一种F1多肽的制备方法

摘要

本发明属于制药技术领域，具体涉及一种F1多肽的制备方法，包括以下步骤：制备Rink Amide MBHA树脂；分两步制备Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rin kAmide MBHA Resin树脂；加到切割液中进行侧链保护基的切割，沉淀及洗涤、干燥裂解；进行纯化、换盐、冻干。本发明提高了F1多肽的纯度。

权利要求

1.一种F1多肽的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1制备Rink Amide MBHA 树脂；

S2分两步制备全保护肽树脂

Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，包括：（1）根据F1多肽序列从C端到N端依次偶联相应的氨基酸，先合成得到

Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin 树脂；（2）取步骤（1）所得产物进行后续8个氨基酸位点的偶联，得到Fmoc‑Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，脱Fmoc保护，得全保护肽树脂Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂；

S3将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中进行侧链保护基的切割，沉淀及洗涤、干燥，得到F1多肽粗品；

S4将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化、换盐纯化、冻干，即得F1多肽；

所述步骤S3所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:苯酚:水＝87.5:5:

2.5:2.5:2.5；

所述步骤S4粗品纯化时使用反相高效液相色谱法纯化，以颗粒大小为3µm的C18填料作为色谱柱的固定相，以体积比为1:1:100的三乙胺、磷酸和水为流动相A相，流动相B相由流动相A相和乙腈按体积比2:8组成；

所述步骤S4粗品纯化时按照90分钟内，流动相B相的比例由38%升至58%的线性梯度对样品进行梯度洗脱；

纯化过程中使色谱柱柱温保持在50 55℃；

~

所述步骤（1）中氨基酸为Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑His(Trt)‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH，Fmoc‑Ile‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Pro‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH；

当氨基酸为Fmoc‑His(Trt)‑OH时，偶联剂为HOOBt；当氨基酸为Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、 Fmoc‑Lys(Boc)‑OH时，偶联剂为HOBt；

所述步骤（2）进行后续8个氨基酸位点的偶联时采用的偶联剂为HOBt/DIC，其中，采用Fmoc‑Ser(tBu)‑OH 进行Ser氨基酸位点的偶联，采用 Fmoc‑Ser(tBu)‑OH 进行Ser氨基酸位点的偶联时采用的偶联体系选自HOBt/DIC。

2.如权利要求1所述的F1多肽的制备方法，其特征在于，所述步骤S1所述Rink Amide MBHA树脂是以MBHA树脂与Rink Amide Linker为主要原料制备而成，所述MBHA树脂的初始取代度为0.1 0.8mmol/g。

~

3.如权利要求2所述的F1多肽的制备方法，其特征在于，所述MBHA树脂的初始取代度为

0.47mmol/g。

说明书

一种F1多肽的制备方法

技术领域

[0001] 本发明属于制药技术领域，具体涉及一种F1多肽的制备方法。

背景技术

[0002] 生物体内几乎所有细胞都受多肽调节，如：细胞分化、神经激素递质调节、免疫调节等，多肽具有调节机体生理功能和提供机体营养的双重功效，因此多肽药物的研究和开发具有重要的研究意义和应用前景。F1多肽中文序列为：甘氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑丝氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑亮氨酰‑甘氨酰‑L‑丝氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑丙氨酰‑L‑赖氨酰‑L‑组氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑脯氨酰‑L组氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑亮氨酰‑L‑脯氨酰‑L‑组氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑脯氨酰‑L‑缬氨酰‑L‑异亮氨酰‑L‑丙氨酰‑L‑谷氨酰‑L‑组氨酰‑L‑亮氨酰胺醋酸盐。英文序列为：H‑Gly‑Leu‑Leu‑Ser‑Val‑Leu‑Gly‑Ser‑Val‑Ala‑Lys‑His‑Val‑Leu‑Pro‑His‑Val‑Leu‑Pro‑His‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu‑His‑Leu‑NH2。分子式为：C143H237N39O33。

[0003] F1多肽的结构如下：

[0004]

[0005] 人们可以利用生物体内分离、生物技术及化学合成等方法获得多种活性肽，尤其是化学合成过程中能够方便改变多肽的一级结构、加入特殊氨基酸、对多肽末端进行修饰等优点，备受关注。现有F1多肽的制备方法是根据多肽序列，将Fmoc‑氨基酸依次连接，但对于N端存在连续疏水性氨基酸的序列，合成过程中易于发生缩聚而导致产量低和杂质含量高，不利于制药行业的大规模高纯度生产。

发明内容

[0006] 针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种F1多肽的制备方法。本发明提高了F1多肽的产量，大大降低了杂质含量，显著提高了F1多肽的纯度，有利于制药行业的大规模高纯度生产。

[0007] 本发明的技术方案是：

[0008] 一种F1多肽的制备方法，包括以下步骤：

[0009] S1制备Rink Amide MBHA树脂；

[0010] S2分两步制备全保护肽树脂

[0011] Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，包括：(1)根据F1多肽序列从C端到N端依次偶联相应的氨基酸，先合成得到Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂；(2)取步骤(1)所得产物进行后续8个氨基酸位点的偶联，得到Fmoc‑Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，脱Fmoc保护，得全保护肽树脂Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂；

[0012] S3将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中进行侧链保护基的切割，沉淀及洗涤、干燥，得到F1多肽粗品；

[0013] S4将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化、换盐纯化、冻干，即得F1多肽。

[0014] 进一步地，所述步骤S1所述Rink Amide MBHA树脂是以MBHA树脂与Rink Amide Linker为主要原料制备而成，所述MBHA树脂的初始取代度为0.1～0.8mmol/g。因为肽链序列比较长，取代度过高，会导致连接更加困难；取代度过低，会对试剂造成浪费，对生产设备的规模和性能提出过高的要求，没法进行大规模工业化生产。

[0015] 进一步地，所述步骤S1制备Rink Amide MBHA树脂的具体步骤为：

[0016] (1)称取MBHA树脂置于带筛板固相合成反应器中，加入5％NMM/DMF，在20～30℃下溶胀60～120分钟，抽干，用1.0倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂2次，每次2～4分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0017] (2)称取3eq Rink Amide Linker和2.85eq HBTU加入容器中，0.5～1.0倍树脂体积的DMF溶解，冷浴条件下冷却，缓慢加入NMM，预活化5～15分钟，将上述预活化反应液加入到步骤(1)含有树脂的反应器中，20～30℃条件下反应90～120分钟，反应过程中每30±5分钟进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用1.0倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂3次，每次2～4分钟，抽干，即得。

[0018] 优选地，所述MBHA树脂的初始取代度为0.47mmol/g。

[0019] 进一步地，所述步骤S2根据F1多肽序列从C端到N端依次偶联相应的氨基酸，先合成得到

[0020] Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂的具体步骤为：

[0021] (a)将Rink Amide MBHA树脂置于反应器中，向反应器中加入1.0倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液，搅拌10±1分钟，抽干，向反应器中加入1.0倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液，搅拌20±1分钟，抽干，得脱Fmoc保护树脂；用1.0倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂8次，每次2～4分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0022] (b)称取Fmoc‑AA‑OH和偶联剂加入容器中，0.5～1.0倍树脂体积的DMF溶解，冷浴条件下冷却，缓慢加入DIC，预活化5～15分钟，将上述预活化反应液加入到反应器中，20～30℃条件下反应120～180分钟，反应过程中每30±5分钟进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用1.0倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂3次，每次2～4分钟，抽干，如此循环，将所有氨基酸连接完，即得。

[0023] 进一步地，所述步骤(b)中Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑His(Trt)‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH，Fmoc‑Ile‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Pro‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH。

[0024] 进一步地，当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑His(Trt)‑OH时，偶联剂为HOOBt；当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH时，偶联剂为HOBt。

[0025] 本发明选用商业化易得的Fmoc保护氨基酸原料Fmoc‑AA‑OH，能够降低生产成本。

[0026] 进一步地，所述步骤S2制备全保护肽树脂时采用Fmoc‑Ser(tBu)‑OH进行Ser氨基酸位点的偶联，并在5号位Val氨基酸连接时，进行了换液操作所得产品效果最佳，这是由于换液使反应釜里的反应物浓度得到提高，同时副产物浓度降低，使反应向生产产物方向移动，可以得到更高的产率；

[0027] 进一步地，采用Fmoc‑Ser(tBu)‑OH进行Ser氨基酸位点的偶联时采用的偶联体系选自HOBt/DIC。

[0028] 进一步地，所述步骤S3将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中进行侧链保护基的切割，沉淀及洗涤、干燥的具体步骤为：

[0029] 1)将步骤S3所得全保护肽树脂加到切割液中，边加边搅拌，控制反应温度为25～35℃，搅拌反应2.5～3.5小时，切割完成后，用砂芯漏斗滤去树脂，收集滤液，树脂再用TFA洗涤，合并滤液，记录滤液体积；

[0030] 2)将收集的滤液缓慢的加入10倍体积的冷冻乙醚中，边加边搅拌，待肽链都析出后，离心或过滤得到粗品，然后用乙醚洗涤3次；

[0031] 3)将步骤2)得到的粗品转移至容器中进行干燥，真空干燥至粗品每2小时内重量变化率百分比小于1.0％。

[0032] 进一步地，所述步骤S3所述切割液包括三氟乙酸、茴香硫醚、1,2‑乙二硫醇、苯酚和水。进一步地，所述步骤S3所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:苯酚:水＝87.5‑90:1‑5:2.5‑3:2.5‑3:2.5‑3。

[0033] 进一步地，所述步骤S3所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:苯酚:水＝87.5:5:2.5:2.5:2.5。

[0034] 本发明的切割液可以使多肽从载体上有效地分离出来，以便进一步纯化和分析，其中，茴香硫醚可以增加表面张力和粘度来促进多肽的分离和沉淀，从而使多肽更易于分离和纯化。此外，茴香硫醚还具有一定的抗氧化作用，可以防止多肽在切割液中受到氧化损伤。1,2‑乙二硫醇保护多肽不受氧化或其他不利因素的影响，还可以在水溶液中降低表面张力，促进多肽的分离和纯化。苯酚的主要作用是增加切割液的粘度和表面张力，这有助于将多肽从固相载体上分离出来。此外，苯酚还可以中和切割液中的酸性，从而调节切割液的pH值，从而有助于多肽的分离和纯化。对全保护肽树脂进行侧链保护基的切割时容易产生氨基酸侧链保护基脱落不完全、肽键断裂、氧化等，此步骤产生的杂质较多，也比较复杂。本发明切割液中各组分共同作用可以使多肽从载体上有效地分离出来，减少杂质的产生，提高多肽粗品的纯度，以便进一步纯化和分析。

[0035] 进一步地，所述步骤S4将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化的具体步骤为：

[0036] (A)粗品溶解：取F1多肽粗品，用醋酸：乙腈：纯化水＝1：2：7(V:V:V)的溶液，将F1多肽粗品溶解至50mg/mL，然后用1.5μm孔径的滤膜过滤，得粗品溶液；

[0037] (B)色谱柱平衡上样：用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，然后将粗品溶液按100％比例上样；

[0038] (C)梯度洗脱：上样后先用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，直到醋酸峰被洗脱完全，再62％流动相A相和38％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，对样品进行梯度洗脱；

[0039] (D)样品收集：将产品目的峰对应的洗脱液分段收集到有编号的收集瓶中，保证每瓶体积一致，并在检测图谱中标记相应收集瓶编号；

[0040] (E)收集液检测：采用HPLC方法对纯化收集液进行检测分析，检测结束后，对图谱进行积分处理，按照面积归一法对样品纯度及杂质含量进行分析，收集符合标准的样品。

[0041] 进一步地，所述步骤S4粗品纯化时使用反相高效液相色谱法纯化，以颗粒大小为3μm的C18填料作为色谱柱的固定相，以体积比为1:1:100的三乙胺、磷酸和水为流动相A相，流动相B相由流动相A相和乙腈按体积比2:8组成。

[0042] 进一步地，纯化过程中使色谱柱柱温保持在50～55℃，在此色谱柱柱温条件下，可以改善主峰前后杂分离度；优选的，纯化过程中使色谱柱柱温保持在55℃，在此色谱柱柱温条件下，主峰前后杂质分离度最优。温度过高或过低，都无法很好的应用HPLC将主峰与杂质分开。进一步地，步骤(C)梯度洗脱时按照90分钟内，流动相B相的比例由38％升至58％的线性梯度对样品进行梯度洗脱，在此纯化梯度下，能显著改善前杂分离度，且能多分离出后杂，提高产品纯度。

[0043] 进一步地，所述步骤S5换盐纯化的具体步骤为：

[0044] (Ⅰ)平衡上样：用95％醋酸体系流动相A相和5％醋酸体系流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，然后将收集液和纯化水按1：1比例上样，再用32g/L醋酸溶液换盐平衡色谱柱，时间不少于30min；

[0045] (Ⅱ)梯度洗脱：换盐平衡后，用75％流动相A相和25％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，按照60分钟内，醋酸体系流动相B相的比例由25％升至55％的线性梯度，对样品进行梯度洗脱；

[0046] (Ⅲ)样品收集：将产品目的峰对应的洗脱液分段收集到有编号的收集瓶中，保证每瓶体积一致，并在检测图谱中标记相应收集瓶编号；

[0047] (Ⅳ)采用HPLC方法对纯化收集液进行检测分析，检测结束后，对图谱进行积分处理，按照面积归一法对样品纯度及杂质含量进行分析，收集符合标准的样品，检测方法与第一步纯化收集液检测一致。

[0048] 由于序列靠近N端部分是连续疏水性氨基酸，生产过程中容易发生缩聚，导致生产困难，本发明采用了分段合成，并用Fmoc‑Ser(tBu)‑OH进行丝氨酸位点的偶联，抑制了缩聚的发生，降低了生产难度，提高了F1多肽的产量，大大降低了杂质含量，显著提高了F1多肽的纯度。

[0049] 与现有技术相比，本发明具有以下优势：

[0050] (1)本发明发展和优化了对于F1多肽的合成、切割和纯化方法及流程，采用本发明能够降低生产成本，提高F1多肽的产量，大大降低杂质含量，显著提高F1多肽的纯度，纯度高达99.77％，有利于制药行业的大规模高纯度生产；

[0051] (2)本发明F1多肽的合成过程中只有5号位Val进行了强制换液操作，不需要每步都换液，不仅提高了产率而且节约了工业生产的成本。

附图说明

[0052] 图1为本发明实施例1制备的F1多肽的IR光谱图；

[0053] 图2为本发明实施例1制备的F1多肽的质谱图；

[0054] 图3为本发明实施例1制备的F1多肽的一级质谱图；

[0055] 图4为本发明实施例1制备的F1多肽的一级质谱去卷积图谱；

[0056] 图5为本发明实施例1制备的F1多肽的二级质谱图；

[0057] 图6为本发明实施例1制备的F1多肽的HPLC谱图。

具体实施方式

[0058] 以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。

[0059] 本发明中相关的名词解释参见下表1：

[0060] 表1：本发明中相关的名词解释

[0061] His 组氨酸Gly 甘氨酸
Glu 谷氨酸
Ala 丙氨酸
Pro 脯氨酸
Lys 赖氨酸
Leu 亮氨酸
Ser 丝氨酸
Val 缬氨酸
Ile 异亮氨酸
Fmoc 9‑芴甲氧羰基
HOOBt 3‑羟基‑1,2,3‑苯并三嗪‑4(3H)‑酮
HOBT 1‑羟基苯并三唑
DIC N,N‑二异丙基碳二亚胺
TFA 三氟乙酸
EDT 1,2‑乙二硫醇
TEA 三乙胺
NMM N‑甲基吗啡啉
DMF N，N‑二甲基甲酰胺
HBTU 苯并三氮唑‑N,N,N',N'‑四甲基脲六氟磷酸盐
ACN 乙腈

[0062] 如无特殊说明，本发明中涉及的相关的名词解释均采用现有技术中常规的解释。

[0063] 实施例1、F1多肽的制备

[0064] 步骤S1：Rink Amide MBHA树脂的制备

[0065] (1)配制5mmol MBHA树脂(取代度0.47mmol/g)置于带筛板固相合成反应器中，加入5％NMM/DMF(体积分数为5％的NMM的DMF溶液)，5％NMM/DMF与MBHA树脂的体积质量比为6mL/g，在室温下溶胀1h，抽干，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂2次，每次4分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0066] (2)称取15mmol Rink Amide Linker和14mmol HBTU加入容器中，1.0倍MBHA树脂体积的DMF溶解，冷浴条件下冷却(溶液温度15℃)，缓慢加入45mmol NMM，预活化10分钟，将上述预活化反应液加入到步骤(1)含有树脂的反应器中，室温下反应2.5小时，取样进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂4次，每次3分钟，抽干，即得。

[0067] 步骤S2：分两步制备全保护肽树脂

[0068] Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHAResin树脂

[0069] (1)根据F1多肽序列从C端到N端依次偶联相应的氨基酸，先合成得到

[0070] Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHAResin树脂，具体步骤为：

[0071] (a)将步骤S1所得Rink Amide MBHA树脂置于反应器中，向反应器中加入2.5倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液(体积分数为20％的哌啶的DMF溶液)，搅拌10分钟，抽干，向反应器中加入2.5倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液(体积分数为20％的哌啶的DMF溶液)，搅拌20分钟，抽干，得脱Fmoc保护树脂；用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂5次，每次3分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0072] (b)称取15mmol Fmoc‑AA‑OH和15mmol HOBT加入容器中，使用DMF溶解，冷浴条件下冷却，缓慢加入15mmol DIC，预活化10分钟，将上述预活化反应液加入到反应器中，室温条件下反应2.5小时，取样进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂4次，每次3分钟，抽干，如此循环，将所有氨基酸连接完，即得。

[0073] 所述步骤(b)中Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑His(Trt)‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH，Fmoc‑Ile‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Pro‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH。

[0074] 当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑His(Trt)‑OH时，偶联剂为HOOBt；当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH时，偶联剂为HOBt。

[0075] 其中，Fmoc‑AA‑OH/HOBt(HOOBt)/DIC＝3/3/3或5/5/5，His用HOOBt、树脂缩聚后用5eq。所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况如表2所示。

[0076] 表2：所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况

[0077]

[0078]

[0079] (2)取步骤(1)所得产物进行后续8个氨基酸位点的偶联，得到Fmoc‑Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，具体步骤为：

[0080] 取20％步骤(1)制得的Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂(即第一步产物摩尔比的20％用于第二步偶联反应)，进行后续氨基酸位点的连接工作，所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况如表3所示。

[0081] 表3：所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况

[0082]

[0083] 将所有氨基酸连接完，向反应器中加入1.0倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护，搅拌20分钟，抽干，用1.0倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂2次，第一次洗涤10分钟，第二次洗涤20分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性，即得全保护肽树脂

[0084] Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂。

[0085] 步骤S3：将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中进行侧链保护基的切割，沉淀及洗涤、干燥，得到F1多肽粗品，具体步骤为：

[0086] (1)将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中，切割液与全保护肽树脂的体积质量比为10mL/g，所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:苯酚:水＝87.5:5:2.5:2.5:2.5，边加边搅拌，控制反应温度为25℃，搅拌反应3小时，切割完成后，用砂芯漏斗滤去树脂，收集滤液，树脂再用TFA洗涤，合并滤液，记录滤液体积；

[0087] (2)将收集的滤液缓慢的加入10倍体积的冷冻乙醚中，边加边搅拌，待肽链都析出后，离心得到粗品，然后用乙醚洗涤4次；

[0088] (3)将步骤(2)得到的粗品转移至容器中进行干燥，真空干燥至粗品每2小时内重量变化率百分比小于1.0％。

[0089] 步骤S4：将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化、换盐纯化、冻干，即得F1多肽[0090] 将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化时使用反相高效液相色谱法纯化，以颗粒大小为3μm的C18填料作为色谱柱的固定相，色谱柱的规格为Luna 3μm C18 LC Column150×3mm，以体积比为1:1:100的三乙胺、磷酸和水为流动相A相，流动相B相由流动相A相和乙腈按体积比2:8组成，纯化过程中使色谱柱柱温保持在55℃，具体步骤为：

[0091] (A)粗品溶解：取F1多肽粗品，载样量为18.3mg样品/g填料，用醋酸：乙腈：纯化水＝1：2：7(V:V:V)的溶液，将F1多肽粗品溶解至50mg/mL，然后用1.5μm孔径的滤膜过滤，得粗品溶液；

[0092] (B)色谱柱平衡上样：用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，流动相A相为TEA/H3PO4/H2O＝1/1/100(V/V/V)，流动相B相为流动相A相/ACN＝2/8(V/V)，平衡时间不少于8分钟，然后将粗品溶液按100％比例上样；

[0093] (C)梯度洗脱：上样后先用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，直到醋酸峰被洗脱完全，再62％流动相A相和38％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，然后按照90分钟内，流动相B相的比例由38％升至58％的线性梯度，对样品进行梯度洗脱；

[0094] (D)样品收集：将产品目的峰对应的洗脱液分段收集到有编号的收集瓶中，保证每瓶体积一致，并在检测图谱中标记相应收集瓶编号；

[0095] (E)收集液检测：采用HPLC方法对纯化收集液进行检测分析，检测条件及方法设定如表4所示，检测结束后，对图谱进行积分处理，按照面积归一法对样品纯度及杂质含量进行分析，收集符合标准的样品。

[0096] 表4：检测条件及方法

[0097]

[0098] 所述步骤S4换盐纯化的具体步骤为：

[0099] (Ⅰ)平衡上样：用95％醋酸体系流动相A相和5％醋酸体系流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，所述醋酸体系流动相A相由醋酸和纯化水按体积比5：1000混合而成，所述醋酸体系流动相A相由醋酸和纯化水按体积比5：1000混合而成，所述醋酸体系流动相B相由醋酸、纯化水和乙腈按体积比5：500：800混合而成，平衡时间不少于8分钟，然后将收集液和纯化水按1：1比例上样，再用32g/L醋酸溶液换盐平衡色谱柱，时间不少于30min；(Ⅱ)梯度洗脱：换盐平衡后，用75％流动相A相和25％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，按照60分钟内，醋酸体系流动相B相的比例由25％升至55％的线性梯度，对样品进行梯度洗脱；

[0100] (Ⅲ)样品收集：将产品目的峰对应的洗脱液分段收集到有编号的收集瓶中，保证每瓶体积一致，并在检测图谱中标记相应收集瓶编号；

[0101] (Ⅳ)采用HPLC方法对纯化收集液进行检测分析，检测结束后，对图谱进行积分处理，按照面积归一法对样品纯度及杂质含量进行分析，收集符合标准的样品，检测方法与第一步纯化收集液检测一致。

[0102] 实施例2、F1多肽的制备

[0103] 步骤S1：Rink Amide MBHA树脂的制备

[0104] (1)称取5mmol MBHA树脂(取代度0.54mmol/g)置于带筛板固相合成反应器中，加入5％NMM/DMF(体积分数为5％的NMM的DMF溶液)，5％NMM/DMF与MBHA树脂的体积质量比为5mL/g，在室温下溶胀1h，抽干，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂2次，每次3分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0105] (2)称取15mmol Rink Amide Linker和15mmol HOBT加入容器中，1.0倍MBHA树脂体积的DMF溶解，冷浴条件下冷却，缓慢加入15mmol DIC，预活化5分钟，将上述预活化反应液加入到步骤(1)含有树脂的反应器中，室温下反应2h，取样进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂4次，每次3分钟，抽干，即得。

[0106] 步骤S2：分两步制备全保护肽树脂

[0107] Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Va l‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂

[0108] (1)根据F1多肽序列从C端到N端依次偶联相应的氨基酸，先合成得到

[0109] Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，具体步骤为：

[0110] (a)将步骤S1所得Rink Amide MBHA树脂置于反应器中，向反应器中加入2.5倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液(体积分数为20％的哌啶的DMF溶液)，搅拌10分钟，抽干，向反应器中加入2.5倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液，搅拌20分钟，抽干，得脱Fmoc保护树脂；用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂5次，每次3分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0111] (b)称取15mmol Fmoc‑AA‑OH和15mmol HOBT加入容器中，使用DMF溶解，冷浴条件下冷却，缓慢加入15mmol DIC，预活化5分钟，将上述预活化反应液加入到反应器中，室温条件下反应2小时，取样进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂4次，每次3分钟，抽干，如此循环，将所有氨基酸连接完，即得。

[0112] 所述步骤(b)中Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑His(Trt)‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH，Fmoc‑Ile‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Pro‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH。

[0113] 当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑His(Trt)‑OH时，偶联剂为HOOBt；当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH时，偶联剂为HOBt。

[0114] 其中，Fmoc‑AA‑OH/HOBt(HOOBt)/DIC＝3/3/3或5/5/5，His用HOOBt、树脂缩聚后用5eq。所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况与实施例1的表2相同。

[0115] (2)取步骤(1)所得产物进行后续8个氨基酸位点的偶联，得到Fmoc‑Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，具体步骤为：

[0116] 取20％步骤(1)制得的Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂(即第一步产物摩尔比的20％用于第二步偶联反应)，进行后续氨基酸位点的连接工作，所用氨基酸物料、偶联试剂及反应与实施例1的表3相同。

[0117] 将所有氨基酸连接完，向反应器中加入1.0倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护，搅拌20分钟，抽干，用1.0倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂2次，第一次洗涤10分钟，第二次洗涤20分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性，即得全保护肽树脂

[0118] Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂。

[0119] 步骤S3：将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中进行侧链保护基的切割，沉淀及洗涤、干燥，得到F1多肽粗品，具体步骤为：

[0120] (1)将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中，切割液与全保护肽树脂的体积质量比为10mL/g，所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:苯酚:水＝90:2.5:2.5:2.5:2.5，边加边搅拌，控制反应温度为20℃，搅拌反应3小时，切割完成后，用砂芯漏斗滤去树脂，收集滤液，树脂再用TFA洗涤，合并滤液，记录滤液体积；

[0121] (2)将收集的滤液缓慢的加入10倍体积的冷冻乙醚中，边加边搅拌，待肽链都析出后，离心得到粗品，然后用乙醚洗涤4次；

[0122] (3)将步骤(2)得到的粗品转移至容器中进行干燥，真空干燥至粗品每2小时内重量变化率百分比小于1.0％。

[0123] 步骤S4：将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化、换盐纯化、冻干，即得F1多肽将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化时使用反相高效液相色谱法纯化，以颗粒大小为3μm的C18填料作为色谱柱的固定相，色谱柱的规格为Luna 3μm C18 LC Column150×3mm，以体积比为1:1:100的三乙胺、磷酸和水为流动相A相，流动相B相由流动相A相和乙腈按体积比2:8组成，纯化过程中使色谱柱柱温保持在50℃，具体步骤为：

[0124] (A)粗品溶解：取F1多肽粗品，载样量为18.3mg样品/g填料，用醋酸：乙腈：纯化水＝1：2：7(V:V:V)的溶液，将F1多肽粗品溶解至50mg/mL，然后用1.5μm孔径的滤膜过滤，得粗品溶液；

[0125] (B)色谱柱平衡上样：用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，流动相A相为TEA/H3PO4/H2O＝1/1/100(V/V/V)，流动相B相为流动相A相/ACN＝2/8(V/V)，平衡时间不少于8分钟，然后将粗品溶液按100％比例上样；

[0126] (C)梯度洗脱：上样后先用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，直到醋酸峰被洗脱完全，再62％流动相A相和38％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，然后按照90分钟内，流动相B相的比例由38％升至58％的线性梯度，对样品进行梯度洗脱；

[0127] (D)样品收集：将产品目的峰对应的洗脱液分段收集到有编号的收集瓶中，保证每瓶体积一致，并在检测图谱中标记相应收集瓶编号；

[0128] (E)收集液检测：采用HPLC方法对纯化收集液进行检测分析，检测条件及方法设定与实施例1中表4相同，检测结束后，对图谱进行积分处理，按照面积归一法对样品纯度及杂质含量进行分析，收集符合标准的样品。

[0129] 所述步骤S4换盐纯化的具体步骤与实施例1相同。

[0130] 实施例3、F1多肽的制备

[0131] 步骤S1：Rink Amide MBHA树脂的制备

[0132] (1)称取5mmol MBHA树脂(取代度0.62mmol/g)置于带筛板固相合成反应器中，加入5％NMM/DMF(体积分数为5％的NMM的DMF溶液)，5％NMM/DMF与MBHA树脂的体积质量比为8mL/g，在室温下溶胀1h，抽干，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂2次，每次3分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0133] (2)称取15mmol Rink Amide Linker和15mmol HOBT加入容器中，1.0倍MBHA树脂体积的DMF溶解，冷浴条件下冷却，缓慢加入15mmol DIC，预活化15分钟，将上述预活化反应液加入到步骤(1)含有树脂的反应器中，室温下反应3h，取样进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂4次，每次3分钟，抽干，即得。

[0134] 步骤S2：分两步制备全保护肽树脂

[0135] Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂

[0136] (1)根据F1多肽序列从C端到N端依次偶联相应的氨基酸，先合成得到

[0137] Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，具体步骤为：

[0138] (a)将步骤S1所得Rink Amide MBHA树脂置于反应器中，向反应器中加入2.5倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液，搅拌10分钟，抽干，向反应器中加入2.5倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液(体积分数为20％的哌啶的DMF溶液)，搅拌20分钟，抽干，得脱Fmoc保护树脂；用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂5次，每次3分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性；

[0139] (b)称取15mmol Fmoc‑AA‑OH和15mmol HOBT加入容器中，使用DMF溶解，冷浴条件下冷却，缓慢加入15mmol DIC，预活化15分钟，将上述预活化反应液加入到反应器中，室温条件下反应3小时，取样进行茚三酮检测，如果连续两次茚三酮检测呈阴性，且到规定反应时间，抽干反应液，用2.5倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂4次，每次3分钟，抽干，如此循环，将所有氨基酸连接完，即得。

[0140] 所述步骤(b)中Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH，Fmoc‑His(Trt)‑OH，Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH，Fmoc‑Ala‑OH，Fmoc‑Ile‑OH，Fmoc‑Val‑OH，Fmoc‑Pro‑OH，Fmoc‑Lys(Boc)‑OH。

[0141] 当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑His(Trt)‑OH时，偶联剂为HOOBt；当Fmoc‑AA‑OH为Fmoc‑Leu‑OH、Fmoc‑Glu(OtBu)‑OH、Fmoc‑Ala‑OH、Fmoc‑Ile‑OH、Fmoc‑Val‑OH、Fmoc‑Pro‑OH、Fmoc‑Lys(Boc)‑OH时，偶联剂为HOBt。

[0142] 其中，Fmoc‑AA‑OH/HOBt(HOOBt)/DIC＝3/3/3或5/5/5，His用HOOBt、树脂缩聚后用5eq。所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况与实施例1的表2相同。

[0143] (2)取步骤(1)所得产物进行后续8个氨基酸位点的偶联，得到Fmoc‑Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂，具体步骤为：

[0144] 取20％步骤(1)制得的Fmoc‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂(即第一步产物摩尔比的20％用于第二步偶联反应)，进行后续氨基酸位点的连接工作，所用氨基酸物料、偶联试剂及反应与实施例1的表3相同。

[0145] 将所有氨基酸连接完，向反应器中加入1.0倍树脂床层体积的20％(v/v)的哌啶/DMF溶液脱Fmoc保护，搅拌20分钟，抽干，用1.0倍树脂床层体积的DMF洗涤树脂2次，第一次洗涤10分钟，第二次洗涤20分钟，抽干，取少量树脂做茚三酮检测，结果应呈阳性，即得全保护肽树脂

[0146] Gly‑Leu‑Leu‑Ser(tBu)‑Val‑Leu‑Gly‑Ser(tBu)‑Val‑Ala‑Lys(Boc)‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Leu‑Pro‑His(Trt)‑Val‑Val‑Pro‑Val‑Ile‑Ala‑Glu(OtBu)‑His(Trt)‑Leu‑Rink Amide MBHA Resin树脂。

[0147] 步骤S3：将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中进行侧链保护基的切割，沉淀及洗涤、干燥，得到F1多肽粗品，具体步骤为：

[0148] (1)将步骤S2所得全保护肽树脂加到切割液中，切割液比例为10mL/g，所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:苯酚:水＝90:1:3:3:3，边加边搅拌，控制反应温度为30℃，搅拌反应3小时，切割完成后，用砂芯漏斗滤去树脂，收集滤液，树脂再用TFA洗涤，合并滤液，记录滤液体积；

[0149] (2)将收集的滤液缓慢的加入10倍体积的冷冻乙醚中，边加边搅拌，待肽链都析出后，离心得到粗品，然后用乙醚洗涤4次；

[0150] (3)将步骤(2)得到的粗品转移至容器中进行干燥，真空干燥至粗品每2小时内重量变化率百分比小于1.0％。

[0151] 步骤S4：将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化、换盐纯化、冻干，即得F1多肽将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化时使用反相高效液相色谱法纯化，以颗粒大小为3μm的C18填料作为色谱柱的固定相，色谱柱的规格为Luna 3μm C18 LC Column150×3mm，以体积比为1:1:100的三乙胺、磷酸和水为流动相A相，流动相B相由流动相A相和乙腈按体积比2:8组成，纯化过程中使色谱柱柱温保持在55℃，具体步骤为：

[0152] (A)粗品溶解：取F1多肽粗品，载样量为18.3mg样品/g填料，用醋酸：乙腈：纯化水＝1：2：7(V:V:V)的溶液，将F1多肽粗品溶解至50mg/mL，然后用1.5um孔径的滤膜过滤，得粗品溶液；

[0153] (B)色谱柱平衡上样：用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，流动相A相为TEA/H3PO4/H2O＝1/1/100(V/V/V)，流动相B相为流动相A相/ACN＝2/8(V/V)，平衡时间不少于8分钟，然后将粗品溶液按100％比例上样；

[0154] (C)梯度洗脱：上样后先用95％流动相A相和5％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，直到醋酸峰被洗脱完全，再62％流动相A相和38％流动相B相的混合溶液平衡色谱柱，平衡时间不少于8分钟，然后按照90分钟内，流动相B相的比例由38％升至58％的线性梯度，对样品进行梯度洗脱；

[0155] (D)样品收集：将产品目的峰对应的洗脱液分段收集到有编号的收集瓶中，保证每瓶体积一致，并在检测图谱中标记相应收集瓶编号；

[0156] (E)收集液检测：采用HPLC方法对纯化收集液进行检测分析，检测条件及方法设定与实施例1中表4相同，检测结束后，对图谱进行积分处理，按照面积归一法对样品纯度及杂质含量进行分析，收集符合标准的样品。

[0157] 所述步骤S4换盐纯化的具体步骤与实施例1相同。

[0158] 对比例1、F1多肽的制备以取代度为0.47mmol/g的MBHA Resin作为起始物料，根据F1多肽序列从C端到N端依次偶联相应的氨基酸，第29位到第9位所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况与实施例1的表2相同。在进行后续氨基酸连接时，采用表5的氨基酸物料以及偶联试剂、投料比的情况下，只有采用表5中所列的反应时间才能完成偶联反应。本发明实施例1与对比例1肽树脂的连接情况比较如表6所示。

[0159] 表5：对比例1所用氨基酸物料、偶联试剂及反应情况

[0160]

[0161]

[0162] 表6：本发明实施例1与对比例1肽树脂的连接情况比较

[0163]

[0164]

[0165] 由表6本发明实施例1与对比例1两次肽树脂的连接情况对比可知，采用本发明的氨基酸连接方式明显优于对比例1，需要重复连接的氨基酸位点明显减少，且反应时间大大缩短。

[0166] 对比例2、F1多肽的制备

[0167] 所述F1多肽的制备方法与实施例1类似。

[0168] 与实施例1的区别在于，所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:三异丙基硅烷:水＝87.5:5:2.5:2.5:2.5。

[0169] 对比例3、F1多肽的制备

[0170] 所述F1多肽的制备方法与实施例1类似。

[0171] 与实施例1的区别在于，所述切割液为：三氟乙酸:茴香硫醚:1,2‑乙二硫醇:苯酚:水＝85:5:5:3:2。

[0172] 对比例4、F1多肽的制备

[0173] 所述F1多肽的制备方法与实施例1类似。

[0174] 与实施例1的区别在于，纯化过程中使色谱柱柱温保持在45℃。

[0175] 对比例5、F1多肽的制备

[0176] 所述F1多肽的制备方法与实施例1类似。

[0177] 与实施例1的区别在于，将步骤S3所得F1多肽粗品进行粗品纯化的具体步骤(C)梯度洗脱时按照60分钟内，流动相B相的比例由35％升至65％的线性梯度，对样品进行梯度洗脱。

[0178] 试验例一、F1多肽的表征

[0179] 1.1红外光谱检测

[0180] 采用傅里叶变换红外光谱仪记录样品傅里叶变换红外光谱图。本发明实施例1制备的F1多肽的IR光谱图如图1所示。红外光谱峰归属表如表7所示。

[0181] 表7：红外光谱峰归属表

[0182] 波数(cm‑1) 相应基团3299.6 N‑H，O‑H的伸缩振动
2963.2，2875.6 饱和C‑H的伸缩振动
1654.0 C＝O的伸缩振动(酰胺I带)
1540.3 N‑H的弯曲振动和C‑N的伸缩振动(酰胺II带)
1468.6，1449.0 苯环的骨架振动
1235.6 N‑H的弯曲振动和C‑N的伸缩振动(酰胺III带)

[0183] 由图1以及表7可知，在F1多肽的IR光谱图中，3299.6cm‑1处特征峰主要来源于N‑H，‑1 ‑1O‑H的伸缩振动，2963.2，2875.6cm 处特征峰主要来源于饱和C‑H的伸缩振动，1654.0cm‑1
处特征峰主要来源于C＝O的伸缩振动(酰胺I带)，1540.3cm 处特征峰主要来源于N‑H的弯‑1
曲振动和C‑N的伸缩振动(酰胺II带)，1468.6，1449.0cm 处特征峰主要来源于苯环的骨架振动，1235.6处特征峰主要来源于N‑H的弯曲振动和C‑N的伸缩振动(酰胺III带)。

[0184] 1.2质谱分析

[0185] 取本发明实施例1所得F1多肽适量，采用电喷雾电离源(ESI)，正离子检测方式，质谱扫描范围为290～3200，得到本发明实施例1制备的F1多肽的质谱图如图2所示，该图显示F1多肽的多电荷峰，通过加权计算得本发明F1多肽的平均分子量为3030.85，与理论的平均分子量3030.65一致。

[0186] 1.3氨基酸比值检测

[0187] 采用放行检测方法对本发明实施例1所得F1多肽的氨基酸比值进行检测，检测结果如表8所示。

[0188] 表8：氨基酸比值检测结果

[0189]

[0190]

[0191] 表8的结果显示，本发明实施例1所得F1多肽的氨基酸比值与理论的比值一致。

[0192] 1.4序列分析

[0193] 通过Q‑TOF飞行质谱法对供试品本发明实施例1所得F1多肽进行全序列检测，对本发明制备的F1多肽进行一级质谱测试，本发明实施例1制备的F1多肽的一级质谱图如图3所示，本发明实施例1制备的F1多肽的一级质谱去卷积图谱如图4所示。之后供试品目标峰进行二级质谱测试，本发明实施例1制备的F1多肽的二级质谱图如图5所示。使用MassHunter对二级测试数据匹配分析，对供试品目标峰二级质谱数据进行二级检索分析，MS/MS图谱峰列表如表9所示。

[0194] 表9：MS/MS图谱峰列表

[0195]

[0196]

[0197]

[0198]

[0199]

[0200]

[0201]

[0202]

[0203]

[0204]

[0205] 由图3‑5以及表9的结果可以证明，本发明实施例1所得F1多肽经QTOF质谱检测得到的碎片峰序列与理论碎片峰序列匹配一致，且误差很小，这足以证明本发明实施例1所得F1多肽的氨基酸序列与理论序列一致。

[0206] 试验例二、F1多肽的有关物质及纯度的测定

[0207] 2.1粗品纯度的测定

[0208] 采用HPLC方法对本发明实施例1、实施例2、实施例3、对比例2、对比例3步骤S4所得F1多肽粗品的纯度进行测定，结果如表10所示。

[0209] 采用HPLC方法对本发明实施例1、实施例2、实施例3、对比例4、对比例5所得F1多肽进行测定，结果如表11所示。本发明实施例1制备的F1多肽的HPLC谱图如图6所示，F1多肽的HPLC谱图各峰信息如表12所示。

[0210] 表10：F1多肽粗品的纯度测定结果

[0211] 项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例2 对比例3纯度(％) 67.81 65.01 64.40 64.31 60.17

[0212] 表11：F1多肽的纯度测定结果

[0213]项目 实施例1 实施例2 实施例3 对比例4 对比例5
纯度(％) 99.77 98.80 98.42 95.80 96.90
最大单杂(％) 0.11 0.44 0.50 1.55 0.58
总杂(％) 0.23 1.20 1.58 4.20 3.10

[0214] 表12：F1多肽的HPLC谱图各峰信息

[0215]

[0216]

[0217] 由表10可以看出，本发明步骤S4所得F1多肽粗品的纯度高，且与对比例2、对比例3相比，本发明所得F1多肽粗品的纯度更高。由表11可以看出，本发明所得F1多肽的纯度高，且与对比例4、对比例5相比，本发明所得F1多肽的纯度更高。由图6以及表12可以看出，本发明实施例1所得F1多肽的纯度高达99.77％。本发明大大降低了杂质含量，显著提高了F1多肽的纯度，有利于制药行业的大规模高纯度生产。