一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法

摘要

本发明公开了一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，属于抗生素检测技术领域。该检测方法是将酶联上转换纳米粒子溶液与连接适配体的磁化聚多巴胺溶液混合得到荧光‑紫外双信号传感器检测体系，结合草酸钛钾酸和双氧水共同建立环丙沙星含量检测荧光和比色标准曲线测定肉制品样品液的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，根据所述荧光标准曲线和比色标准曲线计算出肉制品中环丙沙星含量。本发明实现了肉制品中环丙沙星的快速、灵敏的检测。

权利要求

1.一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，其特征在于，将酶联上转换纳米粒子溶液与连接适配体的磁化聚多巴胺溶液混合得到荧光‑紫外双信号传感器检测体系，结合草酸钛钾酸和双氧水共同建立环丙沙星含量检测荧光标准曲线和比色标准曲线，测定肉制品样品液的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，根据所述荧光标准曲线和比色标准曲线计算出肉制品中环丙沙星含量；

所述酶联上转换纳米粒子溶液的制备方法包括以下步骤：

1)将上转换纳米粒子、聚丙烯酸水溶液、三氯甲烷和甲苯混合，搅拌、离心干燥后，得到羧基化上转换纳米材料；

2)在羧基化上转换纳米材料表面连接环丙沙星适配体互补链和辣根过氧化物酶，得到酶联上转换纳米粒子溶液；

所述连接适配体的磁化聚多巴胺溶液的制备方法包括以下步骤：

S1.将Fe3O4超声分散于Tris‑HCl缓冲液中，然后加入盐酸多巴胺，室温下搅拌，得到磁性聚多巴胺；

S2.将磁性聚多巴胺加入缓冲液E中，超声分散，然后加入环丙沙星适配体和NaCl，振荡，沉淀物溶于缓冲液F中，得到连接适配体的磁化聚多巴胺溶液；

所述缓冲液E为PBS缓冲液；

所述缓冲液F为PBS缓冲液。

2.根据权利要求1所述的基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，其特征在于，所述上转换纳米粒子、聚丙烯酸水溶液、三氯甲烷和甲苯的用量比为25mg∶10mL∶2mL∶3mL；所述羧基化上转换纳米材料、环丙沙星适配体互补链和辣根过氧化物酶的用量比为10mg∶2.5OD∶5mg。

3.根据权利要求1所述的基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，其特征在于，所述Fe3O4、Tris‑HCl缓冲液、盐酸多巴胺用量比为100mg∶200mL∶75mg；所述磁性聚多巴胺、环丙沙星适配体和NaCl的用量比为10mg∶2.5OD∶52.65mg。

4.根据权利要求1所述的基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，其特征在于，所述酶联上转换纳米粒子溶液与连接适配体的磁化聚多巴胺溶液的体积比为(1‑1.5)∶0.5，混合时间为20‑30分钟。

5.根据权利要求1所述的基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，其特征在于，荧光‑紫外双信号传感器检测体系结合草酸钛钾酸和双氧水共同建立环丙沙星含量检测荧光标准曲线和比色标准曲线的方法，包括：在荧光‑紫外双信号传感器检测体系中加入不同浓度的环丙沙星标准液，检测磁分离后上清液的荧光强度信号特征值，再在上清液中加入过氧化氢水溶液，反应一段时间后，加入草酸钛钾酸溶液得到浅黄色溶液，检测浅黄色溶液的紫外吸光度，根据不同浓度的环丙沙星标准液所对应的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，绘制出环丙沙星浓度相关的紫外标准曲线和荧光标准曲线。

6.根据权利要求1所述的基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，其特征在于，对肉制品中环丙沙星进行检测的方法，还包括：获取肉制品样品液，测定样品液的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，根据所得的环丙沙星检测标准曲线，确定实际样品中环丙沙星的含量。

7.根据权利要求6所述的基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，其特征在于，获取肉制品样品液的方法包括：将肉制品打成匀浆，加入酸化乙腈和无水硫酸钠，振荡离心后取沉淀物再加入酸化乙腈，振荡离心得到上清液；将两次离心所得的上清液合并，在上清液中加入正己烷进行振荡，取下层溶液，旋转蒸发，加入甲醇，过滤，得到样品液。

说明书

一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙

沙星快速检测方法

技术领域

[0001] 本发明属于抗生素检测技术领域，尤其涉及一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法。

背景技术

[0002] 环丙沙星是一种广谱抗菌药物，具有高效的抗菌活性和良好的杀菌效果，因此在动物饲养和水产养殖中都有广泛的应用。然而，由于不法商家在养殖过程中滥用环丙沙星，导致食品中残留环丙沙星。长期摄入含有环丙沙星的食品，会使人的免疫力下降并使人体中的细菌产生耐药性，最终导致人体出现严重的功能性疾病。

[0003] 由于环丙沙星的严重危害，目前许多国家都规定了环丙沙星在各种农产品和食品中的最大残留量。例如，中国国家标准GB 31650‑2019规定，猪肉、鱼肉中环丙沙星含量不得超过100μg/kg。但是，传统的环丙沙星检测方法，如高效液相色谱法、液相色谱‑串联质谱法等，存在仪器设备昂贵、检测成本高、步骤繁琐等问题，无法满足对环丙沙星含量的快速、高灵敏性检测要求，因此需要开发一种更加简便、经济的环丙沙星检测方法。

发明内容

[0004] 针对上述现有技术中存在的问题，本发明提出了一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法。该检测方法能够克服现有检测技术中检测成本高、时间长、检测步骤繁琐等问题。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：

[0006] 一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，将酶联上转换纳米粒子溶液与连接适配体的磁化聚多巴胺溶液混合得到荧光‑紫外双信号传感器检测体系，结合草酸钛钾酸和双氧水共同建立环丙沙星含量检测荧光和比色标准曲线，测定肉制品样品液的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，根据所述荧光标准曲线和比色标准曲线计算出肉制品中环丙沙星含量。

[0007] 进一步地，所述酶联上转换纳米粒子溶液的制备方法包括以下步骤：

[0008] 1)将上转换纳米粒子、聚丙烯酸水溶液、三氯甲烷和甲苯混合，搅拌、离心干燥后，得到羧基化上转换纳米材料；

[0009] 2)在羧基化上转换纳米材料表面连接环丙沙星适配体互补链和辣根过氧化物酶，得到酶联上转换纳米粒子溶液。

[0010] 更进一步地，所述上转换纳米粒子、聚丙烯酸水溶液、三氯甲烷和甲苯的用量比为25mg∶10mL∶2mL∶3mL；所述羧基化上转换纳米材料、环丙沙星适配体和辣根过氧化物酶的用量比为10mg∶2.5OD∶5mg。

[0011] 进一步地，所述连接适配体的磁化聚多巴胺溶液的制备方法包括以下步骤：

[0012] S1.将Fe3O4超声分散于Tris‑HCl缓冲液中，然后加入盐酸多巴胺，室温下搅拌，得到磁性聚多巴胺；

[0013] S2.将磁性聚多巴胺加入缓冲液E中，超声分散，然后加入环丙沙星适配体和NaCl，振荡，沉淀物溶于缓冲液F中，得到连接适配体的磁化聚多巴胺溶液。

[0014] 更进一步地，所述Fe3O4、Tris‑HCl缓冲液、盐酸多巴胺用量比为100mg∶200mL∶75mg；所述磁性聚多巴胺、环丙沙星适配体和NaCl的用量比为10mg∶2.5OD∶52.65mg；所述缓冲液E和缓冲液F均为PBS缓冲液。

[0015] 进一步地，所述酶联上转换纳米粒子溶液与连接适配体的磁化聚多巴胺溶液的体积比为(1‑1.5)∶0.5。

[0016] 进一步地，荧光‑紫外双信号传感器检测体系结合草酸钛钾酸和双氧水共同建立环丙沙星含量检测荧光标准曲线和比色标准曲线的方法，包括：在荧光‑紫外双信号传感器检测体系中加入不同浓度的环丙沙星标准液，检测磁分离后上清液的荧光强度信号特征值，再在上清液中加入过氧化氢水溶液，反应一段时间后，加入草酸钛钾酸溶液得到浅黄色溶液，检测浅黄色溶液的紫外吸光度，根据不同浓度的环丙沙星标准液所对应的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，绘制出环丙沙星浓度相关的紫外和荧光标准曲线。

[0017] 进一步地，对肉制品中环丙沙星进行检测的方法，还包括：获取肉制品样品液，测定样品液的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，根据所得的环丙沙星检测标准曲线，确定实际样品中环丙沙星的含量。

[0018] 更进一步地，获取肉制品样品液的方法包括：将肉制品打成匀浆，加入酸化乙腈和无水硫酸钠，振荡离心后取沉淀物再加入酸化乙腈，振荡离心得到上清液；将两次离心所得的上清液合并，在上清液中加入正己烷进行振荡，取下层溶液，旋转蒸发，加入甲醇，过滤，得到样品液。

[0019] 与现有技术相比，本发明具有如下优点和技术效果：

[0020] (1)本发明采用磁化聚多巴胺作为能量受体和信号分离器。磁化聚多巴胺是一种有效的猝灭剂，通过荧光共振能量转移可有效猝灭上转换荧光材料的荧光，在短时间内猝灭酶联上转换材料的荧光，提高了检测效率。磁化聚多巴胺相较于传统的金纳米颗粒、二氧化锰、氧化石墨烯等常用猝灭剂具有信号分离作用。该材料具有良好的磁性，无需耗时的离心过滤即可有效地从干扰物中分离出来。利用磁化聚多巴胺将目标与共存离子分离，可以消除实际样品的干扰，提高检测灵敏度、检测效率以及可靠性，实现对目标物的痕量检测。

[0021] (2)本发明利用草酸钛钾酸溶液能灵敏的与H2O2选择性反应生成黄色的过氧钛酸，2+
以产生比色信号。草酸钛钾在酸性环境中与H2O2所发生的反应式为：TiO +H2O2→[TiO
2+ 2+
(H2O2)] ，所产生的[TiO(H2O2)] 黄色络合物颜色深浅随H2O2浓度变化而变化，通过检测溶液吸光值，可准确计算出被测物中环丙沙星的含量。草酸钛钾与H2O2反应十分迅速，且条件温和，不需要复杂的操作步骤，缩短了检测时间，提高检测效率。

[0022] (3)本发明所制备的酶联上转换荧光材料结合磁化聚多巴胺可实现对环丙沙星荧光‑比色双信号响应。精确控制酶联上转换荧光材料和磁化聚多巴胺的比例，可提高检测的灵敏度以及可靠性，相对于现有的基于上转换材料的检测方法，本发明所构建的体系可产生两种检测信号，使检测结果更加准确。

附图说明

[0023] 构成本申请的一部分的附图用来提供对本申请的进一步理解，本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请，并不构成对本申请的不当限定。在附图中：

[0024] 图1为上转换荧光纳米材料的透射电镜图；

[0025] 图2为磁化聚多巴胺的透射电镜图；

[0026] 图3为磁化聚多巴胺的磁滞回线图；

[0027] 图4为不同浓度环丙沙星的荧光(A)和紫外(B)标准曲线图。

具体实施方式

[0028] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0029] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0030] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0031] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0032] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0033] 本发明中所述的“室温”,如无特别说明，均按25±2℃计。

[0034] 本发明以下实施例所用原料均为市售所得。

[0035] 本发明提供一种基于酶联上转换荧光与草酸钛钾酸体系的肉制品中环丙沙星快速检测方法，包括以下步骤：

[0036] 步骤一、制备羧基化上转换纳米材料：将六水氯化钇、六水氯化镱和六水氯化铒分散在无水甲醇A中，加入油酸和1‑十八烯后，在氮气气氛下进行第一次加热搅拌，搅拌后冷却至室温。关闭氮气后，逐滴加入无水甲醇B溶解的氢氧化钠、氟化铵混合溶液，进行第二次加热搅拌。通入氮气，进行第三次加热搅拌反应，搅拌后冷却至室温。所得混合液经离心分离得到上转换纳米粒子沉淀，并用环己烷和乙醇混合溶液清洗上转换纳米粒子沉淀，干燥后得到纯净的上转换纳米粒子；

[0037] 将上转换纳米粒子、聚丙烯酸水溶液、三氯甲烷和甲苯按比例混合，进行第四次搅拌反应。离心干燥后，得到羧基化上转换纳米材料。

[0038] 步骤二、在羧基化上转换纳米材料表面连接环丙沙星适配体互补链和辣根过氧化物酶：将步骤一所得的羧基化上转换纳米粒子溶解在缓冲液A中，然后加入1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺水溶液，在一定温度下进行第一次混合振摇，第一次振摇结束后加去离子水A离心清洗，离心清洗后取沉淀物再分散于缓冲液B中。将环丙沙星适配体互补链溶液和辣根过氧化物酶加入混合物中，在一定温度下进行第二次混合振摇，结束后加入去离子水B离心清洗，溶于缓冲液C中，得到酶联上转换纳米粒子溶液。酶联上转换荧光材料作为能量供体和比色信号源可同时提供荧光和比色两种信号，有利于更加准确的检测环丙沙星。

[0039] 步骤三、首先将FeCl3·6H2O和FeSO4·7H2O溶解于去离子水C中，通入氮气，并进行搅拌，然后加入NH3·H2O，进行第一次加热搅拌。反应结束后，用强力磁铁将得到的Fe3O4从溶液中分离出来，用超纯水冲洗至少三次，以有效去除多余的NH3·H2O。最后，将产物在真空烘箱中干燥，得到干燥的Fe3O4。称取一定量的Fe3O4，超声分散于缓冲液D中。在上述溶液中加入盐酸多巴胺，室温下进行第二次搅拌，搅拌结束后得到磁化聚多巴胺，通过磁铁吸附收集磁化聚多巴胺，用去离子水和乙醇洗涤三次，烘干。

[0040] 步骤四、磁化聚多巴胺连接适配体：取干燥的磁化聚多巴胺加入缓冲液E，超声分散，随后加入环丙沙星适配体和NaCl，振摇一段时间，去离子水清洗后取沉淀物溶于缓冲液F中，得到连接适配体的磁化聚多巴胺溶液。连接适配体后的磁化聚多巴胺可特异性识别环丙沙星，因此该方法具有良好的选择性和抗干扰性。

[0041] 步骤五、草酸钛钾酸溶液的制备：草酸钛钾、氨基磺酸和去离子水C按比例混合，配制成草酸钛钾酸溶液。草酸钛钾酸溶液能与过氧化氢选择性反应生成黄色的过氧钛酸，根据过氧化氢量的变化改变溶液吸光值，从而实现比色检测。

[0042] 步骤六、制备荧光‑紫外双信号传感器：将步骤二中得到的酶联上转换纳米粒子溶液与步骤四制备的连接适配体的磁化聚多巴胺溶液按比例混合，混合一段时间后得到检测体系；

[0043] 步骤七、建立环丙沙星含量检测荧光和比色标准曲线：首先配制不同浓度的环丙沙星标准液，在步骤五所得的检测体系中加入不同浓度的环丙沙星标准液，检测磁分离后上清液的荧光强度信号特征值，再在上清液中加入过氧化氢水溶液，反应一段时间后，加入草酸钛钾酸溶液得到浅黄色溶液，检测浅黄色溶液的紫外吸光度，根据不同浓度的环丙沙星标准液所对应的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，绘制出环丙沙星浓度相关的紫外和荧光标准曲线。

[0044] 步骤八、肉制品中环丙沙星含量的检测：称取实际样品，打成匀浆，加入酸化乙腈A，无水硫酸钠，振荡一段时间，离心后取沉淀再加入酸化乙腈B，振荡后离心得到上清液，将两次离心所得的上清液合并，将上清液置于分液漏斗中，再加入正己烷进行振荡，取下层溶液，用旋转蒸发仪将下层溶液蒸发至干，加入甲醇C溶液，经滤膜过滤得到样品液；测定样品液的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，根据步骤六所得的环丙沙星检测标准曲线，计算出实际样品中环丙沙星的含量。

[0045] 在本发明以下实施例步骤一中，所述六水氯化钇、六水氯化镱、六合氯化铒的质量比为236.6∶77.5∶7.6；所述甲醇A、油酸、1‑十八烯、NH4F、NaOH和甲醇B的用量比为(6‑10)mL∶6mL∶15mL∶0.1482g∶0.1g∶10mL；所述第一次加热搅拌反应的温度为160‑170℃，搅拌时间20‑30分钟；第二次加热搅拌反应的温度为60‑70℃，搅拌时间60‑70分钟；第三次加热搅拌反应的温度为290‑300℃，搅拌时间60‑90分钟。

[0046] 所述上转换纳米粒子、聚丙烯酸水溶液、三氯甲烷、甲苯的用量比为25mg∶10mL∶2mL∶3mL；所述聚丙烯酸水溶液浓度为15mg/mL；所述第四次搅拌反应时间为40‑60h。

[0047] 在本发明以下实施例步骤二中，所述羧基化上转换纳米粒子、缓冲液A、1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺水溶液的用量比为10mg∶10mL∶0.5mL∶0.5mL；所述1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液和N‑羟基硫代琥珀酰亚胺水溶液的浓度分别为2.0mg/mL和1.0mg/mL；所述羧基化上转换纳米粒子、环丙沙星适配体互补链溶液和辣根过氧化物酶的比例为10mg∶2.5OD∶5mg；所述缓冲液B体积为10mL；缓冲液C体积为40mL。缓冲液A为Tris‑HCl缓冲液，pH值为8.5；缓冲液B为Tris‑HCl缓冲液，pH值为8.5。缓冲液C为磷酸盐缓冲液，pH值为5。

[0048] 在本发明以下实施例步骤三中，所述FeCl3·6H2O、FeSO4·7H2O、NH3·H2O的用量比为(3.8‑4.2)g∶(2.3‑2.4)g∶25mL；所述Fe3O4、缓冲液D、盐酸多巴胺用量比为100mg∶200mL∶75mg。所述第一次加热搅拌温度为80℃，时间为60分钟，第二次搅拌时间为6‑10h。缓冲液D为Tris‑HCl缓冲液，pH值为8.5。

[0049] 在本发明以下实施例步骤四中，缓冲液E、磁化聚多巴胺、环丙沙星适配体、NaCl的用量比为6mL∶10mg∶2.5OD∶52.65mg；所述振摇时间为24‑30h，温度为37℃。缓冲液E为PBS缓冲液，pH值为6.8；所述缓冲液F体积为20mL，为PBS缓冲液，pH值为6.8。

[0050] 在本发明以下实施例步骤五中，所述草酸钛钾、氨基磺酸、去离子水C的用量比为4mg∶2mg∶1mL。

[0051] 在本发明以下实施例步骤六中，所述酶联上转换纳米粒子溶液与连接适配体的磁化聚多巴胺溶液体积比为(1‑1.5)∶0.5；所述混合时间为20‑30分钟。

[0052] 在本发明以下实施例步骤七中，所述过氧化氢水溶液浓度为8mmol/L，环丙沙星标准液与过氧化氢水溶液体积比为2∶1。

[0053] 在本发明以下实施例步骤八中，所述实际样品、酸化乙腈A、无水硫酸钠的用量比为5g∶30mL∶30g；实际样品、酸化乙腈B、正己烷、无水甲醇C的比例为5g∶30mL∶25mL∶1mL；所述振荡时间为15分钟。

[0054] 本发明方法中所用的磁化聚多巴胺不仅具有磁纳米颗粒良好的磁性，可以将目标物与共存离子分离，消除其他物质的干扰，还具有聚多巴胺良好的猝灭性能，可猝灭酶联上转换荧光材料的荧光。本发明通过检测磁化聚多巴胺的磁滞回线，证明该物质具有良好的磁性，利用外部磁场在短时间内可将目标物与其他干扰物质分离。通过检测酶联上转换荧光材料和磁化聚多巴胺混合前后荧光寿命的变化，二者混合后荧光寿命下降，验证了磁化聚多巴胺可有效猝灭酶联上转换荧光材料的荧光。另外，由于聚多巴胺中存在着不同种类的官能团，如邻苯醌、氨基、亚胺基、羧基，这些官能团一方面能和金属离子发生螯合作用，确保了聚多巴胺层在金属或金属氧化物表面的附着；另一方面聚多巴胺表面的羧基能与氨基化的适配体发生共价结合，提高了磁化聚多巴胺连接适配体的稳定性。

[0055] 草酸钛钾酸溶液能与过氧化氢选择性反应生成黄色的过氧钛酸，从而实现比色检2+ 2+ 2+
测。其原理为在酸性环境中：TiO +H2O2→[TiO(H2O2)] ，[TiO(H2O2)] 是一种稳定的黄色络合物，络合物颜色的深浅和H2O2的浓度成正相关。因此，可通过检测过氧钛酸的吸光度，确定样品中所含有的环丙沙星浓度。本发明利用磁化聚多巴胺的荧光猝灭性能和磁性分离作用以及草酸钛钾酸溶液的显色作用提出了一种高效的荧光和比色双模式检测环丙沙星方法，并用于实际样品检测。

[0056] 上述带有不同字母的甲醇和去离子水仅仅用于区分不同的取样，而非代表字组成不同。如甲醇A和甲醇B只是代表分别取的两次甲醇试剂，其组成是相同的。

[0057] 为了进一步验证本发明所制备的检测方法对肉制品中有机环丙沙星的检测作用，本发明以下实施例中以鱼肉中环丙沙星的检测为例。

[0058] 实施例1

[0059] (1)羧基化上转换纳米材料的制备：首先称取236.6mgYCl3·6H2O、77.5mg YbCl3·6H2O和7.6mg ErCl3·6H2O溶于10mL甲醇中，超声分散后倒入三颈烧瓶。将6mL油酸和15mL1‑十八烯加入三颈烧瓶中，通入氮气，混合溶液在160℃下持续搅拌30分钟。然后将溶液冷却至室温，在持续搅拌的条件下，将含有NH4F(0.1482g)和NaOH固体(0.1g)的10mL甲醇溶液滴入三颈烧瓶中，将溶液加热到70℃，保持70分钟，以除去甲醇。待甲醇蒸发后，通入氮气，将溶液逐渐加热至300℃，保持80分钟，并不断搅拌。反应结束后，关闭加热开关，让溶液自然冷却至室温。通过离心收集油酸包覆的上转换纳米材料，用环己烷和乙醇洗涤数次，最后在
60℃的烘箱中干燥。取50mg油酸包覆的上转换纳米材料加入6mL甲苯和4mL三氯甲烷，然后加入20mL 15mg/mL聚丙烯酸水溶液，连续搅拌48h。最后，通过离心将羧基化上转换纳米材料溶液中分离出来，并用超纯水洗涤三次去除过量的聚丙烯酸，干燥后得到羧基化上转换纳米材料(图1)。

[0060] 从图1中可以看出，羧基化纳米材料表面的羧基可以与氨基化的适配体互补链通过共价结合连接，使连接更加牢固，同时相比油酸包覆的上转换纳米材料具有更好的水溶性和分散性，有利于实际样品的检测。

[0061] (2)在羧基化上转换纳米材料表面连接环丙沙星适配体互补链(环丙沙星适配体互补链的序列为3’‑TATGGTCGAATAAGTTAACGTCCCATAGACTCCG AACTAGATGATTTACAGCACTCCCCTAAGTAAACCGCAACTATGCATGTTA GCATTAAGTCAATC‑(CH2)6‑NH2‑5’)和辣根过氧化物酶：在10mg羧基化上转换纳米材料中加入10mL Tris‑HCl缓冲液、0.5mL 1.0mg/mL的N‑羟基硫代琥珀酰亚胺水溶液和0.5mL 2.0mg/mL的1‑乙基‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐水溶液，在4℃下搅拌2.0h。加去离子水离心清洗后取沉淀再分散于10.0mL Tris‑HCl缓冲液中。
随后，将2.5OD环丙沙星适配体互补链和5mg辣根过氧化物酶加入混合物中，在4℃下缓慢搅拌12h，离心取沉淀，用超纯水洗涤沉淀，得到酶联上转换荧光材料(记为cDNA‑UCNPs‑HRP)。
最后，将酶联上转换荧光材料重悬于40mL、pH为5的磷酸盐缓冲液中，并在4℃保存以备后续使用。

[0062] (3)制备磁化聚多巴胺：将4.1g FeCl3·6H2O和2.35g FeSO4·7H2O溶解在100mL超纯水中，在氮气下磁力搅拌20分钟。然后加入25mLNH3·H2O，在80℃下搅拌60分钟，反应结束后，用强力磁铁将得到的Fe3O4从溶液中分离出来，用超纯水冲洗至少三次，以去除多余的NH3·H2O。最后，将产物在真空烘箱中50℃干燥，得到干燥的Fe3O4。

[0063] 取100mg Fe3O4，超声分散于200mL Tris‑HCl缓冲液中，在上述溶液中加入75mg盐酸多巴胺，室温下继续搅拌8h，通过磁铁吸附收集磁化聚多巴胺，用去离子水和乙醇洗涤三次。将磁化聚多巴胺放入60℃烘箱中干燥12h(图2、图3)。

[0064] 从图3可以看出，磁化聚多巴胺具有良好的猝灭性能，可以有效猝灭酶联上转换荧光材料的荧光，调节荧光信号。磁化聚多巴胺还具有良好的磁性，便于信号分离，无需耗时的离心过滤即可有效地从干扰物中分离出来。利用磁化聚多巴胺将目标与共存离子分离，可以消除实际样品的干扰，实现对目标的痕量检测。

[0065] (4)磁化聚多巴胺连接适配体：将10mg磁化聚多巴胺加入6mLPBS(pH值为6.8)缓冲液中超声分散。随后加入2.5OD的环丙沙星适配体(环丙沙星适配体序列为5’‑NH2‑(CH2)6ATA CCA GCT TAT TCA ATT GCA GGG TAT CTG AGG CTT GAT CTA CTA AAT GTC GTG GGG CAT TGC TAT TGG CGT TGA TAC GTACAATCG TAATCA GTTAG‑3’)和52.65mg NaCl，37℃振摇
24h后，去离子水洗涤数次，去除未结合的环丙沙星适配体。最后，将沉淀物重新分散在20mL PBS缓冲液(pH值为6.8)中，得到连接适配体的磁化聚多巴胺溶液，4℃保存。

[0066] (5)制备草酸钛钾酸溶液：将100mg氨基磺酸和200mg草酸钛钾溶于50mL去离子水中，摇匀，制备出浓度为2mg/mL的草酸钛钾酸溶液。

[0067] (6)制备荧光‑紫外双信号传感器：将制备好的200μL酶联上转换荧光材料与100μL连接适配体的磁化聚多巴胺混合，37℃孵育20分钟，构成荧光‑紫外双信号传感器。

[0068] (7)建立环丙沙星含量检测荧光和比色标准曲线：配制不同浓度的环丙沙星溶液(10、50、100、200、400、600、800、1000μg/L)，将200μL不同浓度的环丙沙星溶液和荧光‑紫外双信号传感器混合，检测磁分离后上清液的荧光强度信号特征值，再在上清液中加入100μL 8mmol/L的过氧化氢水溶液，反应1h后，加入草酸钛钾酸溶液得到浅黄色溶液，检测浅黄色溶液的紫外吸光度，根据不同浓度的环丙沙星标准液所对应的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，绘制出环丙沙星浓度相关的紫外和荧光标准曲线(参见图4)。

[0069] (8)鱼肉样品中环丙沙星含量的检测：称取5g鱼肉样品，打成匀浆，加入30mL酸化乙腈、30g无水硫酸钠，振荡15分钟，离心后取沉淀再加入30mL酸化乙腈，振荡后离心得到上清液，将两次离心所得上清液置于分液漏斗中，再加入25mL正己烷进行振荡，取下层溶液，用旋转蒸发仪将溶液蒸发至干，加入1mL甲醇溶液，经滤膜过滤得到样品液；测定样品液的荧光强度和紫外吸光度的信号特征值，根据步骤(6)所得的环丙沙星检测标准曲线，计算出鱼肉样本中环丙沙星的含量。

[0070] 对3个鱼肉样品，采用本发明实施例1所述方法和步骤，对鱼肉中环丙沙星含量进行测定，并用国家标准方法(GB‑31656.3‑2021)进行验证，测定结果如表1所示。

[0071] 表1本发明方法与高效液相色谱法检测鱼肉样品中环丙沙星的结果

[0072]

[0073] 从表1中可以看出，本发明的方法在实际样品中具有较好的准确度，应用前景较好。

[0074] 对比例1

[0075] 同实施例1，区别在于，步骤(6)具体为：将制备好的100μL酶联上转换荧光材料与100μL磁化聚多巴胺混合，37℃孵育20分钟，构成荧光‑紫外双信号传感器。

[0076] 利用本对比例方法对鱼肉中的环丙沙星含量进行测定，检测准确度较实施例下降。

[0077] 对比例2

[0078] 同实施例1，区别在于，不进行步骤(2)中，步骤(6)为：将步骤(1)制备好的200μL羧基化上转换纳米材料与100μL磁化聚多巴胺混合，37℃孵育20分钟，构成荧光‑紫外双信号传感器。其他步骤与实施例1相同。

[0079] 利用本对比例方法对鱼肉中的环丙沙星含量进行测定，检测准确度较实施例下降。

[0080] 以上，仅为本申请较佳的具体实施方式，但本申请的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本申请揭露的技术范围内，可轻易想到的变化或替换，都应涵盖在本申请的保护范围之内。因此，本申请的保护范围应该以权利要求的保护范围为准。