基于8-17脱氧核酶与CRISPR-Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法

摘要

本发明提供了一种基于8‑17脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法，将8‑17脱氧核酶循环切割性能、CRISPR‑Cas13a反式循环切割性能、立足点链置换介导的序列循环利用整合起来，构建了三重循环信号放大体系用于牛结核分枝杆菌的高性能“一管式”检测。创新性地将8‑17脱氧核酶序列设计在A序列中，在有靶标T存在时释放出A序列，对HX‑gRNA凸起结构进行反复切割，CRISPR‑Cas13a体系实现对HX‑gRNA凸起结构切割，而H序列进入下游可进行循环利用，并与H1、H2进行杂交链式反应，释放出G‑四链体二聚体结构，通过与THT染料结合，作为信号输出方式。该设计构建了一个多重信号放大体系，具有恒温、灵敏度高、操作简单、可实现“一管式”操作等特点，为核酸检测提供了一种新方法。

权利要求

1.一种基于8‑17脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组，其特征在于，包括探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b和LwaCas13a酶；所述探针A含有8‑17脱氧核酶，所述gRNA与LwaCas13a、g序列结合形成

2+

CRISPR‑Cas13a系统；所述探针a含有G‑四链体二聚体序列；所述探针组在Pb 条件下通过多重信号放大实现对牛结核分枝杆菌靶标基因T的检测；

其中，所述探针A的基因序列如SEQ ID NO.1所示，探针B的基因序列如SEQ ID NO.2所示，探针HX的基因序列如SEQ ID NO.3所示，探针gRNA的基因序列如SEQ ID NO.4所示，探针g的基因序列如SEQ ID NO.5所示，探针H1的基因序列如SEQ ID NO.6所示，探针H2的基因序列如SEQ ID NO.7所示，探针a的基因序列如SEQ ID NO.8所示，探针b的基因序列如SEQ ID NO.9所示，靶标基因T的基因序列如SEQ ID NO.10所示，8‑17脱氧核酶功能序列如SEQ ID NO.11所示。

2.一种非诊疗目的牛结核分枝杆菌的检测方法，其特征在于，应用如权利要求 1 所述探针组，包括以下步骤：S1、探针序列预处理：分别将探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b冻干粉配置成母液，再分别用缓冲液将母液稀释；将稀释后的探针A、B母液混合后孵育形成探针A‑B；将稀释后的探针gRNA、HX母液混合后孵育形成探针HX‑gRNA；将稀释后的探针a、b母液混合后孵育形成探针a‑b；

S2、链置换释放脱氧核酶序列：将牛结核分枝杆菌待测样品与探针A‑B混匀反应；

S3、8‑17脱氧核酶与LwaCas13a对特异性探针的切割：在S2步骤反应结束后加入探针HX‑gRNA反应，之后加入LwaCas13a、g探针混合，并加入酶反应缓冲溶液后进行反应；

S4、形成G‑四链体二聚体结构：在S3反应结束后加入H1、H2、 a‑b探针、THT，加入缓冲溶液后避光进行反应；

S5、荧光检测：对S4反应结束后份溶液稀释后吸取样品于比色皿中上机检测，依据靶标基因T响应校准曲线计算待测样品的浓度。

3.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S1中探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b母液稀释后的浓度比为4:4:2:2:1:1:1:2:

2+

2；所述缓冲溶液为pH=7.5，含有Pb 的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲溶液。

4.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述探针A‑B中探针A与探针B的摩尔比为1:1；所述探针HX‑gRNA中探针HX与探针gRNA的摩尔比为6:5；所述探针a‑b中探针a与探针b的摩尔比为1:1.1。

5.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S2中牛结核分枝杆菌待测样品与探针A‑B体积比为2:1，反应时间为1h。

6.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S3中HX‑gRNA探针、LwaCas13a和g探针的摩尔比为4:1:1；反应温度为37℃，反应时间3小时。

7.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S4中H1、H2、 a‑b探针和THT的摩尔比为11:11:10:100；反应温度为室温，反应时间1.5小时。

8.根据权利要求2所述的检测方法，其特征在于，所述步骤S5中检测参数为：激发光光谱带宽15 nm，发射光光谱带宽15 nm，激发光波长420 nm。

说明书

基于8‑17脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分

枝杆菌的探针组及方法

技术领域

[0001] 本发明属于本发明涉及生物分析检测技术领域，具体涉及一种基于8‑17脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法。

背景技术

[0002] 结核分枝杆菌主要分三个型：即牛分枝杆菌（牛型）、结核分枝杆菌（人型）和禽分枝杆菌（禽型）。牛结核分枝杆菌是结核分枝杆菌的一种亚型，在所有结核分枝杆菌复合体中，牛结核分枝杆菌的宿主范围最广，且具有潜伏期长和疾病复发等特征，牛结核分枝杆菌引起的人畜共患病的爆发不仅会造成畜牧业的经济损失，而且还严重威胁着人类的健康。因此，建立灵敏、快速检测牛结核分枝杆菌的方法对疾病诊断具有重要意义。目前，检测牛结核分枝杆菌的方法主要有：1、分子检测法，2、免疫学方法，3、微生物培养方法等。免疫学方法和微生物培养法虽然能够实现对牛结核分枝杆菌的检测，但它们具有敏感度低、特异性不高等缺点，微生物培养法还存在着时间长和检测工作量大的问题，故目前常用的方法主要是分子检测法，但目前使用最多的传统PCR技术需要昂贵的控温设备，易出现假阳性和假阴性等问题。

[0003] 脱氧核酶是利用体外分子进化技术获得的一种具有催化功能的单链DNA片段，具有高效的催化活性和结构识别能力，已被证明能催化许多与RNA酶（也称为核酶）或蛋白酶相同的反应，包括RNA/DNA切割、连接、磷酸化、磷酸酰胺键的切割和卟啉金属化。其中8‑17脱氧核酶由一个茎环结构和未配对的4‑5nt区域共同组成，环部一般为保守序列5'‑AGC‑3’，茎一般由3个碱基对构成，该结构可对5’‑rAG‑3’进行特异性切割。Yang等人提出一个新概念“纳米耀斑对”，在两个金纳米颗粒上修饰探针，当细胞内存在肿瘤组织中高度表达的TK1 mRNA和survivin mRNA时，可通过链置换，使得两个金纳米颗粒上的探针相互靠近形成
8‑17脱氧核酶，实现对带有修饰荧光淬灭基团的探针进行切割，该体系开发了多功能纳米治疗平台“纳米耀斑对（NC）”，可用于原位复合癌相关mRNA成像和随后的逻辑控制聚集金纳米粒子，从而实现基因治疗和红外光照射下的光热治疗。近年来获得诺贝尔化学奖的CRISPR基因编辑系统是研究的热点之一，基于CRISPR‑Cas系统的检测技术显示出高灵敏度、准确性、无需热循环仪器、价格低廉、可移动且快速的优点，适合于开发面向基层机构的普适性检测技术。其中CRISPR‑Cas13a，由于其灵敏度、特异性和核酸识别等特点，被重点用于分子诊断技术领域，作为部分强大诊断技术的核心，它们正在彻底改变病毒检测的方式，为生物传感开辟了一条新的道路。如Zhang等人利用SHERLOCK来实现对于RNA的高灵敏度检测，首先利用RPA扩增出大量的DNA序列，再通过T7体外转录形成RNA，Cas13a可对该RNA序列进行识别，并对带有修饰荧光基团的RNA探针进行切割，从而实现对靶标的高灵敏度检测。

[0004] 鸟嘌呤（G）‑四链体是一种高度有序的四链结构，衍生自富含G的单链核酸序列，硫黄素T（THT）是一种水溶性荧光染料，可以特异性结合G‑四链体，具有显著的荧光增强作用。利用“发光”特性，G‑四链体/THT可以作为分子信标构建无标签荧光生物传感策略，用于检测DNA。研究发现由两个串联的G四链体单体所形成的G四链体二聚体是一种稳定的DNA结构，可以显著的增强THT染料的荧光强度，G四链体二聚体/THT的荧光强度大约是G四链体单体/THT的九倍，并且在高盐介质中不受影响。因此，G‑四链体二聚体/THT作为一种新型的荧光报告子，在更多的生物传感器中具有巨大的应用潜力。

发明内容

[0005] 为了解决上述技术问题，克服现有检测牛结核分枝杆菌技术中的高成本，易假阳和假阴性等问题，本发明提供了一种基于8‑17脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法，利用8‑17脱氧核酶对特异性序列进行反复切割，并通过CRISPR‑Cas13a对RNA序列的反式切割能力以及下游引发序列不断循环的方式进行信号放大，从而提升整个体系的灵敏度，并通过下游所形成的G‑四链体二聚体与THT染料结合作为荧光信号输出，使整个检测过程更加简单，该体系具有温度恒定，可实现“一管式”操作，灵敏度高等优点。

[0006] 为达到上述目的，本发明首先提供了一种基于8‑17脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组，包括探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b和LwaCas13a酶；所述探针A含有8‑17脱氧核酶，所述gRNA与2+
LwaCas13a、g序列结合形成CRISPR‑Cas13a系统；所述探针组在Pb 条件下通过多重信号放大实现对牛结核分枝杆菌靶标基因T的检测；

[0007] 其中，所述探针A的基因序列如SEQ ID NO.1所示，探针B的基因序列如SEQ ID NO.2所示，探针HX的基因序列如SEQ ID NO.3所示，探针gRNA的基因序列如SEQ ID NO.4所示，探针g的基因序列如SEQ ID NO.5所示，探针H1的基因序列如SEQ ID NO.6所示，探针H2的基因序列如SEQ ID NO.7所示，探针a的基因序列如SEQ ID NO.8所示，探针b的基因序列如SEQ ID NO.9所示，靶标基因T的基因序列如SEQ ID NO.10所示，8‑17脱氧核酶功能序列如SEQ ID NO.11所示。

[0008] 基于一个总的发明构思，本发明还提供了一种非诊疗目的牛结核分枝杆菌的检测方法，包括以下步骤：

[0009] S1、探针序列预处理：分别将探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、探针a、探针b冻干粉配置成母液，再分别用缓冲液将母液稀释；将稀释后的探针A、B母液混合后孵育形成探针A‑B；将稀释后的探针gRNA、HX母液混合后孵育形成探针HX‑gRNA；将稀释后的探针a、b母液混合后孵育形成探针a‑b；

[0010] S2、链置换释放脱氧核酶序列：将牛结核分枝杆菌待测样品与探针A‑B混匀反应；

[0011] S3、8‑17脱氧核酶与LwaCas13a对特异性探针的切割：在S2步骤反应结束后加入探针HX‑gRNA反应，之后加入LwaCas13a、g探针混合，并加入酶反应缓冲溶液后进行反应；

[0012] S4、形成G‑四链体二聚体结构：在S3反应结束后加入H1、H2、 a‑b探针、THT，加入缓冲溶液后避光进行反应；

[0013] S5、荧光检测：对S4反应结束后份溶液稀释后吸取样品于比色皿中，上机检测，依据靶标基因T响应校准曲线计算待测样品的浓度。

[0014] 作为优选，所述步骤S1中探针A、探针B、探针HX、探针gRNA、探针g、探针H1、探针H2、2+
探针a、探针b母液稀释后的浓度比为4:4:2:2:1:1:1:2:2；所述缓冲溶液为pH=7.5，含有Pb的三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris‑HCl）缓冲溶液。

[0015] 作为优选，所述探针A‑B中探针A与探针B的摩尔比为1:1；所述探针HX‑gRNA中探针HX与探针gRNA的摩尔比为6:5；所述探针a‑b中探针a与探针b的摩尔比为1:1.1。

[0016] 作为优选，所述步骤S2中牛结核分枝杆菌待测样品与探针A‑B体积比为2:1，反应时间为1h。

[0017] 作为优选，所述步骤S3中HX‑gRNA探针、LwaCas13a和g探针的摩尔比为4:1:1；反应温度为37℃，反应时间3小时。

[0018] 作为优选，所述步骤S4中H1、H2、 a‑b探针和THT的摩尔比为11：11：10：100；反应温度为室温，反应时间1.5小时。

[0019] 作为优选，所述步骤S5中检测参数为：激发光光谱带宽15 nm，发射光光谱带宽15 nm，激发光波长420 nm。

[0020] 本发明提供的基于8‑1 7脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组检测原理和过程具体为：

[0021] 实验原理如图1所示，本发明将8‑17脱氧核酶循环切割性能、CRISPR‑Cas13a反式循环切割性能、立足点链置换介导的序列循环利用整合起来，构建了一种三重循环信号放大体系用于牛结核分枝杆菌的高性能“一管式”检测：

[0022] 第一重信号循环放大：通过靶标T即牛结核分枝杆菌DNA与A‑B (A序列包含8‑17脱氧核酶功能序列5’‑TTCTTTTGCTCCGA GCCGGTCGAACTATC‑3’，B序列对A起到封闭作用)进行链置换释放出A序列，进一步将特异性探针HX‑gRNA（为HX与gRNA的杂交二聚体，其中包含两个非互补的单链RNA凸起结构）凸起结构（包含8‑17脱氧核酶识别位点：5’‑GAUAGUUCG‑3’,5’‑GCAAAAGAA‑3’,切割位点：r‑AG）进行切割，释放出HX链中的DNA序列H（HX的部分序列：
5’‑CCCCTTCGTTAATGCAGATC‑3’）、gRNA序列和A序列，其中序列A可循环用于对HX‑gRNA的切割，释放出H链，构建循环1；

[0023] 第二重信号循环放大：gRNA可与LwaCas13a、g序列结合形成具有RNA反式切割活性的LwaCas13a复合物，实现对体系中任意RNA的切割效果，从而对HX‑gRNA凸起结构进行再次切割，释放出H链，构建循环2；

[0024] 第三重信号循环放大：释放出的H链则可进入下游体系，重复与H1、H2作用，形成“T”型复合物，构建循环3。“T”型复合物游离部分（H1游离出5’‑AGGGGAAT‑3’，H2游离出5’‑TCTTGGAGCGCTACG‑3’）可与a‑b复合物（由含有G‑四链体二聚体序列：5’‑GGGTTGGGCGGGATGGGGGGTTGGGCGGGATGGG‑3’的a序列和对该序列进行保护的b序列杂交而成）进行链置换（立足点为：5’‑ATTCCCCTCGTAGCGCTCCAAGA‑3’），暴露出a序列中的G‑四链体二聚体序列。硫黄素T(THT)作为一种水溶性荧光染料由一个苄胺环和一个苯硫醚环组成，这两个环可以围绕C‑C键自由旋转，导致THT的荧光很低，但当这种旋转受到某些特殊结构的限制时，THT的荧光就会显著增强，而G‑四链体二聚体与THT染料具有较强亲和力，能够高效地增强THT的荧光发射。因此，在整个体系中加入THT染料，可与a序列中G‑四链体二聚体序列结合发出荧光作为信号输出方式。

[0025] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

[0026] （1）本体系利用8‑17脱氧核酶对特异性序列进行反复切割，并通过CRISPR‑Cas13a对RNA序列的反式切割能力以及下游引发序列不断循环的方式进行信号放大，从而提升整个体系的灵敏度，并通过下游所形成的G‑四链体二聚体与THT染料结合作为荧光信号输出，使整个检测过程更加简单，该体系具有温度恒定，可实现“一管式”操作，灵敏度高等优点。

[0027] （2）本发明检测体系具有温度恒定、操作简单的特点，此外，本体系构建了三重循环信号放大体系：循环1：含有8‑17脱氧核酶的A序列对HX‑gRNA的凸起RNA序列进行识别及循环切割；循环2：HX‑gRNA初次切割后释放出的gRNA可与g、LwaCas13a结合，形成CRISPR‑Cas13a系统，实现对HX‑gRNA的循环切割；循环3：HX‑gRNA被切割后释放的H序列可循环利用不断形成“T”型复合物，每个循环具有灵敏度高等优点，可用于牛结核分枝杆菌的体外高灵敏度“一管式”检测，实现牛结核分枝杆菌的准确定量分析。

[0028] （3）本发明检测体系的序列设计巧妙，充分利用8‑17脱氧核酶功能序列对特异性探针进行反复切割，以及被切割后释放出的两条序列，一条与LwaCas13a结合，形成CRISPR‑Cas13a体系对特异性探针再次切割，另一条进入下游体系不断循环利用来实现三重信号放大的高灵敏度检测，弥补了常规体系检测灵敏度不高，操作复杂的缺点，实现多重信号放大效果，提高检测性能。

[0029] （4）反应条件不需要借助昂贵变温仪器，反应条件温和，在37℃恒温条件下反应，操作简单，可实现“一管式”操作，有效解决了目前国内外对牛结核分枝杆菌现场检测的局限性。

附图说明

[0030] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0031] 图1为本发明基于8‑1 7脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组检测原理图；

[0032] 图2为本发明实施例1中不同浓度的靶标基因T荧光光谱曲线；

[0033] 图3为本发明实施例1中不同浓度的靶标基因T响应校准曲线；

[0034] 图4为本发明实验例1中完整体系及体系去掉关键因素后靶标基因 T 荧光光谱曲线；

[0035] 图5为本发明实验例1中靶标基因T检测方法电泳分析，其中a为AB与T能够顺利反应并释放出A序列，酶也能顺利的对上游起到信号放大的作用；b为金属离子条件下A中8‑17脱氧核酶可顺利对HX‑gRNA进行切割，而在没有金属离子条件下，则不能切割；c为下游使得a序列中的G‑四链体二聚体结构暴露出来，从而实现对于靶标的检测；

[0036] 图6为本发明中靶标基因T的DNA检测信号饱和曲线。

具体实施方式

[0037] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。

[0038] 若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段；若未特别指明，实施例中所用试剂均为市售。

[0039] 本发明涉及到的百分号“%”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100 mL溶液中含有溶质的克数。

[0040] 本发明所述重量份可以是μg、mg、g、kg等本领域公知的重量单位，也可以是其倍数，如1/10、1/100、10倍、100倍等。

[0041] 本发明涉及到的探针均购自上海生工生物工程股份有限公司，以下实施例和实验例中所使用的探针序列如表1所示：

[0042]

[0043] 其中，A探针序列中带下划线的序列为8‑17脱氧核酶功能序列；

[0044] HX探针序列中带有下划线的序列为RNA，不带下划线为DNA；靠近3’端的片段为序列H（CCCCTTCGTTAATGCAGATC），斜体加粗的AG为RNA切割位点；

[0045] H1、H2探针序列中的加粗和加下划线的序列形成“T”型复合物；

[0046] a探针序列中的加粗加下划线的序列为G‑四链体二聚体序列，斜体的为链置换的立足点。

[0047] 实施例1

[0048] 基于8‑1 7脱氧核酶与CRISPR‑Cas13a反式切割检测牛结核分枝杆菌的探针组及方法检测靶标基因T，具体步骤如下：

[0049] (1)探针预处理

[0050] ①靶标T：用二甲基亚硝基乙酰胺水（DEPC水）将T探针将冻干粉配置成100 µM的母液。用Tris‑HCl缓冲溶液（pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 uM PbCl2）将母液稀释至不同浓度(1fM、50fM、500fM、1pM、10pM、330pM）。

[0051] ②探针A‑B:用DEPC水将A、B探针将冻干粉配置成100 µM的母液。用Tris‑HCl缓冲溶液（pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 uM PbCl2）将母液稀释至20 uM。之后各取A、B探针15 uL混合，95℃孵育5min后以缓慢降至室温形成A‑B结构。

[0052] ③探针HX‑gRNA:用DEPC水将gRNA、HX探针将冻干粉配置成20 µM的母液。用Tris‑Hcl缓冲溶液（pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 uM PbCl2）将母液稀释至10 uM。之后将6 uL HX探针、5 uL gRNA混合，95℃孵育5min后以缓慢降至室温形成HX‑gRNA结构。

[0053] ④探针g：用DEPC水将 g 探针将冻干粉配置成20 µM的母液。用Tris‑HCl缓冲溶液（pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 uM PbCl2）将母液稀释至5 uM。

[0054] ⑤探针H1、H2:用DEPC水将H1、H2探针将冻干粉配置成100 µM的母液。用Tris‑HCl缓冲溶液（pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 uM PbCl2）将母液稀释至5 uM。

[0055] ⑥探针a‑b:用DEPC水将a、b探针将冻干粉配置成100 µM的母液。用Tris‑Hcl缓冲溶液（pH 7.5, 150 mM NaCl, 100 uM PbCl2）将母液稀释至10 uM。之后取a探针30 uL、b探针33 uL混合，95℃孵育5min后以缓慢降至室温形成a‑b结构。

[0056] (2)链置换释放脱氧核酶序列

[0057] 取4 µL不同浓度的靶标T、2 µL、10uM的 A‑B于200 µL离心管混匀，反应1小时。

[0058] (3)8‑17脱氧核酶与LwaCas13a对特异性探针的切割

[0059] 上述反应结束后加入2 uL 、10 uM 的HX‑gRNA反应1小时，之后加入1uL 、5 uM的Cas13a和1uL、5 uM的g探针混合，并加入酶反应缓冲溶液将体积补足至20 uL，于37℃反应3小时。

[0060] (4)形成G‑四链体二聚体结构

[0061] 在上述溶液中加入各3.3 uL、5 uM的H1、H2，3 uL、5 uM a‑b，3 uL、50 uM THT，并用缓冲溶液补足至总体积100 uL，在黑暗条件下于室温反应1.5小时。

[0062] (5)荧光检测

[0063] 在上述溶液中加入20 uL缓冲溶液进行稀释，后吸取EP管中120 uL样品于比色皿中，设置荧光光谱仪参数为：激发光光谱宽带15 nm，发射光光谱宽带15 nm，激发光波长420 nm。测定参数后保存数据。

[0064] 图2为不同浓度的靶标基因T荧光光谱曲线，结果表明所测定随着靶标基因浓度的增加，荧光强度增大，荧光强度与靶标基因呈正相关，且1 fmol/L至330 pmol/L的靶标基因T在490nm处的荧光最强，适用检测的靶标浓度范围广；

[0065] 图3为不同浓度的靶标基因T响应校准曲线，当靶标浓度即牛结核分枝杆菌的浓度在1 fmol/L‑500 fmol/L的范围内，荧光强度随着靶标浓度的增大而增大，呈较好的线性关2
系，回归方程为y=53.736×logC+276.871(y为荧光强度，C为靶标浓度)，R =0.9813，检出限为0.5 fmol/L（S/N=3），该结果证明本研究方法可实现对牛结核分枝杆菌的高灵敏度检测。

[0066] 实验例1

[0067] 该探针组检测体系的可行性分析

[0068] 1、为了对整个体系可行性进行检验，在实验过程中去掉关键因素：带有脱氧核酶序列的A探针、启动下游和实现信号放大的HX‑gRNA探针、用于与H2结合促进G‑四链体二聚体结构形成的H1探针。

[0069] 结果如图4所示，当整个体系去掉关键因素后，信号值与完整体系相差较大，无法实现对靶标的检测，验证了整个体系具有检测牛结核分枝杆菌靶标的能力。

[0070] 2、此外，还通过琼脂糖凝胶电泳对上下游系统进行表征，如图5所示，其中图5（a）中1为marker，2为A、3为B、4为T、5为AB、6为AB+T混合物、7为AB+T+HX‑gRNA混合物、8为AB+T+HX‑gRNA‑g‑酶混合物，该结果图表示AB与T能够顺利反应并释放出A序列，酶也能顺利的对上游起到信号放大的作用。图5(b)中1为marker、2为无金属离子条件下AB+T+HX‑gRNA混合2+
物，3为无金属离子条件下AB+T+HX‑gRNA+g+酶混合物，4为Pb 浓度为100 µM条件下AB+T+
2+
HX‑gRNA混合物，5为Pb 浓度为100 µM条件下AB+T+HX‑gRNA+g+酶混合物，由图5(b)可知，在金属离子条件下A中8‑17脱氧核酶可顺利对HX‑gRNA进行切割，而在没有金属离子条件下，则不能切割(8‑17脱氧核酶必须在金属离子存在时才能发挥切割作用），因此可证明，在体
2+
系完整的情况下（含有Pb ），A确实实现了其切割作用。图5(c)所示的1为marker、2为HX、3为H1、4为H2、5为a‑b，6为H1+H2+a‑b，7为HX+H1+H2+a‑b（整个下游体系），8为AB+T+HX‑gRNA+g+酶混合物+H1+H2+a‑b（整个体系），证明可通过下游使得a序列中的G‑四链体二聚体结构暴露出来，从而实现对于靶标的检测。

[0071] 实验例2

[0072] 考察靶标基因T的DNA检测信号饱和曲线

[0073] 利用紫外分光光度计检测不同浓度靶标基因T的荧光强度

[0074] 图6为本发明中靶标基因T的DNA检测信号饱和曲线，结果表明，当牛结核分枝杆菌DNA低于2 pM时，其荧光强度随着牛结核分枝杆菌DNA浓度的增加而增大，在2 pM以后趋于饱和，达到最高吸收峰值，随后信号值总体趋于稳定。

[0075] 实验例3

[0076] 血液中牛结核分枝杆菌检测

[0077] 为了验证整个体系对于牛结核分枝杆菌实际样品的检测性能，本研究针对线性范8
围内浓度的牛结核分枝杆菌实际样品浓度进行检验。将含有10 CFU/mL的灭活牛结核分枝杆菌菌液加入牛血基质中，并采用核酸提取方法提取DNA，最后将150 fmol/L、155 fmol/L、
166 fmol/L的实际样品进行检测（除了靶标浓度不同外，其他条件均保持一致）。

[0078] 结果如表2所示，实际样品的回收率在94.4%‑109.0%之间，相对标准偏差为1.9%‑4.1%之间，该现象表明本研究可对牛结核分枝杆菌实际样品进行检测：

[0079]