青春双歧杆菌BA-3及其在抗衰老、抗氧化和抗炎中的应用

摘要

本发明属于微生物领域，具体涉及青春双歧杆菌BA‑3及其在抗衰老、抗氧化和抗炎中的应用。本发明的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3能够打破自由基‑氧化应激‑炎症‑氧化应激‑自由基的恶性循环，并能实现多方面综合改善，因而在用于抗衰老、抗氧化和抗炎时均具有显著优于同种其他菌株的性能优势。

权利要求

1.青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3，其保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO.27625。

2. 菌剂，其含有权利要求1所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3。

3. 权利要求1所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或权利要求2所述的菌剂在以下至少一方面的非疾病治疗用途的应用：1）抗衰老；2）抗氧化；3）抗炎。

4. 权利要求1所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或权利要求2所述的菌剂在制备组合物中的应用，所述组合物被用于以下至少一方面：1）抗衰老；2）抗氧化；3）抗炎。

5. 根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述菌剂被用于降低促炎因子的水平。

6.根据权利要求5所述的应用，其中，所述促炎因子包括TNF‑α、IL‑1β和IL‑6中的一种或多种。

7. 根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述菌剂被用于以下至少一种目的：a）提升抗氧化酶的活性；所述抗氧化酶包括SOD；b）降低过氧化产物的水平；所述过氧化产物包括MDA。

8.根据权利要求3或4所述的应用，其中，所述应用的施用对象包括人和除人外的其他动物。

9.根据权利要求4所述的应用，其中，所述组合物为饲料组合物、皮肤外用组合物或药物组合物。

10. 食品组合物，其中含有权利要求1所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或权利要求2所述的菌剂。

11. 饲料组合物，其中含有权利要求1所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或权利要求2所述的菌剂。

12. 皮肤外用组合物，其中含有权利要求1所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或权利要求2所述的菌剂。

13. 药物组合物，其中含有权利要求1所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或权利要求2所述的菌剂。

说明书

青春双歧杆菌BA‑3及其在抗衰老、抗氧化和抗炎中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物领域，具体涉及青春双歧杆菌BA‑3及其在抗衰老、抗氧化和抗炎中的应用。

背景技术

[0002] 衰老是生物体内自然发生而又无法避免的一个生理过程，当前普遍认为，抗衰老的根本目的在于尽可能地延长寿命，并在此基础上提高生命活力。但目前尚未有公认有效的延缓衰老的干预措施，因此，对衰老的机制进行深入研究、并开发安全有效的抗衰老产品具有重要意义。

[0003] 衰老通常伴随着一种慢性、低度、全身性炎症，涉及到炎症网络激活和相关细胞因子的释放，包括关键的促炎介质如TNF‑α、IL‑6以及IL‑1β等，这一过程是诱导衰老及衰老相关疾病的重要驱动力。同时，衰老也与氧化应激状态有着密不可分的关系。在1956年，美国的Harman提出了著名的自由基学说。该学说提出，在正常情况下，机体中氧自由基的生成与清除保持平衡。但是，随着年龄的增长，机体清除自由基的能力下降，自由基生成与清除的平衡被打破，氧自由基的生成量超过了细胞的抗氧化能力，便会使机体处于氧化应激状态并导致衰老。实际上，炎症状态亦与氧化应激状态密切相关，自由基所致的氧化应激与炎症通过调控转录水平进而相互影响，通过氧化应激加重炎症反应，炎症再通过炎症介质促进氧化状态，形成自由基‑氧化应激‑炎症‑氧化应激‑自由基的恶性循环。

[0004] 从人出生至衰老死亡，肠道菌群始终处在动态变化的过程中。在国内外不同人群队列研究均证实，不同年龄层的肠道菌群构成和丰度有明显差异。研究表明，机体逐渐衰老进入老年后，双歧杆菌、拟杆菌等数量和丰度显著下降，梭杆菌等兼性厌氧菌数量显著上升，肠道微生物群的多样性减少，个体之间差异的变化大于年轻人。在菌株层面，更有研究表明，肠道中青春双歧杆菌的丰度均会随年龄增长而显著下降。

[0005] 于2021年在《Nature Aging》上发表的研究成果表明，膳食补充模式菌株青春双歧杆菌ATCC15703可能通过上调宿主的过氧化氢酶（Catalase, CAT）的表达与活性，延长多种动物模型的健康寿命和寿命。

[0006] 另有《Gut Microbes》报道青春双歧杆菌可以通过诱导保护性的Th2/Treg反应和重塑肠道微生物群，来缓解DSS诱导的慢性结肠炎，提示青春双歧杆菌或可提高炎症性肠病的临床治疗效果。

发明内容

[0007] 本发明从健康年轻女性人体中筛选得到三株优势候选青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4、BA‑11，先通过LPS（脂多糖）诱导小鼠炎症模型，通过对促炎因子TNF‑α、IL‑6、IL‑1β水平、SOD活性以及MDA水平的检验，验证了青春双歧杆菌BA‑3具有显著更优的抗炎和抗氧化作用。接着进行果蝇体内抗衰实验，并与已知具有抗衰功能的模式菌株ATCC15703进行对比，证明了青春双歧杆菌BA‑3在生物体衰老延缓方面的效果明显优于ATCC15703。

[0008] 基于上述发现，本发明首先提供了青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3，该菌株于2023年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis，保藏编号为CGMCC NO.27625。

[0009] 进一步的，本发明还提供一种菌剂，其含有所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3。

[0010] 在一些实施方案中，所述菌剂可以为液体菌剂或固体菌剂。

[0011] 在一些实施方案中，所述菌剂中还含有其他功能菌。

[0012] 在一些实施方案中，所述菌剂中还含有微生物制剂领域允许的辅料。

[0013] 在具体实施方案时，所述菌剂可以采用常规技术手段制备得到。

[0014] 进一步的，本发明还提供一种发酵物或发酵萃取物，其由所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3发酵得到。

[0015] 本发明中，青春双歧杆菌BA‑3经发酵后得到的发酵液上清和菌体在抗衰老、抗氧化和抗炎中均有积极的效果。

[0016] 本发明中，所述发酵物为将所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3经发酵后得到的发酵液上清和/或菌体。

[0017] 本发明中，所述发酵萃取物为将所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3经发酵后得到的发酵液上清和/或菌体的有机溶剂萃取物。

[0018] 进一步的，本发明还提供所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述的菌剂或所述的发酵物或发酵萃取物在以下至少一方面的应用：1）抗衰老；2）抗氧化；3）抗炎。

[0019] 本发明中所提到的“抗衰老”也可以被理解为“延缓衰老”、“预防或减缓衰老迹象”、“延长寿命”等类似意思。同样的，本发明中所提到的“抗氧化”也可以被理解为“预防或减少过氧化损伤”、“消除过多的氧化自由基” 等类似意思。本发明中所提到的“抗炎”也可以被理解为“预防或减少炎症”等类似意思。本发明菌株、菌剂或其发酵物或发酵萃取物在上述方面的应用也属于本发明保护范围。

[0020] 进一步的，本发明还提供所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述的菌剂或所述的发酵物或发酵萃取物在制备组合物中的应用，所述组合物被用于以下至少一方面：1）抗衰老；2）抗氧化；3）抗炎。

[0021] 在一些实施方案中，所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述菌剂或所述发酵物或发酵萃取物被用于降低促炎因子的水平。

[0022] 优选地，所述促炎因子包括TNF‑α（肿瘤坏死因子‑α；Tumor necrosis factor‑α）、IL‑1β（白细胞介素‑1β；Interleukin‑1β）和IL‑6（白细胞介素‑6；Interleukin‑6）中的一种或多种。TNF‑α、IL‑1β和IL‑6等均是在体内炎症中起到重要作用的促炎因子，其水平变化可以体现体内的炎症情况。

[0023] 在一些实施方案中，所述青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述菌剂或所述发酵物或发酵萃取物被用于以下至少一种目的：a）提升抗氧化酶的活性；b）降低过氧化产物的水平。

[0024] 优选地，所述抗氧化酶包括SOD（超氧化物歧化酶；Superoxide dismutase）。SOD是‑一类能催化超氧阴离子自由基（O2）歧化为H2O2和O2的酶，其具有抗氧化和抗衰老的作用，其‑
作用机理主要是清除对机体有害的超氧阴离子自由基（O2）。

[0025] 优选地，所述过氧化产物包括MDA（丙二醛；Malondialdehyde）。MDA是细胞内脂质过氧化的产物，也是一种重要的氧化应激指标。

[0026] 在一些实施方案中，本发明所述应用的施用对象包括人和除人外的其它动物。此处所提到的除人外的其它动物可以为猴子、猩猩、长臂猿、大猩猩等灵长类动物；猪、牛、羊、马、骆驼、猫、狗等家畜类动物；鸡、鸭、鹅、鹌鹑等家禽类动物；等等。

[0027] 在一些实施方案中，所述组合物为食品组合物、饲料组合物、皮肤外用组合物或药物组合物。

[0028] 本发明还提供一种食品组合物，其中含有所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述的菌剂或所述的发酵物或发酵萃取物。

[0029] 在一些实施方式中，所述食品组合物为保健功能食品。

[0030] 本发明对食品组合物的种类没有特别的限定，可以为散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液剂、乳液剂、糖浆剂等经口腔型制剂的形态，或者可以添加于糖、饼干、口香糖、冰淇淋、面类、面包、饮料等普通食品中。

[0031] 本发明的食品组合物根据形态的不同可以采用通常的方法适当利用填充剂、增量剂、粘合剂、润湿剂、崩解剂、甜味剂、芳香剂、保存剂、表面活性剂、润滑剂、赋形剂等中的一种或多种而制备。

[0032] 本发明还提供一种饲料组合物，其中含有所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述的菌剂或所述的发酵物或发酵萃取物。

[0033] 在一些实施方案中，所述的饲料组合物可以为碳水化合物饲料、蛋白质饲料、青绿饲料或矿物质饲料等。同时，本领域人员可结合常识确认上述饲料的具体组分，比如，在碳水化合物饲料中可以含有玉米、麸皮、小麦、大麦、高粱和米糠等。

[0034] 本发明还提供一种皮肤外用组合物，其中含有所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述的菌剂或所述的发酵物或发酵萃取物。

[0035] 本发明所述的皮肤外用组合物是指可以从外部施用到皮肤上并且可以包括各种药物剂型的任何物质。例如，该组合物可以是软膏剂、洗剂、凝胶剂、霜剂、喷雾、混悬剂、乳剂、贴剂等形式，但不限于此。

[0036] 在一些实施方式中，所述的皮肤外用组合物还可以包含功能性添加剂和一般皮肤外用组合物中所包含的成分。其中，功能性添加剂可包括选自包括水溶性维生素、油溶性维生素、聚合物肽、聚合物多糖、鞘脂和海藻提取物中的成分。一般皮肤外用组合物中所包含的成分包括油成分、保湿剂、润肤剂、表面活性剂、有机或无机颜料、有机粉末、紫外线吸收剂、防腐剂、杀菌剂、抗氧化剂、植物提取物、pH调节剂、醇、着色剂、调味剂、血液循环促进剂、冷却剂、止汗剂和纯净水。

[0037] 本发明还提供一种药物组合物，其中含有所述的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3或所述的菌剂或所述的发酵物或发酵萃取物。

[0038] 本发明的药用组合物可以经口腔(例如，服用或吸入)或非经口腔(例如，注射、经皮吸收、直肠给药)给予。注射可以是例如静脉注射、皮下注射、肌肉内注射或腹腔内注射。

[0039] 本发明的药用组合物可以由给药途径的不同而剂型化为片剂、胶囊剂、颗粒剂、细粒剂(fine subtilae)、粉剂、舌下含片、栓剂、软膏、注射剂、乳化液剂、悬浮液剂、糖浆剂、喷雾剂等。上述多种形态的根据本发明的药用组合物可利用在各剂型中通常使用的药用载体(carrier)，并通过已知的技术来制造。药学上可接受的载体例子包括，赋形剂、粘合剂、崩解剂(disintegrating agent)、润滑剂、防腐剂、抗氧化剂、等渗剂(isotonic agent)、缓冲剂、被膜剂、甜味剂、溶解剂、主剂(base)、分散剂、润湿剂、悬浮剂、稳定剂、着色剂等。

[0040] 本发明所使用的术语“和/或”、“或/和”、“及/或”的选择范围包括两个或两个以上相关所列项目中任一个项目，也包括相关所列项目的任意的和所有的组合，所述任意的和所有的组合包括任意的两个相关所列项目、任意的更多个相关所列项目、或者全部相关所列项目的组合。需要说明的是，当用至少两个选自“和/或”、“或/和”、“及/或”的连词组合连接至少三个项目时，应当理解，在本申请中，该技术方案毫无疑问地包括均用“逻辑与”连接的技术方案，还毫无疑问地包括均用“逻辑或”连接的技术方案。比如，“A及/或B”包括A、B和A+B三种并列方案。又比如，“A，及/或，B，及/或，C，及/或，D”的技术方案，包括A、B、C、D中任一项（也即均用“逻辑或”连接的技术方案），也包括A、B、C、D的任意的和所有的组合，也即包括A、B、C、D中任两项或任三项的组合，还包括A、B、C、D的四项组合（也即均用“逻辑与”连接的技术方案）。

[0041] 本发明中所使用的术语“含有”、“包含”和“包括”是同义词，其是包容性或开放式的，不排除额外的、未被引述的成员、元素或方法步骤。

[0042] 本发明中，涉及“多个”、“多种”等描述，如无特别限定，指在数量上指大于等于2。

[0043] 本发明中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。

[0044] 本发明中，“优选”、“更好”、“更佳”、“为宜”仅为描述效果更好的实施方式或实施例，应当理解，并不构成对本发明保护范围的限制。本发明中，“可选地”、“可选的”、“可选”，指可有可无，也即指选自“有”或“无”两种并列方案中的任一种。如果一个技术方案中出现多处“可选”，如无特别说明，且无矛盾之处或相互制约关系，则每项“可选”各自独立。

[0045] 本发明的青春双歧杆菌（Bifidobacterium adolescentis）BA‑3能够打破自由基‑氧化应激‑炎症‑氧化应激‑自由基的恶性循环，并能实现多方面综合改善，因而在用于抗衰老、抗氧化和抗炎时均具有显著优于同种其他菌株的性能优势。

附图说明

[0046] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0047] 图1为本发明实施例中不同青春双歧杆菌干预对小鼠体重、摄食量和饮水量的影响；图中，A：不同青春双歧杆菌连续灌胃14天的小鼠体重变化；B：小鼠摄食量；C：小鼠饮水量。

[0048] 图2为本发明实施例中不同青春双歧杆菌干预对LPS炎症模型小鼠血清中炎症因子的影响；图中，A：血清中TNF‑α水平；B:血清中IL‑1β水平；C:血清中IL‑6水平；*P<0.05, **P<0.01，***P＜0.001 vs LPS group；#P<0.05, ##P<0.01，###P＜0.001 vs Control Group。

[0049] 图3为本发明实施例中不同青春双歧杆菌干预对LPS炎症模型小鼠血清中氧化应激因子的影响；图中，A：血清中SOD活性；B：血清中MDA水平；*P<0.05, **P<0.01，***P＜0.001 vs LPS group；#P<0.05, ##P<0.01，###P＜0.001 vs Control Group。

[0050] 图4为本发明实施例中外源性添加BA‑3对野生型果蝇w1118寿命的影响。图中，A和B1118 1118
分别为：野生型雌、雄性果蝇w 的生存曲线；C和D分别为：野生型雌、雄性果蝇w 的平均寿命、中位寿命以及最长寿命比较；*P<0.05, **P<0.01，***P＜0.001 vs Placebo group；#P<0.05, ##P<0.01，###P＜0.001 vs ATCC15703 group。

[0051] 图5为本发明实施例中外源性添加BA‑3对野生型果蝇w1118逆重力攀爬能力的影1118
响；图中，A和B分别为：野生型雌、雄性果蝇w 在第30天的逆重力爬行能力比较；*P<0.05, **P<0.01，***P＜0.001 vs Placebo group；#P<0.05, ##P<0.01，###P＜0.001 vs ATCC15703 group。

具体实施方式

[0052] 以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明，本领域技术人员可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如，作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中，来产生更进一步的实施方式。

[0053] 除非另有说明，用于披露本发明的所有术语(包括技术和科学术语)的意义与本发明所属领域普通技术人员所通常理解的相同。通过进一步的指导，随后的定义用于更好地理解本发明的教导。本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。

[0054] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，优先参考本发明中给出的指引，还可以按照本领域的实验手册或常规条件，还可以参考本领域已知的其它实验方法，或者按照制造厂商所建议的条件。

[0055] 以下实施例中所使用的青春双歧杆菌BA‑4和青春双歧杆菌BA‑11是本发明在筛选优势菌株时所获得的其他青春双歧杆菌优势菌株。以下实施例中所使用的青春双歧杆菌ATCC15703通过市售途径获得。

[0056] 下述的具体实施例中，涉及原料组分的量度参数，如无特别说明，可能存在称量精度范围内的细微偏差。涉及温度和时间参数，允许仪器测试精度或操作精度导致的可接受的偏差。

[0057] 实施例1 青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis BA‑3的分离筛选和鉴定[0058] 1、青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis BA‑3的分离筛选

[0059] 招募数名无炎症或者任何肠道疾病的健康年轻女性参与提供样品，参与者均通过了体检中心的健康检查，并通过调查问卷提供了关于她们的年龄（20‑25）、月经周期以及其他健康行为等的信息。样本采集前6个月内人群未服用过抗生素类药物，无益生菌服用史，无炎症病史。

[0060] 将采集的粪便样品稀释后涂布于GAM血琼脂培养基，置36℃ 38℃厌氧培养48~ ~72h，挑取单菌落在新的GAM血琼脂培养基平板上划线培养，获得纯化的菌落，经分离、活性筛查及鉴定后，获得青春双歧杆菌BA‑3。

[0061] 2、青春双歧杆菌BA‑3的生理特性

[0062] 青春双歧杆菌BA‑3在GAM血琼脂培养基上厌氧培养48小时后，菌落呈圆形凸起，边缘整齐，表面湿润光滑；革兰氏染色阳性，无芽孢、无荚膜、无鞭毛，菌体呈直形或弯曲状。

[0063] 3、青春双歧杆菌BA‑3的分子学鉴定

[0064] 将青春双歧杆菌BA‑3接种至GAM肉汤培养基中，置36℃ 38℃厌氧培养24h后，离心~收齐菌体并提取DNA进行全基因组测序。

[0065] 分子鉴定结果表明，青春双歧杆菌BA‑3与GCF_003467335.1(Bifidobacterium adolescentis)的ANI（Average Nucleotide Identity，平均核苷酸一致性）值为98.7072%。

[0066] 将青春双歧杆菌BA‑3于2023年6月14日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编100101），分类命名为青春双歧杆菌Bifidobacterium adolescentis，保藏编号为CGMCC NO.27625。

[0067] 4、全基因组数据分析

[0068] 对青春双歧杆菌BA‑3进行全基因组测序，采用全基因组鸟枪法（Whole Genome Shotgun，WGS）策略，构建不同插入片段的文库，利用第二代测序技术（Next‑Generation Sequencing，NGS），基于 Illumina NovaSeq 测序平台，同时利用第三代单分子测序技术，基于 PacBio Sequel 测序平台进行测序。

[0069] 而后，结合测序结果对青春双歧杆菌BA‑3的耐药基因、毒力因子及产生物胺潜能进行分析，具体分析过程及结果如下：

[0070] 1）青春双歧杆菌BA‑3耐药基因分析

[0071] 分析方法

[0072] 采用综合抗生素耐药数据库(The Comprehensive Antibiotic Resistance Database，CARD，网址：card.mcmaster.ca)，上传BA‑3的全基因组序列至https://card.mcmaster.ca/analyze/rgi，使用CARD自带的软件RGI（v6.0.2），比对CARD 3.2.7数据库，选择默认参数进行分析，具体为Select Data Type: DNA sequence；Select Criteria: Perfect and Strict hits only；Nudge ≥95% identity Loose hits to Strict: Exclude nudge；Sequence Quality: High quality/coverage。

[0073] 分析结论

[0074] 通过比对耐药基因数据库，未在青春双歧杆菌BA‑3基因组中检测到超广谱β内酰胺酶、万古霉素耐药基因、耐碳青霉烯类耐药基因、耐甲氧西林耐药基因以及多重耐药基因。

[0075] 2）青春双歧杆菌BA‑3毒力基因分析

[0076] 分析方法

[0077] 采用毒力因子数据库(VFDB,http://www.mgc.ac.cn/VFs/)，下载毒力因子基因数据库VFDB（2023.04.11版本）, 利用diamond v2.0.15.153软件，基于blastx算法，参数选择identity＞80%、coverage＞70%（command line：‑‑id 80 ‑‑query‑cover 70），对比BA‑3基因组核苷酸序列和数据库中的氨基酸序列。

[0078] 分析结果

[0079] 通过比对毒力基因数据库，青春双歧杆菌BA‑3基因组中无基因注释为毒力基因。

[0080] 3）青春双歧杆菌BA‑3产生物胺潜能分析

[0081] 分析方法

[0082] 利用emapper‑2.1.9软件，比对青春双歧杆菌BA‑3全基因组基因的氨基酸序列和eggNOG (evolutionary gene genealogy Nonsupervised Orthologous Groups)数据库。

[0083] 分析结果

[0084] 通过比对eggNOG数据库并检索产生物胺相关基因，青春双歧杆菌BA‑3基因组中未检测到组氨酸脱羧酶、酪氨酸脱羧酶、鸟氨酸脱羧酶和赖氨酸脱羧酶等产生物胺相关基因。

[0085] 实施例2 LPS诱导的小鼠炎症模型

[0086] 实验方法

[0087] 1、分组与造模方法

[0088] 健康ICR小鼠，均为雄性，共30只，体重范围在22±2g，环境温度为20 25℃，标准饲~料喂养，自由进食、饮水，每十二小时进行昼夜循环。小鼠适应性饲养1周，随机分为空白对照组（Control）、模型对照组（LPS）、青春双歧杆菌BA‑3干预组（LPS+BA‑3）、青春双歧杆菌BA‑4干预组（LPS+BA‑4）以及青春双歧杆菌BA‑11干预组（LPS+BA‑11），每组6只。干预组每日
9
灌胃给予青春双歧杆菌（无菌PBS重悬至终浓度均为10CFU/mL）200μL，空白对照组和模型对照组每日灌胃等体积无菌PBS溶液，连续干预14天。末次给药后，模型对照组以及青春双歧杆菌BA‑3、青春双歧杆菌BA‑4以及青春双歧杆菌BA‑11干预组小鼠腹腔注射 LPS 5 mg /kg（生理盐水配制），构建 LPS 小鼠急性炎症模型，空白对照组注射等体积生理盐水，2小时后处死，取血。

[0089] 2、体重变化、摄食量以及饮水量的变化

[0090] 干预期间，每两天记录每组小鼠的体重、24小时的摄食量以及饮水量情况。使用GraphPad Prism 9对数据进行显著性分析。

[0091] 3、测定血清中IL‑1β、IL‑6和TNF‑α的水平

[0092] 各组小鼠取血后，室温放置30 min，3000 g离心20 min，小心吸取血清并用于后续指标测定，采用双抗夹心法按照ELISA检测试剂盒的说明方法检测各组血清中IL‑6、TNF‑α和IL‑1β的浓度。使用GraphPad Prism 9对数据进行显著性分析。

[0093] 4、测定小鼠血清中SOD和MDA的水平

[0094] 检测小鼠血清中SOD和MDA水平，具体操作步骤按照试剂盒说明书进行，在450 nm条件下，用酶标仪测定其吸光度值。使用GraphPad Prism 9对数据进行显著性分析。

[0095] 实验结果

[0096] 1、体重变化、摄食量以及饮水量的变化

[0097] 各组小鼠干预期间生长情况正常，不同组别之间的小鼠体重没有显著差异(图1 A)。与空白组和模型组相比，灌胃青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4以及BA‑11干预组小鼠的24小时摄食量和饮水量未显示出显著性差异（图1 B、C），初步说明青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4以及BA‑11菌株对小鼠的健康状况未产生不良影响。

[0098] 2、血清中炎症因子水平的变化

[0099] 脂多糖LPS可以通过激活炎症信号传导途径并促进炎症细胞因子的分泌引起炎症反应。其中，TNF‑α、IL‑1β和IL‑6等均是在LBP诱导的急性炎症模型中起到重要作用的促炎因子。因此，通过检测小鼠血清中促炎因子水平的变化可以评估小鼠的炎症情况。腹腔注射LPS 后，各组小鼠血清中的炎症因子水平如图2所示。相比于空白对照组，模型对照组的TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的水平显著升高，说明LPS诱导的急性炎症模型构建成功。与模型对照组相比，青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4以及BA‑11进行干预后，能够不同程度地降低血清中促炎因子的水平。其中BA‑3在3株菌中降低促炎因子效果最佳，与模型对照组相比，BA‑3干预组LPS小鼠血清中TNF‑α、IL‑1β和IL‑6的水平均显著降低。而与模型对照组相比，BA‑11干预组LBP小鼠血清中的TNF‑α以及IL‑1β的水平显著下降，而IL‑6则无显著性差异。BA‑4干预组中，IL‑1β水平出现显著降低，但TNF‑α和IL‑6的水平与模型对照组相比无显著性差异。实验结果表明，青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4和BA‑11在改善LPS诱导的小鼠炎症中表现出一定的抗炎效果，其中BA‑3菌株的抗炎作用最佳。

[0100] 3、血清中SOD和MDA水平的变化

[0101] 氧化应激和炎症息息相关，也是LPS引起炎症的基础之一。SOD是机体内清除自由基主要的抗氧化酶，SOD的作用在于阻断超氧阴离子自由基引发自由基的一级反应，从而减少其他活性氧的生成；MDA是脂质过氧化的产物，其含量的高低间接反映了机体细胞受自由基攻击的严重程度。为了评估不同青春双歧杆菌对LPS模型小鼠氧化应激损伤的缓解作用，测定血清中SOD活性及MDA水平以评价菌株的抗氧化能力。如图3所示，注射LPS 2小时后，与空白组相比，模型组SOD活性显著下降，而MDA水平显著升高。青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4以及BA‑11干预后均不同程度提升SOD活性，降低MDA水平。其中与模型对照组相比，BA‑3显著提升了血清SOD的活性，而BA‑4以及BA‑11与模型对照组相比则无显著性差异。而BA‑3、BA‑4以及BA‑11与模型对照组相比均可使血清MDA水平显著降低。实验结果表明，青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4和BA‑11在改善LPS诱导的小鼠氧化应激中表现出一定抗氧化效果。

[0102] 结论

[0103] 本实施例将青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4以及BA‑11连续14天灌胃给健康雄性ICR小鼠，随后建立LPS急性炎症模型，通过对体重、摄食量以及饮水量的监控，说明了青春双歧杆菌BA‑3、BA‑4以及BA‑11对小鼠健康情况未产生不良影响。而通过对促炎因子水平的测定表明，BA‑3、BA‑4以及BA‑11均可一定程度降低LPS模型小鼠血清中TNF‑α、IL‑6和IL‑1β的水平，其中BA‑3能够同时显著降低3种促炎因子水平。在对氧化应激相关因子的检测结果表明，BA‑3、BA‑4以及BA‑11在LPS炎症小鼠中均表现出一定抗氧化应激的作用。整体而言，在BA‑3、BA‑4以及BA‑11三株青春双歧杆菌中，BA‑3不仅对小鼠健康无不良影响，且表现的抗炎和抗氧化作用更优。

[0104] 实施例3 果蝇实验

[0105] 实验方法

[0106] 果蝇作为广泛应用于衰老研究领域的模式生物，具有生长周期短，繁殖力强，雌雄易分辨等优点，同时其基因保守性高，并且约有75％与人类疾病同源的基因，代谢途径也与人类十分相似。

[0107] 1、果蝇的培养

[0108] 本实施例所使用的野生型果蝇品系为w1118。均在 25℃恒定温度，65％恒定湿度，12 h光照/12 h黑暗的果蝇培养箱中饲养。培养基配方见表1。干预组中，青春双歧杆菌BA‑3
10
以及ATCC15703使用无菌PBS重悬至10 CFU/mL，并将青春双歧杆菌BA‑3混悬液以及
9
ATCC15703混悬液与基础培养基混合至最终浓度为10CFU/mL，对照组中使用相同体积的无菌PBS与基础培养基混合。

[0109] 表1 培养基配方

[0110]

[0111] 2、寿命实验

[0112] 新生果蝇自由交配48 h后随机挑选雌、雄果蝇各300只，转移至空培养小管中禁食2小时，然后随机分成3组，每组雌、雄果蝇各100只，再分别转移至装有含青春双歧杆菌BA‑3的培养基、含有ATCC15703的培养基或基础培养基的培养管中，每管10只。每3天转移至新培养管中，并观察记录死亡的果蝇数，直到全部果蝇死亡。记录每管果蝇的存活时间，并绘制生存曲线，统计分析果蝇的平均（mean）寿命、中位（median）寿命和最长（maximum）寿命（最长寿命即为每组最后10%果蝇的平均寿命）。使用GraphPad Prism 9对数据进行显著性分析。

[0113] 3、逆重力爬行能力测试

[0114] 雌、雄果蝇在装有含有青春双歧杆菌BA‑3的培养基、含有ATCC15703的培养基或基础培养基的培养管中培养至30日，每组随机挑选雌、雄果蝇各20只，分别转移到测定管中。待果蝇适应3min后，轻轻拍打测试管使得果蝇落在底部，开始计时，测量10s内爬行距离超过8cm标记处的果蝇只数，重复实验3次，每次间隔10min以上，间隔期间测试管水平放置。按公式计算果蝇攀爬指数，攀爬指数越高，代表果蝇逆重力爬行能力越强。使用GraphPad Prism 9对数据进行显著性分析。

[0115] 攀爬指数=（成功攀爬至8 cm的果蝇数量/果蝇总数）×100%。

[0116] 实验结果

[0117] 1、寿命实验

[0118] 与ATCC15703干预组以及对照组相比，青春双歧杆菌BA‑3对雌、雄野生型果蝇存在延长寿命作用（图4 A、B）。将青春双歧杆菌BA‑3干预组与对照组比较，雌、雄果蝇中青春双歧杆菌BA‑3干预组平均寿命、中位寿命以及最长寿命均显著高于对照组（图4C、D）。将青春双歧杆菌BA‑3干预组与ATCC15703干预组比较，雌性野生型果蝇中青春双歧杆菌BA‑3干预组平均寿命、中位寿命均显著高于ATCC15703干预组，而雄性野生型果蝇中，青春双歧杆菌BA‑3干预组的中位寿命与ATCC15703干预组相比具有显著性差异（图4C、D）。

[0119] 2、逆重力爬行实验

[0120] 逆重力爬行能力是一种运动能力，是表征果蝇健康寿命的重要指标。青春双歧杆菌BA‑3组与对照组相比，雌、雄野生型果蝇在第30天的逆重力攀爬能力均有显著提高。青春双歧杆菌BA‑3组与ATCC15703组相比，雄性野生型果蝇在第30天的逆重力攀爬能力存在显著性差异。

[0121] 结论

[0122] 本实施例将青春双歧杆菌BA‑3添加到果蝇的基础培养基中，通过检测果蝇的寿命指标并在特定的时间节点检测果蝇的逆重力爬行能力，考察了青春双歧杆菌BA‑3对果蝇衰1 1 1 8
老的延缓作用。在不同性别的野生型果蝇w 中，青春双歧杆菌BA‑3干预组的中位生存时间、平均寿命和平均最高寿命显著高于ATCC15703组和对照组，如图4A、4B、4C、4D所示。此外，在第30天，不同性别的青春双歧杆菌BA‑3干预组的逆重力爬行能力也显著优于ATCC15703组和对照组，如图5A和5B所示。

[0123] 综上，本实施例证实了外源性补充青春双歧杆菌BA‑3可以增长不同性别野生型果蝇的寿命并改善野生型果蝇的健康寿命指标，且效果优于已被报道有抗衰功能的模式菌株ATCC15703。

[0124] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。