萤火虫萤光素酶突变体、蛋白质、核酸、重组载体、重组菌、试剂组合物及制备方法

摘要

本申请涉及生物技术领域，具体公开了萤火虫萤光素酶突变体、蛋白质、核酸、重组载体、重组菌、试剂组合物及制备方法。本申请通过对萤火虫萤光素酶基因进行了随机突变，并进行发光强度及半衰期的筛选，最终成功筛选得到一种高活性、高稳定性的萤火虫萤光素酶突变体，进一步优化了通过ATP检测手段检测活细胞的方法和试剂盒。

权利要求

1.一种萤火虫萤光素酶突变体，其特征在于：SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的萤火虫荧光素酶第193位或第367位氨基酸进行了突变，第193位由丝氨酸Ser S突变为异亮氨酸Ile I或第367位由亮氨酸Leu L突变为异亮氨酸Ile I，氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示。

2.一种核酸分子，其特征在于：包括核苷酸序列是编码SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：3所示的DNA分子。

3.一种重组载体，其特征在于：包括权利要求2所述的核酸分子。

4.一种重组菌，其特征在于：包括权利要求3所述的重组载体或基因组中整合有权利要求2所述的核酸分子。

5.一种试剂组合物，其特征在于：包括权利要求1中的萤火虫萤光素酶突变体和萤火虫萤光素底物。

6.根据权利要求5所述的试剂组合物，其特征在于: 还包括镁离子。

7.一种用于定量检测样品中ATP含量或浓度的分析系统，其特征在于: 包括权利要求5的试剂组合物及含有ATP的样品。

说明书

萤火虫萤光素酶突变体、蛋白质、核酸、重组载体、重组菌、试

剂组合物及制备方法

技术领域

[0001] 本申请涉及生物技术领域，更具体地说，它涉及一种萤火虫萤光素酶突变体、蛋白质、核酸、重组载体、重组菌、试剂组合物及制备方法。

背景技术

[0002] 萤火虫萤光素酶是一种能够在三磷酸腺苷（ATP）、二价金属离子如镁离子和氧气存在的情况下催化萤火虫萤光素底物并使其产生生物发光的蛋白酶。因其独特的生物发光特征以及非放射性优势，广泛应用于原核和真核细胞，转基因植物和动物，以及无细胞检测系统。

[0003] ATP是生物体内最直接的能量来源，检测和量化细胞内ATP水平是评估细胞健康状况的首选方法。萤光素酶‑萤光素检测系统广泛应用于药物研发领域及环境中微生物污染ATP检测。随着生物技术的飞速发展以及高通量药物筛选技术的成熟，需要更高效的细胞活力分析系统。

发明内容

[0004] 为了提高活性、稳定性、精确性，本申请提供了萤火虫萤光素酶突变体、蛋白质、核酸、重组载体、重组菌、试剂组合物及制备方法。

[0005] 第一方面，本申请提供了一种萤火虫萤光素酶突变体，采用如下的技术方案：

[0006] 一种萤火虫萤光素酶突变体，对SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的萤火虫萤光素酶，选自下列位点进行突变：第193位由丝氨酸Ser S突变为异亮氨酸Ile I 或第367位由亮氨酸Leu L突变异亮氨酸Ile I，如序列表中的SEQ ID NO: 2或SEQ ID NO: 3。

[0007] 第二方面，本申请提供了一种蛋白质，采用如下的技术方案：

[0008] 一种蛋白质，为如下（a1）‑（a3）中任一种：

[0009] （a1）在以下位点或位点组合发生突变的酶，所述位点为SEQ ID NO: 1所示氨基酸序列的第193位和第367位；

[0010] （a2）将（a1）酶的氨基酸序列经过第193位和/或第367位氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加氨基酸残基而形成的，且具有（a1）酶的功能/活性的由（a1）衍生的酶；

[0011] 所述一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加为不超过10个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过9个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过8个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过7个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过6个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过5个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过4个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过3个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过2个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加，或不超过1个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加。

[0012] （a3）将（a1）或（a2）突变的氨基酸序列的N端或/和C端连接标签序列或酶切位点序列形成的多肽及融合蛋白质。所述标签是指利用DNA体外重组技术，与目的蛋白一起融合表达的一种多肽或者蛋白，以便于目的蛋白的表达、检测、示踪和/或纯化。所述标签可为Flag标签、His标签、HA标签、GST标签和/或SUMO标签等。

[0013] 上述（a2）或（a3）中的蛋白质可人工合成，也可先人工基因合成其编码核酸分子，再进行宿主表达得到。

[0014] 在本申请的另一方面，上述任一所述蛋白质具有酶的功能/活性，包括与SEQ ID NO: 1酶的活性相比，具有其至少75％（例如75%，80%，85%，90%，95%，100%）发光活性。

[0015] 第三方面，本申请提供了一种核酸分子，采用如下的技术方案：

[0016] 一种核酸分子，包括下述（b1）或（b2）中的核酸分子：

[0017] （b1）核苷酸序列是编码上述蛋白质所示DNA分子；

[0018] （b2）与（b1）所述的核苷酸序列具有至少95％（例如95%，100%） 的同一性且编码上述蛋白质的DNA分子；

[0019] 其中，所述核酸分子可以是DNA也可以是RNA，所述核酸分子为编码所述蛋白质的基因及其调控序列形成的核酸分子。

[0020] 第四方面，本申请提供了一种重组载体，采用如下的技术方案：

[0021] 一种重组载体，包含上述核酸分子。进一步的，所述重组载体为原核表达载体pET‑28a（+）。

[0022] 第五方面，本申请提供了一种重组菌，采用如下的技术方案：

[0023] 一种重组菌，包括上述的重组载体或基因组中整合有所述的核酸分子，所述表达菌包括细菌或真菌。进一步的，所述细菌可为大肠杆菌BL21（DE3），包括将编码上述蛋白质的重组载体导入大肠杆菌后得到的重组菌。

[0024] 在本申请的另一方面，还提供了制备上述蛋白质的方法。进一步的，本申请提供的制备上述蛋白质的方法，优选如下步骤：将上述重组载体转化宿主菌中，将重组菌在含有卡那抗生素的LB液体培养基进行发酵培养至OD600nm＝0.8左右加入0.5mM IPTG，16℃、180 rpm/min 低温诱导过夜。

[0025] 在本申请的另一方面，提供了一种试剂组合物和/或试剂盒，包括上述蛋白质，对应于SEQ ID NO:1所示的萤火虫萤光素酶，对选自下组的位点或位点组合进行突变：第193位或第367位。

[0026] 第六方面，本申请提供了一种萤火虫萤光素酶突变体的制备方法，采用如下的技术方案：

[0027] 一种萤火虫萤光素酶突变体的制备方法，是以人工合成的SEQ ID NO: 1核苷酸序列为模板，通过随机突变试剂盒，建立随机突变体文库，将突变体文库克隆至原核表达载体中，进一步转入BL21（DE3）感受态细胞诱导其表达，培养物经裂解，检测，计算每个突变体的RLU值，选择比值最高的样本，即得突变体萤光素酶。

[0028] 第七方面，本申请提供了一种试剂组合物，采用如下的技术方案：

[0029] 一种试剂组合物，包括上述萤火虫萤光素酶突变体蛋白质以及萤火虫萤光素底物。

[0030] 还包括镁离子，所述镁离子包括硫酸镁、氯化镁、葡萄糖酸镁、醋酸镁、溴化镁以及碳酸镁等。进一步的，在任何情况下，镁复合物必须发生解离以使镁离子可用于萤光素酶，而不干扰萤光素酶‑萤光素反应。

[0031] 还含有一个或多个附加成分，包括：缓冲液、盐、蛋白酶抑制剂、细胞裂解剂、洗涤剂、ATP酶抑制剂、ATP生成酶抑制剂、ATP提取剂、ConA、硫醇试剂、金属离子螯合剂等。

[0032] 附加成分中包括一个或多个合适的缓冲液。可以考虑任何不明显干扰萤光素酶‑萤光素反应的缓冲液，即适宜工作溶液的pH，优选的pH范围在约pH 4.5和约pH 9.0之间（例如，约pH 6.0和约pH 8.0（例如，6.0、6.2、6.4、6.6、6.8、7.0、7.2、7.4、7.6、7.8、8.0以及它们之间的范围））。合适的缓冲液包括MES、柠檬酸缓冲液、磷酸盐缓冲液（PBS）、4‑羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）、哌嗪‑1，4‑二乙磺酸（PIPES）、硼酸盐和本领域技术人员了解的可能合适的任何其它缓冲液。

[0033] 附加成分中包括一个或多个消泡剂。消泡剂以防止体系泡沫干扰生物发光的检测，特别是在量化发光的应用中。消泡剂，如MAZU，可能是有机的或硅酮基的。消泡剂的选择取决于它们在不干扰萤光素酶‑萤光素反应的情况下消除泡沫的能力。

[0034] 附加成分中包括一个或多个ATP酶抑制剂的成分，可在溶液中任选地包含或替代其他功能成分，如缓冲液、消泡剂等。该组件可以作为工作溶液或浓缩物提供。进一步的，ATP酶抑制剂是带电基团的洗涤剂（例如，阳离子洗涤剂（例如，DTAB（十二烷基三甲基溴化铵）、CTAB（十六烷基四甲基铵）、苯扎氯铵、苯扎溴铵等），

[0035] 阴离子洗涤剂（如脱氧胆酸盐或SDS）或两性离子洗涤剂（如十二烷基二甲基甜菜碱等））。

[0036] 附加成分中包括ATP生成酶抑制剂的成分。进一步的，ATP生成酶抑制剂包括氟化钠，它在浓度至少为1 mM、2 mM、5 mM、10 mM、 20 mM、50 mM、100 mM之间的范围下有用。其他的ATP生成酶的抑制剂包括但不限于，钒酸盐、4‑硝基苯磷酸二钠盐（p‑NPP）和焦磷酸钠等。

[0037] 附加成分中包括的细胞裂解剂和/或ATP提取剂，在定量检测细胞活力/细胞内ATP的实施例中，可以提供试剂来裂解细胞和/或从细胞中释放ATP。进一步的，包括非离子洗涤剂（例如，Triton系列洗涤剂）、阳离子、阴离子和两性离子洗涤剂、胆盐、尿素、硫脲，以及任何其他破坏细胞膜的试剂，包括细菌内溶酶；或者包括任何允许从细胞中提取ATP的试剂（例如，CTAB）。

[0038] 附加成分中包括一种或多种蛋白稳定剂，进一步的，合适的稳定剂包括蛋白质（如牛血清白蛋白、明胶等），洗涤剂（例如，非离子型洗涤剂，如THESIT）等。

[0039] 附加成分中包括已知能增强萤光信号以及发光持续时间的物质，如辅酶A（CoA）、硫醇试剂（如二硫苏糖醇）和金属离子螯合剂（如EDTA和EGTA）、蛋白酶抑制剂或盐（如氯化钠、氯化钾、硫酸钠、碳酸氢钠、磷酸二氢钠等）。

[0040] 试剂组合物和/或试剂盒的其他组件包含在一个或多个容器中。进一步的，试剂组合物的成分包含在单个容器中，以单组分形式呈现，或者试剂组合物的成分包含在多个容器中，以双组份或多组分形式呈现。

[0041] 试剂组合物和/或试剂盒被提供在任何种类的容器中，以便延长不同组分的保存期。进一步的，容器可以包括任何合适的材料，如玻璃、有机聚合物，如聚碳酸酯、聚苯乙烯、陶瓷、金属或通常用于保存试剂的任何其他材料。进一步的，合适的容器的例子包括壶、瓶子、信封、试管、小瓶、烧瓶、瓶子、注射器等。

[0042] 检测样品是含有或被怀疑含有ATP或ATP类似物的任何对象，如细胞裂解液、完整的细胞、活检、食物、饮料、水、在诸如动物、植物或无生命物体的表面擦拭的拭子等。进一步的，细胞或细胞裂解物可以来自任何生物体，原核生物或真核生物。进一步的，真核细胞可能来自植物、动物、真菌、昆虫等，或者是从这些生物体中培养出来的细胞。

[0043] 第八方面，本申请提供了一种用于定量检测样品中ATP含量的分析系统，采用如下的技术方案：

[0044] 一种用于定量检测样品中ATP含量或浓度的分析系统，包括试剂组合物及含有ATP的样品。

[0045] 样品中ATP含量、浓度的检测方法，包括：

[0046] （a）在样品中加入试剂组合物；

[0047] （b）定量样品的发光值；

[0048] （c）将发光与标准质控品进行比较，计算样品中ATP的含量或浓度。

[0049] 综上所述，本申请具有以下有益效果：

[0050] 1、本申请通过对萤火虫萤光素酶基因进行了随机突变，并进行发光强度及半衰期的筛选，最终成功筛选得到一种高活性、高稳定性的萤火虫萤光素酶。

[0051] 2、本申请采用萤火虫萤光素酶突变体和萤火虫萤光素底物构成的试剂盒对ATP含量进行检测，提高了检测的灵敏度和精确度。

附图说明

[0052] 图1为不同萤光素酶（未突变、S193I和L367I突变体）检测活性对比图；

[0053] 图2为不同萤光素酶（未突变、S193I和L367I突变体）与ATP标准品的线性关系及检测信号强度对比图；

[0054] 图3为不同萤光素酶（未突变、S193I和L367I突变体）与HEK293细胞活力的线性关系及检测信号强度对比图；

[0055] 图4为不同萤光素酶（未突变、S193I和L367I突变体）对于不同细胞系的检测信号强度对比图；

[0056] 图5为不同萤光素酶（未突变、S193I和L367I突变体）对于ATP标准品的检测信号半衰期对比图；

[0057] 图6为不同萤光素酶（未突变、S193I和L367I突变体）对于细胞的检测信号半衰期对比图。

具体实施方式

[0058] 本申请给出的实施例仅为了阐明本申请，而不是为了限制本申请的范围。描述的实施例的实践或测试中可以使用类似或等效的任何方法和材料，本申请不限于本文所描述的特定分子、组合物、方法或方案，因为这些可能根据常规实验和优化而变化。

[0059] 以下实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0060] 术语

[0061] 除非另有定义，本申请中使用的所有技术和科学术语都与本申请所属领域的普通技能人员通常理解的含义相同，例如，参考“萤光素酶”是指本领域技术人员已知的一种或多种萤光素酶及其类似物等。

[0062] 正如在这里使用的，术语“增强”是指相对于未突变萤光素酶的改进。例如，当用于描述萤光素酶突变体的特性（如发光、信号稳定性、生物相容性、蛋白质稳定性（如酶稳定性）或蛋白质表达）时，“增强”指的是与参考萤光素酶相比的改进（如1%、2%、5%、5%、20%、20%、50%、75%、2%、3倍、4倍、5倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍或以上），例如该萤光素酶的天然/野生型版本SEQ ID NO:1。一种突变的萤光素酶可能表现出一种或多种“增强发光”、“增强信号稳定性”、“增强酶稳定性”、“增强蛋白表达水平”等。

[0063] 术语“信号稳定性”指的是发光信号的持续时间，例如，通过信号在一段时间过程中衰减的半衰期或信号保持不变的时间长度来衡量，指的是一种酶（如萤光素酶）的特征信号持续时间。“信号稳定性增强”的增强指的是与未突变萤光素酶相比，突变萤光素酶的信号持续时间的增加。

[0064] 术语“氨基酸”指的是天然氨基酸、非自然氨基酸和人工合成的氨基酸类似物，都在D和L立体异构体中，除非另有说明。

[0065] “样本”一词在这里使用有最广泛的意义。它包括：一个标本、培养物、裂解液等。它包括一种制备的溶液或混合物，以及生物和环境样品。生物样品可以采用流体或固体的形式，并且可以从任何合适的生物来源（例如，动物，包括人类、微生物等）获得。环境样本包括环境材料，如表面物质、土壤、植物和水。本申请的样品类型，包括并不局限于这些例子。

[0066] 具体实施例实验材料、试剂与仪器

[0067] 细菌：大肠杆菌DH5α、BL21（DE3）。

[0068] 细胞：HeLa细胞、HEK293细胞、Jurkat细胞。

[0069] 试剂：细菌培养试剂LB琼脂糖粉末、LB琼脂平板、抗生素以及细胞培养试剂DMEM、RPMI1640、FBS、青链霉素等。

[0070] 耗材：白底不透明96孔板/384孔板。

[0071] 仪器：紫外可见分光光度计（Spectrumlab 752s）；细菌摇床（ZQZY‑AF8V知楚仪器）；超声波细胞破碎仪（Biosafer1000中国赛飞有限公司）；高压细胞破碎机（上海永联生物科技有限公司）；AKTApure蛋白纯化系统及其配套Ni亲和层析预装柱和Superdex200凝胶过滤层析预装柱（美国GE公司）；Tanon凝胶成像仪（上海天能科技有限公司）；多功能酶标仪（INFINITE 200 Pro Tecan）等。

[0072] 实施例1 突变体构建及筛选

[0073] 非突变的萤火虫萤光素酶重组基因序列见美国专利US7083911B2（其编码的蛋白如SEQ ID NO:1），人工合成其核苷酸序列，克隆至载体pET‑28a（+）中，获得pET‑28a（+）‑Luc1质粒。通过GeneMorph II随机突变试剂盒（安捷伦，货号200550）和pET‑28a（+）‑Luc1质粒为模板，建立了随机突变体文库。将突变体文库克隆至pET‑28a（+）质粒载体中，再将重组质粒转化入BL21（DE3）感受态细胞，挑取各突变体单个菌落在含有筛选抗性的LB培养基中培养过夜，将培养物稀释到含有0.5 mM IPTG LB诱导培养基中。将诱导的培养物裂解，用含有1 μM ATP、萤光素底物的检测试剂进行检测。计算每个突变体的RLU值，选择比值最高的样本。

[0074] 结果如图1，S193I和L367I萤火虫萤光素酶突变体均有较高的活性。与未突变的萤火虫萤光素酶信号相比，S193I和L367I萤火虫萤光素酶突变体的信号强度分别高于未突变萤火虫萤光素酶约3.4倍和2.5倍，具有极其显著的差异。最终确定了S193I和L367I两个突变位点，获得突变体质粒pET‑28a（+）‑Luc1‑S193I和pET‑28a（+）‑Luc1‑L367I。

[0075] SEQ ID NO:1

[0076] WT未突变的萤火虫萤光素酶氨基酸序列如下：

[0077] MADKNILYGPEPFYPLEDGTAGEQMFDALSRYAAIPGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENSLQFFLPVIASLYLGIIVAPVNDKYIERELIHSLGIVKPRIVFCSKNTFQKVLNVKSKLKSIETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDSNLDVKKFKPYSFNRDDQVASIMFSSGTTGLPKGVMLTHKNIVARFSIAKDPTFGNAINPTSAILTVIPFHHGFGMMTTLGYFTCGFRVVLMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMAFLAKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPKGDAKPGSTGKIVPLHAVKVVDPTTGKILGPNEPGELYFKGPMIMKGYYNNEEATKAIIDNDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQDYVASQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMLEKHTNG

[0078] SEQ ID NO:2

[0079] MT‑S193I萤火虫萤光素酶突变体的氨基酸序列如下：

[0080] MADKNILYGPEPFYPLEDGTAGEQMFDALSRYAAIPGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENSLQFFLPVIASLYLGIIVAPVNDKYIERELIHSLGIVKPRIVFCSKNTFQKVLNVKSKLKSIETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDSNLDVKKFKPYSFNRDDQVAIIMFSSGTTGLPKGVMLTHKNIVARFSIAKDPTFGNAINPTSAILTVIPFHHGFGMMTTLGYFTCGFRVVLMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMAFLAKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPKGDAKPGSTGKIVPLHAVKVVDPTTGKILGPNEPGELYFKGPMIMKGYYNNEEATKAIIDNDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQDYVASQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMLEKHTNG

[0081] SEQ ID NO:3

[0082] MT‑L367I萤火虫萤光素酶突变体的氨基酸序列如下：

[0083] MADKNILYGPEPFYPLEDGTAGEQMFDALSRYAAIPGCIALTNAHTKENVLYEEFLKLSCRLAESFKKYGLKQNDTIAVCSENSLQFFLPVIASLYLGIIVAPVNDKYIERELIHSLGIVKPRIVFCSKNTFQKVLNVKSKLKSIETIIILDLNEDLGGYQCLNNFISQNSDSNLDVKKFKPYSFNRDDQVASIMFSSGTTGLPKGVMLTHKNIVARFSIAKDPTFGNAINPTSAILTVIPFHHGFGMMTTLGYFTCGFRVVLMHTFEEKLFLQSLQDYKVESTLLVPTLMAFLAKSALVEKYDLSHLKEIASGGAPLSKEIGEMVKKRFKLNFVRQGYGLTETTSAVLITPKGDAKPGSTGKIVPIHAVKVVDPTTGKILGPNEPGELYFKGPMIMKGYYNNEEATKAIIDNDGWLRSGDIAYYDNDGHFYIVDRLKSLIKYKGYQVAPAEIEGILLQHPYIVDAGVTGIPDEAAGELPAAGVVVQTGKYLNEQIVQDYVASQVSTAKWLRGGVKFLDEIPKGSTGKIDRKVLRQMLEKHTNG

[0084] 实施例2 突变体可溶性测定

[0085] 将模板质粒pET‑28a（+）‑Luc1和2个突变体质粒转化到 BL21（DE3）感受态细胞，并在含有抗生素的LB平板上37℃条件培养过夜。次日使用接菌环分别挑取单克隆接种到3ml  +
LB（K 抗性）培养液中，37℃ 200 rpm/min 摇床振荡培养 8 12h，留作菌种，用于次日诱导~
表达。吸取30μL菌液加入到 3ml LB 液体培养基中，37℃ 200rpm/min 温箱培养2h，使用分光光度计测定菌液吸光度，当 OD600nm 值在 0.8 左右时，取出菌液。 将菌液在16℃静置 
30min，加入终浓度为 0.5 mM 的 IPTG，16℃ 180rpm/min 温箱培养24h，同时设立非诱导组；诱导结束后，使用 4℃离心机收集菌体并使用 500μL PBS 重悬菌体。冰浴条件下超声破碎菌体，13，000×rpm 4℃离心 5min，收集上清液。对各酶上清液进行SDS‑PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测，观察到目的蛋白均以可溶性形式表达。经Ni亲和层析纯化柱和Superdex200凝胶过滤层析预装柱两步纯化，蛋白纯度可达99%以上。

[0086] 实施例3 优选萤火虫萤光素突变体的表达与纯化

[0087] 将萤火虫萤光素酶突变体的BL21（DE3）菌种（突变体质粒pET‑28a（+）‑Luc1‑S193I +
和pET‑28a（+）‑Luc1‑L367I）和含未突变质粒的菌株（含pET‑28a（+）‑Luc1质粒）在K 抗性的LB液体培养基中进行诱导培养，具体条件见实施例2所述。诱导结束后，4℃ 8000rpm/min离心机收集菌体，菌体：裂解液（50mM Tris，500mM NaCl，5％甘油，pH7.5）按1:10比例充分重悬后，于高压破碎仪破碎菌体，4℃ 20000rpm/min 高速离心收集破碎上清液，经Ni亲和层析纯化柱粗纯后使用Superdex200凝胶过滤层析预装柱进行精细纯化，并将储存液置换为（50mM Tris，150mM NaCl，5％甘油，pH7.5），经SDS‑PAGE电泳及考马斯亮蓝染色检测。将纯化后的萤光素酶使用Pierce™ BCA 蛋白定量试剂盒（thermofisher，23225）测定浓度后分装保存于‑80℃。

[0088] 实施例4 萤火虫萤光素酶突变体用于ATP标准品活性曲线的检测

[0089] 通过对ATP进行滴定测试测定萤火虫萤光素酶突变体的使用效果。

[0090] 为了确定本文所描述的突变体萤火虫萤光素酶用于ATP标准品的检测，制备了检测试剂（40μg/ml萤火虫萤光素酶，50 mM Hepes，pH 7.0，300 mM NaCl，1mM EDTA， 1％Triton X‑100，20mM MgSO4，0.1%明胶和5%甘油，1mM D‑Luciferin）。

[0091] 样品处理：将ATP标准品用无酶无菌水制备成1μM ATP（100μl 含有10‑10摩尔ATP），‑10 ‑12按2倍稀释比进行梯度稀释（1μM至10 nM，100μl含有10 至10 摩尔ATP）。白底不透明96孔板各孔加入100μl ATP标准品稀释液，并加入等体积的检测试剂（含萤光素酶底物和纯化萤火虫萤光素酶），使用定轨振荡器混合内容物2min，将板置于室温条件下孵育10min，以使发光信号稳定。记录发光信号。

[0092] 结果显示，与未突变的萤火虫萤光素酶相比，S193I和L367I突变体均呈现出更强的发光值及检测灵敏度。未突变、S193I和L367I突变体萤火虫萤光素酶对ATP标准品检测发光值均呈现良好的线性关系。其中，S193I萤火虫萤光素酶突变体表现出最强的检测效果，RLU值为未突变萤火虫萤光素酶信号的3.4倍。L367I萤火虫萤光素酶突变体为未突变萤火虫萤光素酶信号的2.3倍（图2）。

[0093] 实施例5 萤火虫萤光素酶突变体用于细胞活性曲线的检测

[0094] 通过对HEK293细胞进行滴定测试进一步测定萤火虫萤光素酶突变体的使用效果。

[0095] 为了确定本文所描述的突变体萤火虫萤光素酶用于ATP标准品的检测，制备了检测试剂（40μg/ml萤火虫萤光素酶，50 mM Hepes，pH 7.0，300 mM NaCl，1mM EDTA， 1％Triton X‑100，20mM MgSO4，0.1% 明胶和 5%甘油，1mM D‑Luciferin）。样品处理：HEK293细胞使用DMEM培养基（含10%FBS）于96孔板中对将HEK293细胞进行2倍梯度稀释，于室温条件下放置约30min。加入与每孔细胞培养基等体积的检测试剂（含萤光素酶底物和纯化萤火虫萤光素酶），使用定轨振荡器混合内容物2min，将板置于室温条件下孵育10min，以使发光信号稳定。记录发光信号。

[0096] 结果显示，与未突变的萤火虫萤光素酶相比，S193I和L367I突变体均呈现出更强的发光值及检测灵敏度。未突变、S193I和L367I突变体萤火虫萤光素酶对HEK293细胞检测发光值均呈现良好的线性关系。其中，S193I萤火虫萤光素酶突变体表现出最强的检测效果，RLU值为未突变萤火虫萤光素酶信号的3.6倍。L367I萤火虫萤光素酶突变体为未突变萤火虫萤光素酶信号的3.0倍（图3）。

[0097] 实施例6 萤火虫萤光素酶突变体用于不同细胞的活力检测

[0098] 为了确定本文所描述的突变体萤火虫萤光素酶用于不同细胞系检测，制备了检测试剂（80μg/ml萤火虫萤光素酶，50 mM MES，pH 6.0，100 mM NaCl，1mM EDTA，2％Triton X‑100，40 mM MgSO4，0.5 mM D‑Luciferin）。样品选择3种常用细胞系HeLa、HEK293和Jurkat细胞。按照2万个/孔的密度接种白底不透明96孔板，室温平衡30 min，加入与每孔细胞培养基等体积的检测试剂（含萤光素酶底物和纯化萤火虫萤光素酶），使用定轨振荡器混合内容物2min，将板置于室温条件下孵育10min，以使发光信号稳定。记录发光信号。

[0099] 结果显示，因该检测方法是一款基于ATP含量的检测手段，对于HEK293、HeLa、Jurkat细胞的活力检测，未突变、S193I和L367I突变体萤火虫萤光素酶均因细胞系差异呈现出不同的检测效果（图4）。其中，S193I萤火虫萤光素酶突变体表现出较强的检测效果，RLU值为未突变萤火虫萤光素酶信号的4.2倍。L367I萤火虫萤光素酶突变体为未突变萤火虫萤光素酶信号的3.3倍。

[0100] 实施例7 萤火虫萤光素酶突变体关于ATP标准品发光信号稳定性检测

[0101] 为了确定本文所描述的突变体萤火虫萤光素酶发光信号稳定性，制备了检测试剂（100μg/ml萤火虫萤光素酶，20 mM citrate，pH 6.0，150 mM NaCl，2mM EDTA，2％Triton X‑100，50 mM MgSO4，0.2%明胶、5%甘油，2mM D‑Luciferin）测定1μM ATP标准品发光信号的稳定性。

[0102] 样品处理：将ATP标准品用无酶无菌水制备成1μM ATP稀释液（100μl 含有10‑10摩尔ATP），白底不透明96孔板各孔加入100μl ATP标准品稀释液，并加入等体积的检测试剂（含萤光素酶底物和纯化萤火虫萤光素酶），使用定轨振荡器混合内容物2min，将板置于室温条件下孵育10min，以使发光信号稳定。每10 min记录一次发光信号。

[0103] 结果显示，对1μ M ATP标准品的检测中，未突变体、S193I和L367I突变体萤火虫萤光素酶的信号半衰期均超过了5小时。S193I和L367I突变体萤火虫萤光素酶的发光信号在60min内仍可达到初始发光值的90%以上（图5）。

[0104] 实施例8 萤火虫萤光素酶突变体关于细胞样品发光信号稳定性检测

[0105] 为了确定本文所描述的突变体萤火虫萤光素酶发光信号稳定性，制备了检测试剂（100μg/ml萤火虫萤光素酶，20 mM citrate， pH 6.0，150 mM NaCl，2mM EDTA， 2％Triton X‑100，50 mM MgSO4，0.2%明胶、5%甘油，2mM D‑Luciferin）用于测定HEK293细胞的发光信号稳定性。

[0106] 将HEK293细胞按照2万个/孔的密度接种白底不透明96孔板，室温平衡30 min，加入与每孔细胞培养基等体积的检测试剂（含萤光素酶底物和纯萤火虫萤光素酶），使用定轨振荡器混合内容物2min，将板置于室温条件下孵育10min，以使发光信号稳定。每10 min记录一次发光信号。

[0107] 结果显示，对HEK293细胞活力的检测中，S193I和L367I突变体萤火虫萤光素酶的信号半衰期均超过了5小时，未突变体半衰期仅为4小时左右。S193I和L367I突变体萤火虫萤光素酶的发光信号在60min内仍可达到初始发光值的85%以上，未突变体活性下降了25%，仅为初始发光信号的75%（图6）。