，观察检测结果。

[0146] 表13 Flu A病毒株最低检出限验证检测结果

[0147]

[0148] 选择3份Flu B灭活病毒B1（B/Victoria）、B2（B/Yamagata）、B3（B/Washington），使用鼻拭子阴性样本稀释至最低检出限250TCID50/mL。使用3批产品分别对稀释后样本检测20人份，观察检测结果。

[0149] 表14 Flu B病毒株最低检出限验证检测结果

[0150]

[0151] 选择2份RSV灭活病毒R1（呼吸道合胞病毒B型）、R2（呼吸道合胞病毒A型），使用鼻4
拭子阴性样本稀释至最低检出限1.2×10 TCID50/mL。使用3批产品分别对稀释后样本检测
20人份，观察检测结果。

[0152] 表15 RSV病毒株最低检出限验证检测结果

[0153]

[0154] 选择3份2019‑nCoV灭活病毒L5（新型冠状病毒P.1病毒株）、L6（新型冠状病毒Kappa病毒株）、L7（新型冠状病毒Omicron病毒株），使用鼻拭子阴性样本稀释至最低检出限200TCID50/mL。使用3批产品分别对稀释后样本检测20人份，观察检测结果。

[0155] 表16 2019‑nCoV病毒株最低检出限验证检测结果

[0156]

[0157] Flu A灭活病毒（2009H1N1、季节性H1N1、甲型H3N2流感病毒）使用鼻拭子阴性样本3
稀释至最低检出限（1×10TCID50/mL）后检测，可达95%以上的阳性检出率；Flu B灭活病毒（B/Victoria、B/Yamagata、B/Washington）使用鼻拭子阴性样本稀释至最低检出限（250TCID50/mL）后检测，可达95%以上的阳性检出率；RSV灭活病毒（呼吸道合胞病毒B型、呼
4
吸道合胞病毒A型）使用鼻拭子阴性样本稀释至最低检出限（1.2×10TCID50/mL）后检测，可达95%及以上的阳性检出率；2019‑nCoV灭活病毒（新型冠状病毒P.1病毒株、新型冠状病毒Kappa病毒株、新型冠状病毒Omicron病毒株）使用鼻拭子阴性样本稀释至最低检出限（200TCID50/mL）后检测，可达95%以上的阳性检出率。

[0158] 所以本发明的试剂盒Flu A的最低检出限浓度为1×103TCID50/mL；Flu B的最低检4
出限浓度为250TCID50/mL；RSV的最低检出限浓度为1.2×10TCID50/mL；2019‑nCoV的最低检出限浓度为200TCID50/mL。

[0159] 实验例2、高剂量钩状效应（HOOK）

[0160] 分别将灭活的甲型流感病毒、乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和新型冠状病毒（2019‑nCoV）培养物使用鼻拭子阴性样本基质进行稀释。随机抽取足量的三个批次产品，检测稀释后的所有的样本，每个样本测试3次。

[0161] 表17 Flu A HOOK试验结果

[0162]

[0163] 表18 Flu B HOOK试验结果

[0164]

[0165] 表19 RSV HOOK试验结果

[0166]

[0167] 表20 2019‑nCoV HOOK试验结果

[0168]

[0169] 试验结果证明：随着病毒培养物浓度的增加，显色深度一直增强，Flu A达到1.266 6 7
×10TCID50/mL浓度，Flu B达到7.2×10TCID50/mL浓度，RSV达到4.8×10TCID50/mL浓度，
6
2019‑nCoV达到3.8×10TCID50/mL浓度时，显色为由深变浅，在该浓度下试剂均未出现HOOK效应。

[0170] 实验例3、交叉性验证

[0171] 产品通过对下表中临床上易引起相同和相似症状的常见交叉反应病原微生物进6 6
行验证，病毒浓度为l×10 PFU/mL时，其他细菌及病原体浓度为l×10CFU/mL时，结果表明产品对下表交叉反应物特异性良好。本发明试剂盒检测其他病原微生物结果都为阴性，证明本发明试剂盒与其他病原微生物之间没有交叉反应，具有很强的特异性。

[0172] 表21 常见交叉反应病原微生物

[0173]

[0174] 实验例4、干扰反应

[0175] 通过对下表中临床常见治疗药物在正常用法用量下的最高血药浓度对本产品进行干扰验证，结果表明本产品抗干扰性能良好。

[0176] 表22 临床常见治疗药物

[0177]

[0178] 以上仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。