靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体及其用途转让专利
申请号 : CN202310780655.4
文献号 : CN116854825B
文献日 : 2024-03-01
发明人 : 刘丹 , 王璞 , 施明 , 王旭 , 赵璇 , 郑骏年
申请人 : 徐州医科大学
摘要 :
本发明公开了靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体及其用途。本发明提供了一种靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体，以及编码该嵌合抗原受体的核酸分子、经工程改造的细胞与制备所述细胞的方法，以及所述细胞在制备诊断或治疗与BCMA表达相关的疾病的产品中的用途，特别是在制备治疗多发性骨髓瘤或急性淋巴白血病的产品中的用途。本发明提供的靶向BCMA的嵌合抗原受体能够有效避免靶点逃逸，防止肿瘤的复发。
权利要求 :
1.一种靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包含与BCMA特异性结合的抗体片段scFv；所述抗体片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示；
所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域；
所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域；
所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示；
所述嵌合抗原受体还包含铰链区；
所述铰链区为CD8铰链区；
所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示；
所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域；
所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域；
所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示；
所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域；
所述共刺激信号结构域为4‑1BB共刺激信号结构域；
所述4‑1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示；
所述嵌合抗原受体还包含信号肽；
所述信号肽为CD8信号肽；
所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示；
所述嵌合抗原受体含有依次连接的CD8信号肽、scFv、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4‑
1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域；
所述嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.13、3、5、7、9、11依次连接所构成的氨基酸序列。
2.一种分离的核酸分子，其特征在于，所述核酸分子编码权利要求1所述的嵌合抗原受体；
所述嵌合抗原受体的编码序列包含依次连接的CD8信号肽的编码序列、scFv的编码序列、CD8铰链区的编码序列、CD8跨膜结构域的编码序列、4‑1BB共刺激信号结构域的编码序列、CD3ζ胞内信号传导结构域的编码序列；
所述CD8信号肽的编码序列如SEQ ID NO.14所示；
所述scFv的编码序列如SEQ ID NO.4所示；
所述CD8铰链区的编码序列如SEQ ID NO.6所示；
所述CD8跨膜结构域的编码序列如SEQ ID NO.8所示；
所述4‑1BB共刺激信号结构域的编码序列如SEQ ID NO.10所示；
所述CD3ζ胞内信号传导结构域的编码序列如SEQ ID NO.12所示。
3.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求2所述的核酸分子。
4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述载体包含克隆载体、表达载体。
5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述载体包含DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。
6.根据权利要求5所述的载体，其特征在于，所述病毒载体包含慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体或逆转录病毒载体。
7.根据权利要求6所述的载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。
8.一种经工程改造的细胞，其特征在于，所述细胞包含或表达权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子或权利要求3‑7任一项所述的载体。
9.根据权利要求8所述的细胞，其特征在于，所述细胞包含免疫细胞。
10.根据权利要求9所述的细胞，其特征在于，所述免疫细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、髓样细胞或其任意组合。
11.根据权利要求10所述的细胞，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞。
12.根据权利要求11所述的细胞，其特征在于，所述T细胞包含原代T细胞或Jurkat细胞。
13.一种制备权利要求8‑12任一项所述的细胞的方法，其特征在于，所述方法包含将权利要求2所述的核酸分子或权利要求3‑7任一项所述的载体引入细胞中。
14.一种衍生物，其特征在于，所述衍生物包含可检测标记的权利要求1所述的嵌合抗原受体和/或权利要求2所述的核酸分子、赋予抗生素抗性的权利要求1所述的嵌合抗原受体和/或权利要求2所述的核酸分子、与治疗剂结合或偶联的权利要求1所述的嵌合抗原受体和/或权利要求2所述的核酸分子。
15.根据权利要求14所述的衍生物，其特征在于，所述可检测标记包含放射性核素、荧光团、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子信标或适体信标。
16.根据权利要求14所述的衍生物，其特征在于，所述治疗剂包含放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶或化疗剂。
17.一种药物组合物或试剂盒，其特征在于，所述药物组合物或试剂盒包含权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3‑7任一项所述的载体或权利要求8‑12任一项所述的细胞。
18.根据权利要求17所述的药物组合物或试剂盒，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
19.如下任一种应用：
1)权利要求1所述的嵌合抗原受体、权利要求2所述的核酸分子、权利要求3‑7任一项所述的载体、权利要求8‑12任一项所述的细胞、权利要求14‑16任一项所述的衍生物或权利要求17‑18任一项所述的药物组合物或试剂盒在制备诊断或治疗与BCMA表达相关的疾病的产品中的应用；
2)权利要求1所述的嵌合抗原受体在制备权利要求14‑16任一项所述的衍生物或权利要求17‑18任一项所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
3)权利要求2所述的核酸分子在制备权利要求3‑7任一项所述的载体、权利要求8‑12任一项所述的细胞、权利要求14‑16任一项所述的衍生物或权利要求17‑18任一项所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
4)权利要求3‑7任一项所述的载体在制备权利要求8‑12任一项所述的细胞、权利要求
14‑16任一项所述的衍生物或权利要求17‑18任一项所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
5)权利要求8‑12任一项所述的细胞在制备权利要求14‑16任一项所述的衍生物或权利要求17‑18任一项所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
6)权利要求14‑16任一项所述的衍生物在制备权利要求17‑18任一项所述的药物组合物或试剂盒中的应用。
20.根据权利要求19所述的应用，其特征在于，所述与BCMA表达相关的疾病包含癌症、癌前病变或非癌症相关适应症。
21.根据权利要求20所述的应用，其特征在于，所述与BCMA表达相关的疾病为癌症。
22.根据权利要求21所述的应用，其特征在于，所述癌症包含骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、急性淋巴白血病、慢性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
23.根据权利要求22所述的应用，其特征在于，所述癌症为骨髓瘤或急性淋巴白血病。
24.根据权利要求23所述的应用，其特征在于，所述骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
说明书 :
靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体及其用途
技术领域
[0001] 本发明属于生物医药领域，涉及靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体及其用途。
背景技术
[0002] B细胞成熟抗原(B‑cel1maturation antigen，BCMA，也称为CD269、TNFRSF17)，是B细胞谱系的细胞表达的肿瘤坏死家族受体(TNFR)成员。BCMA表达在终末分化的B细胞上最高。BCMA参与介导浆细胞的存活以维持长期体液免疫力。最近，BCMA的表达与许多癌症、自身免疫性疾病和感染性疾病相关。具有增加的BCMA表达的癌症包括一些血液癌症，例如骨髓瘤、霍奇金淋巴瘤和非霍奇金淋巴瘤、各种白血病或胶质母细胞瘤。
[0003] 多发性骨髓瘤(Multiple Myeloma，MM)是一种起源于骨髓中恶性浆细胞的血液系统肿瘤，常伴的症状有多发性溶骨性病理改变、贫血、肾脏损伤、高钙血症等。由于恶性肿瘤是一种克隆性疾病，肿瘤细胞内部会随着时间的推移形成多种亚克隆，所以肿瘤细胞的遗传和表型异质性常常出现在同一患者体内。在过去的半个世纪里，MM的治疗通过蛋白酶体抑制剂、免疫调节剂、单克隆抗体的疗法在临床中的应用取得了显著进展，使MM的治疗进入了靶向免疫治疗时代。然而，MM在很大程度上仍然是不可治愈的，复发、难治仍然是治疗的主要问题。急性白血病(Acute Leukemia，AL)是起源于造血干细胞/祖细胞的恶性克隆性疾病，是临床上常见的恶性血液系统疾病，死亡率在35岁以下成人中居恶性肿瘤首位，严重危害人类健康。难治/复发(Refractory/Relapsed，R/R)是导致AL长期生存率低的主要因素。AL目前的治疗手段以化疗和造血干细胞移植常规治疗手段为主，随着医疗技术的发展，AL的诊疗技术不断提高，但仍以传统治疗为主。AL主要包括急性淋巴白血病(Acute
Lymphocytic Leukemia，ALL)和急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)。
Lymphocytic Leukemia，ALL)和急性髓细胞白血病(Acute Myeloid Leukemia，AML)。
[0004] 嵌合抗原受体T细胞(Chimeric Antigen Receptor T cell，CAR‑T)疗法是一种新的治疗方法，对某些血液系统肿瘤具有明确的疗效。嵌合抗原受体(CAR)结构是一种基因工程分子，通过抗原‑抗体相互作用而不是主要组织相容性复合体(MHC)依赖的方式，引导T细胞特异性地攻击肿瘤细胞。在各种类型的细胞治疗中，CAR‑T在治疗癌症，特别是恶性血液病中是最主要和最有效的抗肿瘤药物。因此研究CAR‑T疗法治疗多发性骨髓瘤与急性白血病有着重要的意义。但是CAR‑T目前在肿瘤应用领域仍面临很多困难，如CAR‑T对肿瘤细胞不够敏感、杀伤能力低、临床用量大、体外制备时间长。而如何增强CAR‑T对肿瘤细胞的敏感性和杀伤能力、提高CAR‑T治疗效果、减少CAR‑T临床用量、提高CAR‑T的体外增殖能力、缩短制备时间是CAR‑T疗法需要解决的问题。
发明内容
[0005] 为了弥补现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种靶向BCMA的人源化嵌合抗mut mut原受体(BCMA‑CAR突变体或BCMA‑CAR )及其制备的BCMA‑CAR ‑CAR‑T以增强TCR信号活性，提高CAR‑T对肿瘤的杀伤能力。
[0006] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0007] 本发明第一方面提供了一种靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包含与BCMA特异性结合的抗体片段scFv；所述抗体片段scFv是在SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中取代一个或多个氨基酸；所述氨基酸序列中取代的位点选自SEQ ID NO.1中的以下位点中的任意一个或几个：Y102、N103、N172、N175、T192或S193。
[0008] 进一步，所述氨基酸序列中取代的位点选自SEQ ID NO.1中的以下位点：Y102、N103、N172、N175、T192和S193。
[0009] 进一步，所述Y102、N103、N172、N175、T192和S193的氨基酸取代包含Y102H、N103G、N172G、N175G、T192A和S193G。
[0010] 进一步，所述抗体片段scFv的氨基酸序列包含与SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列具有至少80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％同一性的氨基酸序列。
[0011] 进一步，所述抗体片段scFv的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
[0012] 进一步，所述嵌合抗原受体还包含跨膜结构域。
[0013] 进一步，所述跨膜结构域包含以下分子的跨膜结构域：IgG1、IgG4、CD8、CD28、IL‑2受体、IL‑7受体、IL‑11受体、PD‑1、CD34、OX40、CD3ε或其变体。
[0014] 进一步，所述跨膜结构域为CD8跨膜结构域。
[0015] 进一步，所述CD8跨膜结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
[0016] 进一步，所述嵌合抗原受体还包含铰链区。
[0017] 进一步，所述铰链区包含以下分子的铰链区：IgG1、IgG4、CD8、CD28、IL‑2受体、IL‑7受体、IL‑11受体、PD‑1、CD34、OX40、CD3ε或其变体。
[0018] 进一步，所述铰链区为CD8铰链区。
[0019] 进一步，所述CD8铰链区的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示。
[0020] 进一步，所述嵌合抗原受体还包含胞内信号传导结构域。
[0021] 进一步，所述胞内信号传导结构域包含以下分子的胞内信号传导结构域：FcγR、FcεR、FcαR、FcRn、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF‑κB、PLC‑γ、iC3b、C3dg、C3d、Zap70或其变体。
[0022] 进一步，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域。
[0023] 进一步，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示。
[0024] 进一步，所述嵌合抗原受体还包含共刺激信号结构域。
[0025] 进一步，所述共刺激信号结构域包含以下分子的共刺激信号结构域：CD19、CD27、CD28、4‑1BB、OX40、CD30、CD40、ICOS、ICAM、LFA‑1、Lck、CD2、CD4、CD5、CD7、CD226、CD8α、CD8β、LIGHT、CD83、DAP10、DAP12、GITR、DR3、NKG2C、HVEM、B7‑H3或其变体。
[0026] 进一步，所述共刺激信号结构域为4‑1BB共刺激信号结构域。
[0027] 进一步，所述4‑1BB共刺激信号结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示。
[0028] 进一步，所述嵌合抗原受体还包含信号肽。
[0029] 进一步，所述信号肽包含以下分子的信号肽：T细胞受体的α链及β链、CD3ζ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD9、CD28、CD16、CD22、CD64、CD80、CD86、CD134、CD137、CD154、GITR、ICOS、IgG6或其变体。
[0030] 进一步，所述信号肽为CD8信号肽。
[0031] 进一步，所述CD8信号肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.13所示。
[0032] 进一步，所述嵌合抗原受体含有依次连接的信号肽、scFv、铰链区、跨膜结构域、共刺激信号结构域、胞内信号传导结构域。
[0033] 进一步，所述嵌合抗原受体含有依次连接的CD8信号肽、scFv、CD8铰链区、CD8跨膜结构域、4‑1BB共刺激信号结构域、CD3ζ胞内信号传导结构域。
[0034] 进一步，所述嵌合抗原受体的氨基酸序列为SEQ ID NO.13、3、5、7、9、11依次连接所构成的氨基酸序列。
[0035] 本发明第二方面提供了一种分离的核酸分子，所述核酸分子编码本发明第一方面所述的嵌合抗原受体。
[0036] 进一步，所述嵌合抗原受体的编码序列包含依次连接的信号肽的编码序列、scFv的编码序列、铰链区的编码序列、跨膜结构域的编码序列、共刺激信号结构域的编码序列、胞内信号传导结构域的编码序列。
[0037] 进一步，所述嵌合抗原受体的编码序列包含依次连接的CD8信号肽的编码序列、scFv的编码序列、CD8铰链区的编码序列、CD8跨膜结构域的编码序列、4‑1BB共刺激信号结构域的编码序列、CD3ζ胞内信号传导结构域的编码序列。
[0038] 进一步，所述CD8信号肽的编码序列如SEQ ID NO.14所示。
[0039] 进一步，所述scFv的编码序列如SEQ ID NO.4所示。
[0040] 进一步，所述CD8铰链区的编码序列如SEQ ID NO.6所示。
[0041] 进一步，所述CD8跨膜结构域的编码序列如SEQ ID NO.8所示。
[0042] 进一步，所述4‑1BB共刺激信号结构域的编码序列如SEQ ID NO.10所示。
[0043] 进一步，所述CD3ζ胞内信号传导结构域的编码序列如SEQ ID NO.12所示。
[0044] 本发明第三方面提供了一种载体，所述载体包含本发明第二方面所述的核酸分子。
[0045] 进一步，所述载体包含克隆载体、表达载体。
[0046] 进一步，所述载体包含DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体或病毒载体。
[0047] 进一步，所述病毒载体包含慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒载体、痘病毒载体、疱疹病毒载体或逆转录病毒载体。
[0048] 进一步，所述病毒载体为慢病毒载体。
[0049] 本发明第四方面提供了一种经工程改造的细胞，所述细胞包含或表达本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体。
[0050] 进一步，所述细胞包含免疫细胞。
[0051] 进一步，所述免疫细胞包含T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、髓样细胞或其任意组合。
[0052] 进一步，所述免疫细胞为T细胞。
[0053] 进一步，所述T细胞包含原代T细胞或Jurkat细胞。
[0054] 本发明第五方面提供了一种制备本发明第四方面所述的细胞的方法，所述方法包含将本发明第二方面所述的核酸分子或本发明第三方面所述的载体引入细胞中。
[0055] 本发明第六方面提供了一种衍生物，所述衍生物包含可检测标记的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的核酸分子、赋予抗生素抗性的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的核酸分子、与治疗剂结合或偶联的本发明第一方面所述的嵌合抗原受体和/或本发明第二方面所述的核酸分子。
[0056] 进一步，所述可检测标记包含放射性核素、荧光团、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子信标或适体信标。
[0057] 进一步，所述治疗剂包含放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶或化疗剂。
[0058] 本发明第七方面提供了一种药物组合物或试剂盒，所述药物组合物或试剂盒包含本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体或本发明第四方面所述的细胞。
[0059] 进一步，所述药物组合物还包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
[0060] 本发明第八方面提供了如下任一项应用：
[0061] 1)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体、本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的衍生物或本发明第七方面所述的药物组合物或试剂盒在制备诊断或治疗与BCMA表达相关的疾病的产品中的应用；
[0062] 2)本发明第一方面所述的嵌合抗原受体在制备本发明第二方面所述的核酸分子、本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的衍生物或本发明第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
[0063] 3)本发明第二方面所述的核酸分子在制备本发明第三方面所述的载体、本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的衍生物或本发明第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
[0064] 4)本发明第三方面所述的载体在制备本发明第四方面所述的细胞、本发明第六方面所述的衍生物或本发明第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
[0065] 5)本发明第四方面所述的细胞在制备本发明第六方面所述的衍生物或本发明第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用；
[0066] 6)本发明第六方面所述的衍生物在制备本发明第七方面所述的药物组合物或试剂盒中的应用。
[0067] 进一步，所述与BCMA表达相关的疾病包含癌症、癌前病变或非癌症相关适应症。
[0068] 进一步，所述与BCMA表达相关的疾病为癌症。
[0069] 进一步，所述癌症包含骨髓瘤、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、急性淋巴白血病、慢性白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、霍奇金淋巴瘤或非霍奇金淋巴瘤。
[0070] 进一步，所述癌症为骨髓瘤或急性淋巴白血病。
[0071] 进一步，所述骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
[0072] 本发明的优点和有益效果：
[0073] 本发明构建的BCMA‑CARmut，与靶细胞接触后TCR信号活性更强，显著提高了BCMA‑mut mut mutCAR ‑T的杀伤效率，减少了BCMA‑CAR ‑T的临床用量，缩短了BCMA‑CAR ‑T的体外制备时间，并且安全有效，可用于血液肿瘤、实体肿瘤及自身免疫病的免疫细胞治疗。
附图说明
[0074] 图1为BCMA‑CAR和BCMA‑CARmut的构建模式图，其中1A是BCMA‑CAR的构建模式图，1Bmut是BCMA‑CAR 的构建模式图；
[0075] 图2为Jurkat‑Reporter稳转细胞株的构建模式图；
[0076] 图3为流式细胞检测BCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter、BCMA‑CARmut‑Jurkat‑Reportermut细胞的BCMA‑CAR和BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度的效果图；
[0077] 图4为流式细胞检测接受化学刺激后BCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter、BCMA‑CARmut‑Jurkat‑Reporter细胞的GFP阳性表达率及平均荧光强度的效果图，其中4A是GFP阳性表达率的效果图，4B是平均荧光强度的效果图；
[0078] 图5为流式细胞检测U266靶细胞和Nalm6‑BCMA‑GFP表面BCMA阳性表达率的效果图，其中5A是Nalm6‑BCMA‑GFP细胞表面BCMA阳性表达率的效果图，5B是U266细胞表面BCMA阳性表达率的效果图；
[0079] 图6为流式细胞检测BCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter、BCMA‑CARmut‑Jurkat‑Reporter细胞接受生物学刺激后TCR信号强度的效果图，其中6A是接受U266细胞刺激后TCR信号强度的效果图，6B是接受Nalm6‑BCMA‑GFP细胞刺激后TCR信号强度的效果图；
[0080] 图7为流式细胞检测患者来源的T细胞制备的BCMA‑CAR‑T细胞和BCMA‑CARmut‑T细mut胞的BCMA‑CAR和BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度的效果图；
[0081] 图8为流式细胞检测CHO细胞表面BCMA阳性表达的效果图；
[0082] 图9为RTCA评估患者来源的T细胞制备的BCMA‑CAR‑T和BCMA‑CARmut‑T杀伤功能效果图，其中9A是RTCA实时监测效靶比为1:1的标准化细胞指数效果图，9B是RTCA实时监测效靶比为1:5的标准化细胞指数效果图；
[0083] 图10为流式细胞检测正常人来源的T细胞制备的BCMA‑CAR‑T细胞和BCMA‑CARmut‑Tmut细胞的BCMA‑CAR和BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度的效果图；
[0084] 图11为正常人来源的T细胞制备的不同CAR‑T细胞杀伤功能效果图，其中11A是流mut式细胞检测BCMA‑CAR‑T细胞和BCMA‑CAR ‑T细胞在不同效靶比下的残余肿瘤细胞的比例效果图，11B是残余肿瘤细胞比例的统计图。
具体实施方式
[0085] 本发明通过广泛而深入的研究，研发了一种BCMA‑CAR突变体(BCMA‑CARmut)，并构mut mut建了BCMA‑CAR ‑T。BCMA‑CAR ‑T在接受靶抗原刺激后，其TCR信号的活性强度显著高于mut
BCMA‑CAR‑T，表明含有BCMA‑CAR 的T细胞对靶细胞具有更强的杀伤功能。
BCMA‑CAR‑T，表明含有BCMA‑CAR 的T细胞对靶细胞具有更强的杀伤功能。
[0086] 在本发明中，术语“BCMA”通常是指B细胞成熟抗原蛋白质(也称为TNFRSF17、BCM或CD269)，即肿瘤坏死因子受体(TNFR)家族成员，表达于浆细胞和成熟B细胞上。例如，人BCMA是由994个核苷酸长的初级mRNA转录物(NM_001192.2)编码的184个氨基酸长的蛋白质。人BCMA的氨基酸序列用UniPretKB登录号Q02223表示。在本发明中，术语“BCMA”可包含突变的蛋白质，例如可包含全长野生型BCMA的点突变、片段、插入、缺失和剪接变体的蛋白质。在本发明中，术语“BCMA”还可包括完整BCMA蛋白的一部分，只要保留相关的生物活性即可。
[0087] 在本发明中，术语“靶向”在涉及蛋白表达时旨在包括但不限于将蛋白质或多肽引导至细胞内或其外部的适当目的地。典型地通过信号肽或靶向肽来实现靶向，该信号肽或靶向肽是多肽链中的氨基酸残基的一段。这些信号肽可以位于多肽序列内的任何位置，但通常位于N端。多肽也可以经工程改造为在C端具有信号肽。信号肽可以指导多肽进行细胞外切割，定位到质膜、高尔基体、内体、内质网和其他细胞区室。如本发明所用，术语“靶向”在提及肿瘤的靶向时是指细胞识别和杀伤肿瘤细胞(即靶细胞)的能力。在这个背景下的术语“靶向”是指例如由细胞表达的CAR识别并结合由肿瘤表达的细胞表面抗原的能力。
[0088] 在本发明中，术语“嵌合抗原受体”和“CAR”可互换使用，指的是包含多个功能结构域的嵌合多肽，其从氨基端到羧基端的序列依次排列为：(a)包含抗原结合结构域(例如包含抗体片段scFv)的胞外结构域和铰链区；(b)跨膜结构域；和(c)胞内区(包含共刺激信号结构域、一个或多个胞内信号传导结构域)，其中上述结构域可以任选地由一个或多个间隔子结构域连接。CAR还可进一步包括信号肽序列，其通常在翻译后处理过程中被去除，并在用包含编码CAR的核酸序列的表达载体转化的细胞表面呈递CAR。CAR可以按照本领域众所周知的原理制备。
[0089] 如本发明中所使用的术语“胞外结构域”以与“抗原结合结构域(ABD)”相同的含义使用。所述术语“胞外结构域”或“抗原结合结构域”是指抗原结合分子的部分，所述抗原结合分子具有非共价地、可逆地并且特异性地结合至抗原的能力。如本文所用的，所述术语“抗原结合结构域”涵盖了抗体片段，所述抗体片段保留了非共价地、可逆地并且特异性地结合抗原的能力。在本发明的具体实施例中，所述胞外结构域或抗原结合结构域是指与BCMA特异性结合的抗体或抗体片段scFv。所述抗原结合结构域可以源自天然来源、合成来源、半合成来源或者重组来源。
[0090] 本发明中，术语“跨膜结构域”可以与“跨膜区(简称TM)”互换使用，指的是CAR的一部分，其使胞外结构域和胞内区融合，并且使CAR锚定至免疫效应细胞的质膜上。跨膜结构域可以从天然蛋白质中获得，也可以合成、半合成或重组获得。在本发明的嵌合抗原受体中，还包含铰链区，是一种具有促进嵌合抗原受体经由突变抗体与抗原结合、并且增强向细胞的信号传导的序列。可以将铰链区配置在胞外结构域与跨膜结构域之间、或胞内区与跨膜结构域之间。铰链区也意味着将跨膜结构域与胞外结构域、和/或跨膜结构域与胞内区连接而起作用的任一寡肽或多肽。铰链区包含至300个氨基酸、例如约10～100个氨基酸、或约25～50个氨基酸。
[0091] 跨膜结构域和铰链区包含但不限于以下分子的跨膜结构域和铰链区：T细胞受体α链、β链或ζ链、CD3ζ链、CD28、CD3ε、CD45、CD4、CD5、CD8、CD9、CD16、CD22、CD33、CD34、CD37、CD45、CD64、CD80、CD86、OX40，CD137、ICOS、CD152、CD154、IgG1、IgG4、IL‑2受体、IL‑7受体、IL‑11受体、PD‑1、GITR或其变体。在本发明的具体实施方案中，所述跨膜结构域和铰链区为CD8跨膜结构域和铰链区。
[0092] 本发明中，术语“胞内信号传导结构域”通常是CAR的一部分，其参与将有效的抗BCMA的CAR结合人BCMA多肽的信息转导进免疫效应细胞的内部，以引发效应细胞的功能，例如活化、细胞因子的产生、增殖和细胞毒活性，包括细胞毒性因子至CAR结合的靶细胞的释放或者用与CAR的胞外结构域结合的抗原引发的其它细胞应答。在本发明中，所述胞内信号传导结构域可以包含但不限于以下分子的胞内信号传导结构域：FcγR、FcεR、FcαR、FcRn、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合物、NFAT、NF‑κB、PLC‑γ、iC3b、C3dg、C3d、Zap70或其变体。在本发明的具体实施方案中，所述胞内信号传导结构域为CD3ζ胞内信号传导结构域。
[0093] 本发明中，术语“共刺激信号结构域”通常是指共刺激分子的胞内信号转导结构域。例如，共刺激分子可以是抗原受体或Fc受体之外的细胞表面分子，其在抗原结合时可提供T淋巴细胞的高效活化和功能所需的第二信号。例如，所述共刺激信号结构域可以选自以下组：CARD11、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8α、CD8β、CD19、CD27、CD28、CD30、CD40、CD54(ICAM)、CD83、CD134(OX40)、CD137(4‑1BB)、CD150(SLAMF1)、CD152(CTLA4)、CD223(LAG3)、CD226、CD270(HVEM)、CD273(PD‑L2)、CD274(PD‑L1)、CD278(ICOS)、DAP10、LFA‑1、Lck、LAT、LIGHT、DAP10、DAP12、NKD2CSLP76、GITR、DR3、NKG2C、TRIM、B7‑H3、ZAP70或其变体，或源自杀伤性免疫球蛋白样受体(KIR)的共刺激信号结构域。在本发明的具体实施方案中，所述共刺激信号结构域为4‑1BB共刺激信号结构域。
[0094] 在本发明中，“CAR”包括但不限于第一代CAR、第二代CAR、第三代CAR或第四代CAR。术语“第一代CAR”是指CAR的胞内区仅包含单个传导信号，例如CAR的胞内区中只包含CD3ζ单一信号。第二代CAR除单一信号传导结构域如CD3ζ信号外，还包括一个共刺激信号结构域，包括但不限于CD28、4‑1BB，这些信号增强了CAR‑T的持久性、细胞因子分泌和抗肿瘤活性。第三代CAR包括二个共刺激信号结构域。第四代CAR也被称作“装甲车”，是在第三代CAR的基础上，进一步增加可以改善CAR‑T细胞功能的结构，例如细胞因子或者趋化因子的受体结构。
[0095] 可以掺入本发明的CAR中的示例性细胞区包含(氨基到羧基)：CD3ζ；CD28‑CD3ζ；CD28‑OX40‑CD3ζ；CD28‑41BB‑CD3ζ；41BB‑CD28‑CD3ζ和41BB‑CD3ζ。在本发明的具体实施例中，胞内包含41BB‑CD3ζ信号。
[0096] 本发明所使用的术语“特异性结合”是指由抗原决定簇和抗体分子可变区空间构象决定的以高亲和力互补结合的特性。这种高亲和力决定了所述抗体分子一旦与所述抗原结合，便可发挥其相应的生理功能，
[0097] 术语“抗体片段”是指保留与抗原的表位特异性地相互作用(例如，通过结合、空间位阻、稳定化/去稳定化、空间分布)的能力的抗体的至少一部分。抗体片段的实例包括，但不限于Fab，Fab’、F(ab’)2、Fv片段、scFv抗体片段、二硫键‑连接的Fvs(sdFv)、由VH和CH1结构域组成的Fd片段、线性抗体、单域抗体比如sdAb(VL或VH)、camelidVHH结构域、由抗体片段(例如包括在铰链区通过二硫键连接的两个Fab片段的二价片段)形成的多特异性抗体和抗体的分离的CDR或其它表位结合片段。
[0098] 术语“scFv”是指包含至少一个包括轻链的可变区抗体片段和至少一个包括重链的可变区的抗体片段的融合蛋白，其中所述轻链和重链可变区是邻接的(例如经由合成接头例如短的柔性多肽接头)，并且能够以单链多肽形式表达，且其中所述scFv保留其所来源的完整抗体的特异性。除非指定，否则如正如本文中使用的那样，scFv可以以任何顺序(例如相对于多肽的N‑末端和C末端)具有所述的VL和VH可变区，scFv可以包括VL‑接头‑VH或可以包括VH‑接头‑VL。
[0099] 在本发明中，包含抗体片段的CAR部分可以以多种形式存在，其中抗原结合结构域被表达为连续的多肽链的一部分，所述多肽链包括例如单结构域抗体片段(sdAb)、单链抗体(scFv)人源化抗体或双特异性抗体。在一个方面，本发明的CAR组合物的抗原结合结构域包括抗体片段。在一个进一步的方面，CAR包含抗体片段scFv。
[0100] 如本发明使用的“氨基酸取代”或“取代”是指用不同的氨基酸替换多肽中亲本多肽序列的特定位置处的一个氨基酸。氨基酸取代可以使用本领域熟知的遗传方法或化学方法来产生。例如，单氨基酸取代或多氨基酸取代(例如，保守氨基酸取代或非保守氨基酸取代)可以在天然存在的序列中进行(例如，在形成分子间接触的结构域以外的多肽部分中)。
[0101] 术语“保守氨基酸取代”是其中一个氨基酸残基被具有相似化学特性的侧链的另一个氨基酸残基取代。具有相似侧链的氨基酸残基的家族通常已在本领域中定义，包括碱性侧链(例如，赖氨酸、精氨酸、组氨酸)、酸性侧链(例如，天冬氨酸、谷氨酸)、不带电的极性侧链(例如，甘氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸、酪氨酸、半胱氨酸)、非极性侧链(例如，丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、甲硫氨酸、色氨酸)、β‑分支侧链(例如，苏氨酸、缬氨酸、异亮氨酸)和芳香族侧链(例如，酪氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、组氨酸)。例如，用酪氨酸取代苯丙氨酸是保守取代。通常，本披露的多肽、可溶性蛋白质和/或抗体的序列中的保守取代不会消除含有氨基酸序列的多肽、可溶性蛋白质或抗体与靶结合位点的结合。鉴定不消除结合的氨基酸保守取代的方法是本领域熟知的。
[0102] 术语“非保守氨基酸取代”是指这些类别之一的成员取代为来自另一类别的成员。在进行这样的改变时，根据各种实施方案，可以考虑氨基酸的亲水指数(hydropathic index)。基于氨基酸的疏水性和电荷特征，每种氨基酸已经被指定了亲水指数。它们是：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；
甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(‑0.4)；苏氨酸(‑0.7)；丝氨酸(‑0.8)；色氨酸(‑
0.9)；酪氨酸(‑1.3)；脯氨酸(‑1.6)；组氨酸(‑3.2)；谷氨酸(‑3.5)；谷氨酰胺(‑3.5)；天冬氨酸(‑3.5)；天冬酰胺(‑3.5)；赖氨酸(‑3.9)和精氨酸(‑4.5)。
甲硫氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(‑0.4)；苏氨酸(‑0.7)；丝氨酸(‑0.8)；色氨酸(‑
0.9)；酪氨酸(‑1.3)；脯氨酸(‑1.6)；组氨酸(‑3.2)；谷氨酸(‑3.5)；谷氨酰胺(‑3.5)；天冬氨酸(‑3.5)；天冬酰胺(‑3.5)；赖氨酸(‑3.9)和精氨酸(‑4.5)。
[0103] 本领域理解亲水氨基酸指数在赋予蛋白相互作用的生物功能中的重要性。已知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数或评分的其他氨基酸取代，并且仍保持相似的生物活性。
[0104] 如本发明所用的与BCMA特异性结合的抗体片段scFv(或称为“BCMA结合结构域”)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列相比，具有包含一个或多个(例如，约1至约25、约1至约20、约1至约15、约1至约10或约1至约5个)氨基酸序列取代、缺失和/或添加的多肽的不同结合部分，BCMA结合结构域至少保留与BCMA的特异性结合的活性部分。具体地，可以通过取代SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列中的一部分氨基酸来获得本发明中所使用的BCMA结合结构域。通过氨基酸取代获得的本发明所使用的BCMA结合结构域的一个实施方案可以通过取代如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列中的第102、103、172、175、192或193位氨基酸中的至少一个来获得。在本发明的具体实施方案中，所述BCMA结合结构域包含SEQ ID NO.1的氨基酸残基位置Y102、N103、N172、N175、T192和S193的氨基酸取代；在本发明的具体实施方案中，所述氨基酸取代为Y102H、N103G、N172G、N175G、T192A和S193G；进一步，本发明所使用的BCMA结合结构域的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
[0105] 如本发明所用，当在两个或更多个核酸或蛋白质/多肽序列在上下文中的任何地方使用时，术语“％同一性”是指如使用序列比较算法或通过手动比对和目视检查(参见例如NCBI网站)所测量的，两个或更多个序列或子序列是相同的或具有(或至少具有)相同的特定百分比的氨基酸残基或核苷酸(即，当比较并比对以在比较窗口或指定区域上获得最大对应性时，在指定区域中(优选在其全长序列上)具有或至少具有约60％的同一性，优选具有或至少具有65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％或94％的同一性，更优选地具有或至少具有约95％、96％、97％、98％、99％或更高的同一性)。
[0106] 在本发明中，术语“分离”或“分离的”通常指从天然状态下经人工手段获得的。如果自然界中出现某一种“分离”的物质或成分，那么可能是其所处的天然环境发生了改变，或从天然环境下分离出该物质，或二者情况均有发生。例如，某一活体动物体内天然存在某种未被分离的多聚核苷酸或多肽，而从这种天然状态下分离出来的高纯度的相同的多聚核苷酸或多肽即称之为分离的。术语“分离的”不排除混有人工或合成的物质，也不排除存在不影响物质活性的其它不纯物质。
[0107] 本发明所使用的术语“分离的核酸分子”通常指任何长度的分离形式的核苷酸，脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸，或从其天然环境分离的或人工合成的类似物。
[0108] 本发明中使用的术语“编码”是指多核苷酸比如基因、cDNA或mRNA中的核苷酸的特异性序列在生物学过程中作为合成其它聚合物和大分子的模板的固有特性，该聚合物以及大分子具有确定的核苷酸序列(例如，rRNA、tRNA和mRNA)或确定的氨基酸序列及由其得到的生物学特性。因此，如果与所述基因对应的mRNA的转录和翻译在细胞或其它生物系统中产生蛋白质，则基因、cDNA或RNA编码蛋白质。其核苷酸序列与mRNA序列相同且通常被提供在序列表中的编码链和用作转录基因或cDNA的模板的非编码链这两者都可以被称为编码该基因或cDNA的蛋白或其他产物。
[0109] 在本发明中，术语“载体”通常指可将编码某蛋白的多聚核苷酸插入其中并使蛋白获得表达的一种核酸运载工具。载体可通过转化、转导或转染宿主细胞，使其携带的遗传物质元件在宿主细胞内表达得以表达。
[0110] 本发明中使用的术语“克隆载体”被定义为能够将DNA片段携带并复制到宿主细胞中的物质。在本发明中，克隆载体可以进一步包括多聚腺苷化信号、转录终止序列和多个克隆位点。在这种情况下，多个克隆位点包括至少一个核酸内切酶限制性酶切位点。此外，克隆载体可以进一步包括启动子。此外，本发明中使用的术语“表达载体”被定义为在合适宿主中转录和翻译克隆的DNA所需的DNA序列。进一步，本发明中使用的术语“表达载体”是指包含与插入序列可操作地连接的必需调节元件的基因构建体，使得如果它存在于个体的细胞中则该插入序列被表达。可以用标准重组DNA技术产生和纯化表达载体。表达载体的种类没有特别限制，只要它具有在原核和真核细胞等各种宿主细胞中表达期望基因并制备期望蛋白质的功能。但它优选是能够以类似于自然状态的形式产生大量外源蛋白的载体，同时具有表现出强活性和强表达能力的启动子。表达载体优选至少包含启动子、起始密码子、编码期望蛋白的基因和终止密码子。此外，它可以适当地包括编码信号肽、另外的表达控制序列、期望基因5’和3’端的非翻译区、选择标记区域、复制单元等的DNA。
[0111] 举例来说，载体包括：DNA载体；RNA载体；质粒；转座子载体；CRISPR/Cas9载体；噬菌粒；柯斯质粒；人工染色体如酵母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1来源的人工染色体(PAC)；噬菌体如λ噬菌体或M13噬菌体及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。将显而易见的是，根据本发明公开的病毒载体不必局限于特定病毒的组分，病毒载体可包含来源于两种或更多种不同病毒的组分，并且还可包含合成组分。在本发明的具体实施例中，载体为慢病毒载体。一种载体可能含有多种控制表达的元件，包括启动子序列、转录起始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外，载体还可含有复制起始位点。载体还有可能包括有协助其进入细胞的成分，如病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳，但不仅仅只有这些物质。
[0112] 如本发明所用，术语“慢病毒(lentiviral或lentivirus)”是指复杂逆转录病毒的组(或属)。慢病毒在逆转录病毒中是独特的，其能够感染非分裂细胞；它们可以将大量的遗传信息递送到宿主细胞的DNA中，因此它们是基因递送载体的最有效方法之一。慢病毒包括但不限于：人免疫缺陷病毒(HIV)，包含HIV类型和2型HIV；维斯纳—梅迪病毒(VMV)病毒；山羊关节炎—脑炎病毒(CAEV)；马传染性贫血病毒(EIAV)；猫免疫缺陷病毒(FIV)；牛免疫缺陷病毒(BIV)；以及猿猴免疫缺陷病毒(SIV)。衍生自慢病毒的载体提供了实现显著水平的体内基因转移的手段。
[0113] 在本发明中，术语“表达”指基因产物的生物合成，优选指细胞中核苷酸序列(例如内源基因或异源基因)的转录和/或翻译。例如，在结构基因的情况下，表达涉及结构基因转录为mRNA，及可选地，随后mRNA翻译为一条或多条多肽。
[0114] 在本发明中，术语“免疫细胞”指可以引发免疫应答的细胞，“免疫细胞”及其语法上的其他形式可以指任何来源的免疫细胞。术语“免疫细胞”也可以是人或非人的。“免疫细胞”包括但不限于白细胞、T细胞、B细胞、NK细胞、NKT细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞、髓样细胞或其任意组合。进一步，所述免疫细胞为T细胞；更进一步，所述T细胞实例包含但不限于原代T细胞(“淋巴细胞祖细胞”)、中央记忆T细胞、效应记忆T细胞、T记忆干细胞(Tscm)、iPSC衍生的T细胞、合成T细胞、Jurkat细胞或其组合。
[0115] 在本发明中，术语“T细胞”或“T淋巴细胞”是本领域技术人员理解的术语，并且意指在胸腺中发育并在免疫反应中起核心作用的淋巴细胞类型。通过在细胞表面上存在T细胞受体(TCR)，可以将T细胞与其他淋巴细胞区分开来。术语“原代T细胞”意指包括获自个体的T细胞，与在培养物中维持了延长的时间段的T细胞不同。因此，原代T细胞特别是获自受试者的外周血T细胞。原代T细胞的群体可以主要由T细胞的一个子集组成。备选地，原代T细胞的群体可以由T细胞的不同子集组成。术语“Jurkat细胞”或“Jurkat”意指人T淋巴细胞的永生化细胞系，并广泛用于研究急性T细胞白血病、T细胞信号传导和功能荧光素酶。
[0116] 如本发明所用，术语“引入”指代将包含编码抗体的多核苷酸的载体递送到宿主细胞中的方法。这种引入可通过本领域已知的不同方法进行，包括但不限于使用脂质转染法、DNA载体、RNA载体、质粒、转座子载体、CRISPR/Cas9载体、磷酸钙‑DNA共沉淀、DEAE‑葡聚糖介导的转染、聚凝胺介导的转染、电穿孔、微注射和原生质体融合。另外，转染指利用病毒颗粒通过感染将期望的材料递送到细胞中。另外，载体可通过基因轰击被引入宿主细胞。
[0117] 在本发明中，术语“衍生物”可以是核酸分子，作为DNA分子，编码如上定义的多核苷酸，或包含如上定义的多核苷酸的核酸分子，或互补序列的多核苷酸。在本发明的上下文中，术语“衍生物”还指与提及的序列或其互补序列或其DNA或RNA对应序列具有例如至少41％、50％、60％、65％、70％或75％，更优选至少85％，例如至少90％，甚至更优选至少95％或100％的同一性百分比的更长或更短的多核苷酸和/或多肽。术语“衍生物”还包括修饰的合成寡核苷酸。术语“衍生物”还可包括核苷酸类似物，即天然存在的核糖核苷酸或被非天然存在的核苷酸取代的脱氧核糖核苷酸。术语“衍生物”还包括可通过突变其序列、等同物或前体序列中的一个或多个核苷酸或氨基酸产生的核酸或多肽。术语“衍生物”还包括多核苷酸的至少一个功能片段。
[0118] 在本发明中，术语“可检测标记”用于指明实体可通过分光、光化学、生物化学、免疫化学、电学、光学、化学或其他手段显现或另外检测。可选择可检测标记以使它产生可被测量，并且其强度与所结合实体的量成比例的信号。广泛多种用于标记和/或检测蛋白质和肽的系统在本领域中是已知的。标记可为直接可检测的(即它不需要任何其他反应或操作来达成可检测，例如荧光团是直接可检测的)，或它可为间接可检测的(即它通过与可检测的另一实体的反应或结合而可检测，例如半抗原在与包含报告体诸如荧光团的适当抗体反应之后可通过免疫染色检测)。可检测标记包括但不限于放射性核素、荧光团、化学发光剂、微粒、酶、比色标记、磁性标记、半抗原、分子信标或适体信标。
[0119] 在本发明中，术语“治疗剂”是指当以有效量存在时对有此需要的受试者产生所需治疗效果的化合物。治疗剂包括但不限于放射性核素、细胞因子、金纳米颗粒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶、化疗剂。
[0120] 在本发明中，组合物是指两种或更多种产物、物质或化合物(包括细胞)的任何混合物。其可以是溶液、悬浮液、液体、粉末、糊剂、水性、非水性或其任何组合。本发明中所使用的术语“药物组合物”是指呈使得一种或多种活性成分的生物活性有效的形式、并且不含对所述配制品所施用的受试者具有不可接受的毒性的其他组分的制剂。因此，它是适合于哺乳动物受试者(通常是人类)的医药用途的组合物。药物组合物通常包含有效量的活性剂和载体、赋形剂或稀释剂。载体、赋形剂或稀释剂通常分别是药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。此类配制品可以是无菌的。
[0121] 本发明中所用的术语“药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂”，所述载体、赋形剂或稀释剂包括任何和全部溶剂、稀释剂或其它液体溶媒、分散或悬浮助剂、表面活性剂、等渗剂、增稠或乳化剂、防腐剂、固体粘合剂、润滑剂等，只要对所需的具体剂型是合适的。除非任何常规的载体介质例如由于会产生任何不合乎需要的生物学效应或以别的方式与药物组合物的一种或多种任何其它组分以有害的方式相互作用而与本发明化合物不相容，否则任何常规载体介质的使用也被认为处于本发明的范围内。
[0122] 如本发明所使用，术语“试剂盒”是指用于递送物质的任何递送系统，包含但不限于用于研究和临床应用的试剂盒。此类递送系统包括容许从一个位置到另一位置反应试剂(例如适当的容器中的寡核苷酸、酶等)和/或支持物质(例如缓冲剂、用于进行分析的书面说明书等)的储存、转运、或递送的系统。
[0123] 本发明提供的制备的包含靶向BCMA的人源化嵌合抗原受体的产品可以诊断或治疗与BCMA表达相关的疾病。与BCMA表达相关的疾病包括但不限于：1)与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的疾病，包括例如增殖性疾病(如癌症或恶性肿瘤)或癌前病症(如骨髓增生异常、骨髓增生异常综合征或白血病前期)；或2)与表达BCMA(例如野生型或突变型BCMA)的细胞相关的非癌症相关适应症。
[0124] 为了避免疑义，与BCMA表达相关的疾病可以包括与目前不表达BCMA但曾经表达BCMA的细胞相关的病症。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是血液癌症。在一个方面，血液癌症是白血病或淋巴瘤。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症是分化的血浆B细胞的恶性肿瘤。在一个方面，与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的癌症包括癌症和恶性肿瘤，包括但不限于：例如一种或多种急性淋巴白血病，其包括但不限于例如B细胞急性淋巴细胞白血病(“BALL”)、T细胞急性淋巴细胞白血病(“TALL”)、急性淋巴细胞白血病(ALL)；一种或多种慢性白血病，包括但不限于例如慢性髓细胞性白血病(CML)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)。与BCMA(例如野生型或突变型BCMA)表达相关的其他癌症或血液病症包括但不限于例如B细胞幼淋巴细胞白血病、母细胞性浆细胞样树突细胞肿瘤、伯基特淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、毛细胞白血病、恶性淋巴组织增生症、MALT淋巴瘤、套细胞淋巴瘤、边缘区淋巴瘤、骨髓瘤(多发性骨髓瘤)、骨髓增生异常和骨髓增生异常综合征、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、浆母细胞性淋巴瘤、浆细胞样树突细胞肿瘤、胶质母细胞瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症、和“白血病前期”(这是由髓系血细胞的无效产生(或发育不良)联合的血液病症的多样化集合)。在本发明中，所述肿瘤为骨髓瘤或急性淋巴白血病；优选地，所述骨髓瘤为多发性骨髓瘤。
[0125] 与BCMA表达相关的其他疾病(例如野生型或突变型BCMA)表达包括但不限于例如非典型和/或非经典癌症、恶性肿瘤、与BCMA的表达相关的癌前病症或增殖性疾病(例如野生型或突变型BCMA)，例如前列腺癌(例如去势抗性或治疗抗性前列腺癌或转移前列腺癌)、胰腺癌或肺癌。
[0126] 与BCMA相关的非癌症相关病症(例如野生型或突变型BCMA)包括病毒感染，例如，HIV、真菌感染，例如新生隐球菌；自身免疫疾病；例如类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮(SLE或狼疮)、寻常型天疱疮和干燥综合征(Sjogren's syndrome)；炎症性肠病、溃疡性结肠炎；与粘膜免疫有关的移植相关的同种异体特异性免疫障碍；以及针对生物制剂(如因子VIII)而言不需要的免疫应答(其中体液免疫很重要)。在一些实施例中，与BCMA表达相关的非癌症相关适应症包括但不限于例如自身免疫疾病(例如狼疮)、炎性障碍(变态反应和哮喘)和移植。在一些实施例中，表达肿瘤抗原的细胞表达或在任何时间表达编码肿瘤抗原的mRNA。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞产生肿瘤抗原蛋白(例如野生型或突变体)，并且肿瘤抗原蛋白可以以正常水平或降低的水平存在。在一个实施例中，表达肿瘤抗原的细胞在一个时间点产生可检测水平的肿瘤抗原蛋白，并且随后基本上不产生可检测的肿瘤抗原蛋白。
[0127] 下面结合附图和实施例对本发明作进一步详细的说明。以下实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。根据本发明的实质对本发明进行的简单改进都属于本发明要求保护的范围。
[0128] 实施例1构建表达BCMA‑CAR或BCMA‑CARmut的Jurkat‑Reporter细胞1、构建3×NFAT Response element‑minIL‑2P‑EGFP Reporter系统
[0129] 1)3×NFAT转录因子应答元件(3×NFAT Response element)的核酸序列：
[0130] GGAGGAAAAACTGTTTCATACAGAAGGCGTACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCACGCCTTCTGTATGAAACAGTTTTTCCTCCTCGAGG；
[0131] 2)最小IL‑2启动子(minIL‑2P)的核酸序列：
[0132] ACATTTTGACACCCCCATAATATTTTTCCAGAATTAACAGTATAAATTGCATCTCTTGTTCAAGAGTTCCCTATCACTCTCTTTAATCACTACTCACAGTAACCTCAACTCCTGCCCAAGCTTGGCATTCCGGTACTGTTGGTAAA；
[0133] 3)报告基因EGFP的核酸序列：
[0134] GCCACCATGGTGAGCAAGGGCGAGGAGCTGTTCACCGGGGTGGTGCCCATCCTGGTCGAGCTGGACGGCGACGTAAACGGCCACAAGTTCAGCGTGTCCGGCGAGGGCGAGGGCGATGCCACCTACGGCAAGCTGACCCTGAAGTTCATCTGCACCACCGGCAAGCTGCCCGTGCCCTGGCCCACCCTCGTGACCACCCTGACCTACGGCGTGCAGTGCTTCAGCCGCTACCCCGACCACATGAAGCAGCACGACTTCTTCAAGTCCGCCATGCCCGAAGGCTACGTCCAGGAGCGCACCATCTTCTTCAAGGACGACGGCAACTACAAGACCCGCGCCGAGGTGAAGTTCGAGGGCGACACCCTGGTGAACCGCATCGAGCTGAAGGGCATCGACTTCAAGGAGGACGGCAACATCCTGGGGCACAAGCTGGAGTACAACTACAACAGCCACAACGTCTATATCATGGCCGACAAGCAGAAGAACGGCATCAAGGTGAACTTCAAGATCCGCCACAACATCGAGGACGGCAGCGTGCAGCTCGCCGACCACTACCAGCAGAACACCCCCATCGGCGACGGCCCCGTGCTGCTGCCCGACAACCACTACCTGAGCACCCAGTCCGCCCTGAGCAAAGACCCCAACGAGAAGCGCGATCACATGGTCCTGCTGGAGTTCGTGACCGCCGCCGGGATCACTCTCGGCATGGACGAGCTGTACAAGTAA。
[0135] 3×NFAT Response element‑minIL‑2P‑EGFP Reporter系统的核酸序列包含3×NFAT转录因子应答元件、最小IL‑2启动子、报告基因EGFP依次连接的核酸序列。将3×NFAT Response element‑minIL‑2P‑EGFP Reporter系统的核苷酸序列克隆至pHAGE‑EF1α载体，构建了携带Reporter系统的慢病毒穿梭质粒。
[0136] 2、BCMA‑CAR、BCMA‑CARmut的氨基酸序列和核酸序列
[0137] 1)BCMA‑CAR的scFv氨基酸序列(SEQ ID NO.1)：
[0138] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIYNGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISNYLNWYQQKPGKAPKLLIYYTSNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR；
[0139] 2)BCMA‑CAR的scFv核酸序列(SEQ ID NO.2)：
[0140] CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGACTTGAATGGATGGGCGCCACCTACAGAGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCATCACCGCCGACAAGTCTACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGAGGCGCCATCTACAACGGCTACGACGTGCTGGATAATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTAGTGGTGGTGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATTACCTGTAGCGCCAGCCAGGACATCTCCAACTACCTGAACTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCTAAGCTGCTGATCTACTACACCAGCAACCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTACCGGAAGCTGCCCTGGACATTTGGACAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGG；
[0141] 3)BCMA‑CARmut的scFv氨基酸序列(SEQ ID NO.3)：
[0142] QVQLVQSGAEVKKPGSSVKVSCKASGGTFSNYWMHWVRQAPGQGLEWMGATYRGHSDTYYNQKFKGRVTITADKSTSTAYMELSSLRSEDTAVYYCARGAIHGGYDVLDNWGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGSDIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCSASQDISGYLGWYQQKPGKAPKLLIYYAGNLHSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYCQQYRKLPWTFGQGTKLEIKR；
[0143] 4)BCMA‑CARmut的scFv核酸序列(SEQ ID NO.4)：
[0144] CAGGTTCAGCTGGTTCAGTCTGGCGCCGAAGTGAAGAAACCTGGCAGCAGCGTGAAGGTGTCCTGCAAAGCTTCTGGCGGCACCTTCAGCAACTACTGGATGCACTGGGTCCGACAGGCCCCTGGACAAGGACTTGAATGGATGGGCGCCACCTACAGAGGCCACAGCGACACCTACTACAACCAGAAATTCAAGGGCCGCGTGACCATCACCGCCGACAAGTCTACAAGCACCGCCTACATGGAACTGAGCAGCCTGAGAAGCGAGGACACCGCCGTGTACTATTGTGCCAGAGGCGCCATCCATGGTGGCTACGACGTGCTGGATAATTGGGGCCAGGGCACCCTGGTCACAGTTTCTAGCGGAGGCGGAGGATCTGGTGGCGGAGGAAGTGGCGGAGGCGGTAGTGGTGGTGGCGGATCTGATATCCAGATGACACAGAGCCCCAGCAGCCTGTCTGCCTCTGTGGGAGACAGAGTGACCATTACCTGTAGCGCCAGCCAGGACATCTCCGGTTACCTGGGTTGGTATCAGCAGAAGCCCGGCAAGGCCCCCAAGCTCCTGATCTACTACGCCGGTAACCTGCACAGCGGCGTGCCCAGCAGATTTTCTGGCTCTGGCAGCGGCACCGACTTCACCCTGACCATATCTAGCCTGCAGCCAGAGGACTTCGCCACCTATTACTGCCAGCAGTACCGGAAGCTGCCCTGGACATTTGGACAGGGCACCAAGCTGGAAATCAAGCGG；
[0145] 5)CD8铰链区氨基酸序列(SEQ ID NO.5)：
[0146] TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACD；
[0147] 6)CD8铰链区核酸序列(SEQ ID NO.6)：
[0148] ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT；
[0149] 7)CD8跨膜结构域氨基酸序列(SEQ ID NO.7)：
[0150] IYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC；
[0151] 8)CD8跨膜结构域核酸序列(SEQ ID NO.8)：
[0152] ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT；
[0153] 9)4‑1BB共刺激信号结构域氨基酸序列(SEQ ID NO.9)：
[0154] KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL；
[0155] 10)4‑1BB共刺激信号结构域核酸序列(SEQ ID NO.10)：
[0156] AAGCGCGGTCGGAAGAAGCTGCTGTACATCTTTAAGCAACCCTTCATGAGGCCTGTGCAGACTACTCAAGAGGAGGACGGCTGTTCATGCCGGTTCCCAGAGGAGGAGGAAGGCGGCTGCGAACTG；
[0157] 11)CD3ζ胞内信号传导结构域氨基酸序列(SEQ ID NO.11)：
[0158] RVKFSRSADAPAYKQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPRZ；
[0159] 12)CD3ζ胞内信号传导结构域核酸序列(SEQ ID NO.12)：
[0160] CGCGTGAAATTCAGCCGCAGCGCAGATGCTCCAGCCTACAAGCAGGGGCAGAACCAGCTCTACAACGAACTCAATCTTGGTCGGAGAGAGGAGTACGACGTGCTGGACAAGCGGAGAGGACGGGACCCAGAAATGGGCGGGAAGCCGCGCAGAAAGAATCCCCAAGAGGGCCTGTACAACGAGCTCCAAAAGGATAAGATGGCAGAAGCCTATAGCGAGATTGGTATGAAAGGGGAACGCAGAAGAGGCAAAGGCCACGACGGACTGTACCAGGGACTCAGCACCGCCACCAAGGACACCTATGACGCTCTTCACATGCAGGCCCTGCCGCCTCGGTAA；
[0161] 13)CD8信号肽(CD8SP)氨基酸序列(SEQ ID NO.13)：MALPVTALLLPLALLLHAARP；
[0162] 14)CD8信号肽核酸序列(SEQ ID NO.14)：
[0163] ATGGCCCTCCCTGTCACCGCCCTGCTGCTTCCGCTGGCTCTTCTGCTCCACGCCGCTCGGCCC。
[0164] mut代表突变体，5’LTR代表5’端启动子，3’LTR代表3’端启动子。
[0165] BCMA‑CAR的氨基酸序列为SEQ ID NO.13、1、5、7、9、11依次连接所构成的氨基酸序列；BCMA‑CAR的核酸序列为SEQ ID NO.14、2、6、8、10、12依次连接所构成的核酸序列；BCMA‑mutCAR 的氨基酸序列为SEQ ID NO.13、3、5、7、9、11依次连接所构成的氨基酸序列；BCMA‑mut
CAR 的核酸序列为SEQ ID NO.14、4、6、8、10、12依次连接所构成的核酸序列。
CAR 的核酸序列为SEQ ID NO.14、4、6、8、10、12依次连接所构成的核酸序列。
[0166] 表1 scFv序列上突变位点的序列比对
[0167]突变位点(aa) 突变前密码子 突变后密码子
102 TAC(Y) CAT(H)
103 AAC(N) GGT(G)
172 AAC(N) GGT(G)
175 AAC(N) GGT(G)
192 ACC(T) GCC(A)
193 AGC(S) GGT(G)
102 TAC(Y) CAT(H)
103 AAC(N) GGT(G)
172 AAC(N) GGT(G)
175 AAC(N) GGT(G)
192 ACC(T) GCC(A)
193 AGC(S) GGT(G)
[0168] 2、Jurkat‑Reporter稳转细胞株的构建
[0169] 将携带Reporter系统的慢病毒感染Jurkat细胞，通过单克隆分选，最终获得一株2+
Jurkat‑Reporter细胞。该细胞接受外界刺激，引发Ca 内流，导致NFAT活化、入核，结合到NFAT应答元件上，启动EGFP表达。通过荧光显微镜和流式细胞仪我们可以直观、实时监测TCR信号活性的改变，并对其强度进行定量分析。
Jurkat‑Reporter细胞。该细胞接受外界刺激，引发Ca 内流，导致NFAT活化、入核，结合到NFAT应答元件上，启动EGFP表达。通过荧光显微镜和流式细胞仪我们可以直观、实时监测TCR信号活性的改变，并对其强度进行定量分析。
[0170] 3、构建BCMA‑CAR或BCMA‑CARmut过表达的Jurkat‑Reporter细胞
[0171] 将装载BCMA‑CAR或BCMA‑CARmut的慢病毒分别感染Jurkat‑Reporter细胞，获得mutBCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter细胞和BCMA‑CAR ‑Jurkat‑Reporter细胞，使用APC‑Protein‑mut
L染色，流式细胞检测BCMA‑CAR或BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度。对照组
(Control)为Jurkat‑Reporter细胞。
L染色，流式细胞检测BCMA‑CAR或BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度。对照组
(Control)为Jurkat‑Reporter细胞。
[0172] 4、实验结果
[0173] 结果如图3所示，BCMA‑CAR或BCMA‑CARmut在Jurkat‑Reporter细胞上都能高水平表mut达，BCMA‑CAR或BCMA‑CAR 的阳性表达率均高于94％，平均荧光强度分别为3395、4344。表mut
明BCMA‑CAR或BCMA‑CAR 均可用于后续CAR功能活性评价，避免了CAR表达水平差异对实验结果的干扰。
明BCMA‑CAR或BCMA‑CAR 均可用于后续CAR功能活性评价，避免了CAR表达水平差异对实验结果的干扰。
[0174] 实施例2比较装载BCMA‑CAR或BCMA‑CARmut的Reporter细胞对化学及生物学刺激的反应性
[0175] 1、接受化学刺激后TCR信号的强度
[0176] 佛波酯(PMA)联合离子载体离子霉素(Ionomycin)分别处理BCMA‑CAR‑Jurkat‑mutReporter细胞及BCMA‑CAR ‑Jurkat‑Reporter细胞，12h后流式细胞检测GFP阳性表达率和平均荧光强度。对照组(Control)为Jurkat‑Reporter细胞。
[0177] 2、筛选BCMA阳性表达细胞
[0178] Nalm6‑BCMA‑GFP一株外源过表达BCMA的淋巴白血病细胞，通过将装载BCMA‑GFP的慢病毒感染Nalm6细胞，加压筛选获得；U266细胞一株内源高表达BCMA的骨髓瘤细胞。使用PE‑CD269染色，流式细胞检测靶细胞表面BCMA表达水平。
[0179] 3、接受生物学刺激后TCR信号的强度
[0180] 将BCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter细胞和BCMA‑CARmut‑Jurkat‑Reporter细胞按效靶比1:2.5，分别与U266细胞或Nalm6‑BCMA‑GFP细胞共孵育，24h后流式细胞检测GFP表达水平。
[0181] 4、实验结果
[0182] 接受化学刺激的反应性及反应强度的结果如图4所示，对照组细胞、BCMA‑CAR‑mutJurkat‑Reporter细胞及BCMA‑CAR ‑Jurkat‑Reporter细胞的GFP阳性表达率分别为
64.13％、60.34％、60.86％，平均荧光强度分别为1150、1002、1007。表明PMA联合Ionomycin刺激，可激活Reporter系统，显著上调3种细胞GFP表达水平。且GFP表达在3种Reporter细胞mut
中具有相近的变化趋势与变化强度，提示装载BCMA‑CAR或BCMA‑CAR 不会对Reporter系统的反应性产生明显影响。因此可将2种过表达CAR的Reporter细胞作为工具细胞，用于后续CAR功能、活性的比较。
64.13％、60.34％、60.86％，平均荧光强度分别为1150、1002、1007。表明PMA联合Ionomycin刺激，可激活Reporter系统，显著上调3种细胞GFP表达水平。且GFP表达在3种Reporter细胞mut
中具有相近的变化趋势与变化强度，提示装载BCMA‑CAR或BCMA‑CAR 不会对Reporter系统的反应性产生明显影响。因此可将2种过表达CAR的Reporter细胞作为工具细胞，用于后续CAR功能、活性的比较。
[0183] 筛选BCMA阳性表达细胞的结果如图5所示，Nalm6‑BCMA‑GFP细胞中的BCMA阳性表达率39.51％，平均荧光强度上调15倍，提示Nalm6‑BCMA‑GFP细胞构建成功；约91.94％的U266细胞呈BCMA强阳性表达，平均荧光强度高达1660，远超Nalm6‑BCMA‑GFP细胞的457。以上结果表明Nalm6‑BCMA‑GFP细胞和U266细胞均可作为靶细胞用于CAR功能活性检测。
[0184] 接受生物学刺激后TCR信号的强度的结果如图6所示，与U266细胞共孵育可上调2mut种Reporter细胞GFP表达水平，尤以BCMA‑CAR ‑Jurkat‑Reporter细胞更明显，GFP阳性表达率高达59.70％，是BCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter细胞的2.5倍；与Nalm6‑BCMA‑GFP细胞共mut
孵育也可以上调2种Reporter细胞GFP表达水平，其中，BCMA‑CAR ‑Jurkat‑Reporter细胞的GFP阳性表达率为23.25％，是BCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter细胞的2.3倍。表明突变后的mut
BCMA‑CAR接受靶抗原刺激后，可激发更强的TCR信号。初步提示，BCMA‑CAR ‑T可能具有更强的杀伤活性。
孵育也可以上调2种Reporter细胞GFP表达水平，其中，BCMA‑CAR ‑Jurkat‑Reporter细胞的GFP阳性表达率为23.25％，是BCMA‑CAR‑Jurkat‑Reporter细胞的2.3倍。表明突变后的mut
BCMA‑CAR接受靶抗原刺激后，可激发更强的TCR信号。初步提示，BCMA‑CAR ‑T可能具有更强的杀伤活性。
[0185] 实施例3构建BCMA‑CAR‑T和BCMA‑CARmut‑T细胞
[0186] 1、实验方法
[0187] 分离、纯化多发性骨髓瘤患者PBMC中的T细胞，分别感染携带BCMA‑CAR和BCMA‑mut mutCAR 的慢病毒，成功制备BCMA‑CAR‑T和BCMA‑CAR ‑T细胞。使用APC‑Protein‑L染色，流式mut
细胞检测BCMA‑CAR和BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度。
细胞检测BCMA‑CAR和BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度。
[0188] 2、实验结果
[0189] 结果如图7所示，BCMA‑CAR和BCMA‑CARmut的阳性表达率分别为43.73％和43.19％，平均荧光强度611和562。2种CAR在T细胞上的表达水平相近，可减少CAR差异表达对后续功能实验结果的干扰。
[0190] 实施例4 RTCA评估BCMA‑CAR‑T和BCMA‑CARmut‑T杀伤功能
[0191] 1、实验方法
[0192] 将装载BCMA的慢病毒感染CHO细胞，加压筛选获得一株稳定表达BCMA的细胞(CHO‑BCMA)。使用PE‑CD269染色，流式细胞检测BCMA的阳性表达率。
[0193] 利用RTCA技术对BCMA‑CAR‑T、BCMA‑CARmut‑T的杀伤功能进行检测。先将CHO‑BCMA4 mut
细胞按10/孔接种到细胞培养板中。次日，再将Mock‑T、BCMA‑CAR‑T、BCMA‑CAR ‑T细胞按效靶比1:1或1:5加入对应的孔中。通过实时、连续监测贴壁细胞信号改变，间接反映CAR‑T细胞对靶细胞的杀伤活性。
细胞按10/孔接种到细胞培养板中。次日，再将Mock‑T、BCMA‑CAR‑T、BCMA‑CAR ‑T细胞按效靶比1:1或1:5加入对应的孔中。通过实时、连续监测贴壁细胞信号改变，间接反映CAR‑T细胞对靶细胞的杀伤活性。
[0194] 2、实验结果
[0195] 流式细胞检测结果如图8所示，约62.16％的CHO细胞表达BCMA，表明CHO‑BCMA细胞构建成功；
[0196] RTCA实时监测结果如图9所示，无论效靶比是1:1还是1:5，BCMA‑CARmut‑T细胞对靶细胞的杀伤均显著强于BCMA‑CAR‑T细胞。
[0197] 实施例5流式细胞检测评估BCMA‑CAR‑T和BCMA‑CARmut‑T杀伤功能
[0198] 1、实验方法
[0199] 分离、纯化正常人来源的T细胞，分别感染携带BCMA‑CAR和BCMA‑CARmut的慢病毒，mut成功制备BCMA‑CAR‑T和BCMA‑CAR ‑T细胞。使用FITC‑CD34染色，流式细胞检测BCMA‑CAR和mut
BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度。
BCMA‑CAR 阳性表达率及平均荧光强度。
[0200] 将Mock‑T、BCMA‑CAR‑T和BCMA‑CARmut‑T细胞，按效靶比2:1、1:1、1:3，分别与U266细胞共孵育。48h后流式细胞检测剩余细胞中CAR‑T细胞和靶细胞(残余肿瘤细胞)的占比。
[0201] 3、实验结果
[0202] 流式细胞检测BCMA‑CAR和BCMA‑CARmut阳性表达率及平均荧光强度的结果如图10mut所示，BCMA‑CAR和BCMA‑CAR 在T细胞上的阳性表达率分别为66.57％和64.43％，且2者平均荧光强度相近，因此可作为效应细胞，用于CAR‑T杀伤功能检测实验。
[0203] 流式细胞检测不同CAR‑T杀伤靶细胞U266时的活性差异结果如图11所示，3个效靶mut比下，BCMA‑CAR‑T组残余肿瘤细胞的比例均显著高于BCMA‑CAR ‑T组，统计分析结果亦如此。表明突变BCMA scFv序列上的特定位点，可提高BCMA‑CAR‑T的抗肿瘤活性。该组数据也进一步佐证了RTCA的实验结果。
[0204] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。