西番莲PeERF-2基因及其应用

摘要

本发明提供了一种西番莲PeERF‑2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeERF‑2基因，在干旱、低温等胁迫下西番莲中PeERF‑2基因转录水平上调，说明该基因能够提高植物的抗旱性和抗寒性等，研究显示该基因还能够显著提高酵母低温胁迫下的生存能力，促进植物早抽薹、早开花、减少植物根毛，提高植物抗寒性等。本发明为提高酵母抗逆性、调控植物生长和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。

权利要求

1.一种西番莲PeERF‑2基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

2.权利要求1所述西番莲PeERF‑2基因编码的蛋白质。

3.含有权利要求1所述西番莲PeERF‑2基因的编码区的重组载体或宿主菌或表达盒。

4.根据权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，所述西番莲PeERF‑2基因的编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。

5.如权利要求3所述的重组载体，其特征在于，所述重组载体的原始载体为pYES 2表达载体，所述西番莲PeERF‑2基因的编码区位于pYES 2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。

6.如权利要求1所述的西番莲PeERF‑2基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒、或者如权利要求4所述的重组载体在提高酵母抗寒性中的应用。

7.如权利要求1所述的西番莲PeERF‑2基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒、或者如权利要求4所述的重组载体在促进植物早抽薹、植物早开花和/或减少植物根毛中的应用，所述植物是拟南芥。

8.如权利要求1所述的西番莲PeERF‑2基因、或者如权利要求2所述的蛋白质、或者如权利要求3所述的重组载体或宿主菌或表达盒、或者如权利要求4所述的重组载体在提高植物抗旱性和/或抗寒性中的应用，所述植物是拟南芥。

说明书

西番莲PeERF‑2基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种西番莲PeERF‑2基因及其应用。

背景技术

[0002] 西番莲是一种多年生常绿攀缘木本藤蔓植物，是一种芳香可口的水果，被誉为“果汁之王”。又称百香果、巴西果、藤桃、百香果、心莲、西菊、枝莲、酸茄花、钟表草。它的天然原汁色泽艳丽，具有独特浓郁的芳香风味和丰富的营养。西番莲果实不仅营养价值高，还有防病健身的功效。据测定，西番莲汁含有60多种挥发性化合物，可溶性固物含量高达10‑14％，有机酸、氨基酸种维生素和矿物质元素含量均十分丰富，它作原料，可加工成果汁、果露、果酱、果冻等产品，具有美容养颜、清暑开胃、消除疲劳、提神醒酒、消炎祛斑、降脂降压、防止动脉硬化等功效。由于西番莲的应用越来越广泛，其分子生物学的研究也不断深入和发展，基因表达分析也逐渐应用于揭示西番莲基因表达和调控的机理。因此，对西番莲中重要性状基因定位、克隆、功能等，对于西番莲的综合开发利用具有重要的意义。

[0003] 西番莲是喜温、喜光的植物，一般在热带、亚热带地区栽培，其最佳生长环境温度约为20‑30℃，年平均气温18℃以上的地区最为适宜种植，最冷月平均气温在8 ℃以上，在广西、贵州、福建、云南等部分种植区域，常遇冻害问题，影响面积大概占国内种植面积的30%以上。低温严重制约着百香果的生长发育，会使组织细胞中的水分结冰霜冻，使其收到损伤或死亡，轻则叶片受伤、落叶落果，重则茎杆冻裂、根部受损，全株死亡。紫果品种能经受‑3℃的低温，仅是秋梢幼嫩组织表现出轻微冻害。但如果长时间让其处于0℃以下的低气温环境中，其树冠也容易被冻枯致死，对持续低温忍耐力较强于黄金百香果。黄金百香果在
15℃以下时生长缓慢，低于10℃基本停止生长，6℃以下嫩芽出现较微寒害，4℃时叶片和藤蔓嫩梢干枯，因此，提高百香果的耐寒性，是实现百香果产业持续健康发展的关键因素，也是百香果产业发展亟待解决的关键问题。因此，通过挖掘具有抗逆功能的西番莲基因，进一步验证其在提高西番莲抗低温胁迫上的调控功能，为研究百香果的抗性机制并利用其进行遗传改良提供了良好的基础。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于克服现有技术中的不足，提供一种西番莲PeERF‑2基因及其应用。

[0005] 本发明的第一个方面是提供一种西番莲PeERF‑2基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。

[0006] 本发明的第二个方面是提供本发明第一个方面所述西番莲PeERF‑2基因编码的蛋白质。

[0007] 本发明的第三个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeERF‑2基因编码区的重组载体。

[0008] 其中，所述重组载体原始载体可以采用基因重组领域中常用的载体，例如病毒、质粒等。本发明对此不进行限定。在本发明的一个具体实施方式中，所述原始载体采pMD19‑T载体、pCAMBIA1304表达载体和pYES2表达载体，但应当理解的是，本发明还可以采用其他质粒、或者病毒等。

[0009] 优选地，所述重组载体的原始载体为pCAMBIA1304表达载体，西番莲PeERF‑2基因编码区位于pCAMBIA1304表达载体的NcoI和SpeI两限制性内切酶位点之间。

[0010] 优选地，所述重组载体的原始载体为pYES2表达载体，西番莲PeERF‑2基因编码区位于pYES2表达载体的HinIII和BamHI两限制性内切酶位点之间。

[0011] 本发明的第四个方面是提供含有第一个方面所述西番莲PeERF‑2基因编码区的宿主菌。

[0012] 本发明的第五个方面是提供含有本发明第一个方面所述西番莲PeERF‑2基因编码区的表达盒。

[0013] 本发明的第六个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeERF‑2基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高酵母抗寒性中的应用。

[0014] 优选地，所述酵母为酿酒酵母，比如INVSc 1菌株等。

[0015] 本发明的第七个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeERF‑2基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在促进植物早抽薹、和/或进植物早开花、和/或减少植物根毛中的应用。

[0016] 在本发明一个具体的实施方式中，所述植物为拟南芥。

[0017] 本发明的第八个方面是提供如本发明第一个方面所述的西番莲PeERF‑2基因、或者如本发明第二个方面所述的蛋白质、或者如本发明第三个方面所述的重组载体、或者本发明第四个方面所述的宿主菌、或者本发明第五个方面所述的表达盒在提高植物抗旱性、和/或抗寒性中的应用。

[0018] 本发明的第九个方面是提供一种引物对，所述引物对为ATGGATGATGTTTTCTCGAAC和CTATATGGAAAAGCTCCATAA；或者所述引物对为CAGTATGGACTTTTGGTCGCTTG和CGCTTCTTGGGATAACTGGAA；或者所述引物对为TGCCATGGATGGATGATGTTTTCTCGAA和CGGACTAGTTATGGAAAAGCTCCATAA；或者所述引物对为CAAGCTTATGGATGATGTTTTCTCGAAC和CGGGATCCTATGGAAAAGCTCCATAA。

[0019] 本发明提供了首次从西番莲中克隆获得西番莲PeERF‑2基因，在干旱、低温等胁迫下西番莲中PeERF‑2基因转录水平上调，说明该基因能够提高植物的抗旱性和抗寒性等，研究显示该基因还能够显著提高酵母低温胁迫下的生存能力，促进植物早抽薹、早开花、减少植物根毛，提高植物抗寒性等。本发明为提高酵母抗逆性、调控植物生长和提高植物抗逆性等方面的研究提供新的候选基因。

附图说明

[0020] 图1为PeERF‑2基因在不同非生物胁迫下的qRT‑PCR情况。

[0021] 图2为PeERF‑2基因在三个果实成熟时期的qRT‑PCR结果。

[0022] 图3为低温胁迫下转PeERF‑2基因酵母中的生长情况。

[0023] 图4为生长45天的野生型和转基因植株表型。

[0024] 图5为野生型和转基因植株的根毛。

[0025] 图6为转PeERF‑2基因拟南芥响应低温胁迫。

[0026] 图7为转PeERF‑2基因拟南芥在低温胁迫下的表型。

[0027] 图8为转PeERF‑2基因拟南芥在低温胁迫下叶绿素荧光检测结果和生理指标测量结果。

具体实施方式

[0028] 下面参照附图，结合具体的实施例对本发明作进一步的说明，以更好地理解本发明。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。

[0029] 实施例1：西番莲PeERF‑2基因的克隆

[0030] 提取紫果西番莲幼苗中的总RNA，反转录得到cDNA第一链。以cDNA第一链为模板，以ATGGATGATGTTTTCTCGAAC和CTATATGGAAAAGCTCCATAA为引物，进行PCR扩增反应。

[0031] 反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。

[0032] PCR扩增程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，共35个循环。

[0033] 回收扩增产物，并克隆至pMD 19‑T载体（Promega，麦迪逊，WI，USA）中（pMD 19‑T‑ PeERF‑2载体），并在ABI PRISM 310遗传分析仪（PerkinElmer Applied Biosystems，Foster City，CA，USA）上测序。测序结果表明，克隆获得西番莲PeERF‑2基因，其ORF序列如SEQ ID NO:1所示。

[0034] 实施例2：西番莲PeERF‑2基因的表达分析

[0035] 将商品名为“台农”的紫果西番莲（Passiflora edulis）的健康西番莲幼苗在培养‑2 ‑1箱（30 ℃，200μmol·m ·s 光强，12小时光照/12小时黑暗循环，70%相对湿度）生长至约1 m的高度，并具有8‑10片功能性叶片。 将植物用于各种非生物胁迫处理：

[0036] ①干旱胁迫：将植株进行干旱处理，当土壤水分为50%和10%时分别取样；

[0037] ②盐处理：用300mM的盐溶液处理3天和10天分别取样；

[0038] ③低温处理：将植株置于0℃除了20和48小时分别取样；

[0039] ④高温处理：将植株置于45℃ 2、4和24小时分别取样。

[0040] 利用实时荧光定量PCR（qRT‑PCR）技术，检测 PeERF‑2在四种非生物胁迫下的叶片中基因表达情况。结果如图1所示，PeERF‑2可对不同的非生物胁迫做出响应，在干旱处理时当土壤水分含量为10%时，PeERF‑2被高度诱导表达，在高温胁迫和盐胁迫下，PeERF‑2的表达受到抑制，在冷胁迫下，PeERF2被高度诱导表达。说明该基因与西番莲抗旱性和抗寒性相关，可以用于提高西番莲的抗旱性和抗寒性等。

[0041] 对正常生长条件下成熟期间的西番莲果实取样，选择三个果实成熟阶段的果实（T1，收获前两周，果皮是绿色的；T2，采收时果皮红紫色，无皱缩；T3，在30  °C下收获后一周，果皮已经收缩）。利用实时荧光定量PCR（qRT‑PCR）技术，检测果实成熟3个阶段，西番莲PeERF‑2基因的表达情况，结果如图2所示，该基因与果实成熟呈负相关，在T1 期达到最高表达量。

[0042] 实时荧光定量PCR（qRT‑PCR）操作如下：将组织或叶冷冻，并使用植物RNA分离试剂盒以三个生物学重复提取总RNA。 在Light 96（Roche）上使用SYBR  ® Premix Ex Taq™（TaKaRa，Japan，Tokyo）化学进行qRT‑PCR分析。 使用2−∆ ∆CT方法计算相对表达水平。引物为F:CAGTATGGACTTTTGGTCGCTTG, R:CGCTTCTTGGGATAACTGGAA，PCR反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。PCR反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，共35个循环。

[0043] 实施例3：重组载体的构建

[0044] 以pMD19‑T‑PeERF‑2质粒为模板，以引物TGCCATGGATGGATGATGTTTTCTCGAAC（划线为NcoI酶切位点）和CGGACTAGTTATGGAAAAGCTCCATAA（划线为SpeI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。
反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，56℃退火1 min，72℃延伸3 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经NcoI和SpeI双酶切后连接至经相同酶切后的pCAMBIA1304表达载体，得到pCAMBIA1304‑PeERF‑2载体。

[0045] 以pMD19‑T‑PeERF‑2载体为模板，以引物CAAGCTTATGGATGATGTTTTCTCGAAC（划线为HinIII酶切位点）和CGGGATCCTATGGAAAAGCTCCATAA（划线为BamHI酶切位点），进行PCR扩增。反应体系为模板1ul，5'端引物1ul， 3'端引物1ul，PCR mix 12.5ul，水 9.5ul共25ul体系。
反应程序为94℃变性4 min，94℃变性30秒，58℃退火1 min，72℃延伸1 min，72℃延伸10 min，共35个循环。扩增产物经HinIII和BamHI双酶切后连接至经相同酶切后的pYES 2表达载体，得到pYES 2‑PeERF‑2载体。

[0046] 实施例4：PeERF‑2在酵母中的功能互补

[0047] 将pYES2‑PeERF‑2和pYES2载体（对照）分别转染到INVSc1菌株（酿酒酵母）中。为了进行酵母互补测定，将酵母液在SD‑Ura液体培养基中在30 ° C下培养，再进行冷胁迫处理：将 pYES2‑PeERF‑2和 pYES2 空载体（对照）进行冷应激实验（‑ 20摄氏0 小时、12小时、24 小时、36小时和 48 小时），将处理后的菌液在SD‑Ura固体培养基中30 ° C下培养。实验重复三次。

[0048] 将pYES2‑PeERF‑2和pYES2空载体（对照）转化到INVSCl中进行低温胁迫，结果如图3所示（图3中1×、10×、100×、1000×分别代表将菌液稀释1倍，10倍，100倍，1000倍）。结果显示，转染了 PeERF‑2 基因的酵母在冷胁迫下的 24h、36h 和 48h 生长情况均优于对照组。 这一结果表明，PeERF‑2 能提高转基因酵母的抗寒性。

[0049] 实施例5：转基因植株的表型

[0050] 将pCAMBIA 1304‑PeERF‑2转化农杆菌，然后将转化后的农杆菌用在28 °C下在分别含有Kan和Rif抗生素的YEB培养基中振荡，并添加到拟南芥转基因浸润溶液（1/2 MS，50 g/L）中至0 D 600=0.8‑1.0。使用花序浸渍转化拟南芥，我们获得了PeERF‑2转基因拟南芥系。

[0051] 将野生型和获得的转基因拟南芥分别播种在蛭石中，45天后观察转基因拟南芥的表型，结果显示，正常生长45天的转基因拟南芥出现比野生型早抽薹，早开花的现象（图4）。通过显微镜观察转基因和野生型的根系，发现转基因根系中的根毛远少于野生型（图5）。

[0052] 实施例6：转基因植株的低温胁迫处理

[0053] 将实施例5获得的转基因拟南芥生长14天后，进行低温胁迫处理：在4℃ 和23℃培养箱中分别处理 36 小时。将正常和低温条件下的新鲜转基因拟南芥样品置于 X‑Gluc 溶液中，37摄氏度避光水浴12小时，用无水乙醇对叶片的叶绿素进行脱色处理并拍照。用 4‑甲基伞形酮葡糖苷酸荧光法测定 Gus 酶活性。结果如图6所示。在正常生长条件下，转基因拟南芥GUS 染色主要集中在茎部，而在低温胁迫条件下，GUS 染色增强且主要集中在幼苗的叶片。进行了 GUS 酶活性测试，发现低温胁迫处理后的转基因拟南芥 GUS 活性比对照高 3.4 倍。结果表明，低温胁迫对 PeERF‑2 有诱导作用，说明PeERF‑2可以用于提高植物的抗寒性等。

[0054] 将实施例5获得的转基因拟南芥生长25天后，在进行低温0℃处理10小时后，利用叶绿素荧光成像技术检测冷胁迫对转基因植物和野生型植物生长的影响，结果如图7所示，在低温条件下拍摄的叶绿素荧光图像显示，所有植物都受到了比正常条件下更严重的损害（正常植物叶片的假色为蓝色，而叶片的假色由绿变黄、甚至变黑，表明植物受到了更严重的损害），在正常条件下，野生型和转基因植株的叶片都是蓝色的，但当受到冷胁迫时，野生型的大部分叶片变绿甚至变黑，而转基因植株只有部分叶片变绿，大部分叶片还是蓝色的，这表明 PeERF‑2 可以提高转基因植物的耐寒性。对WT(野生型)和转基因植株进行MDA(丙二醛)、PRO(脯氨酸)和Ion leakage（离子渗透率）的测定，结果图8所示，当植物遭受逆境下胁迫时，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛是膜脂过氧化的最终分解产物，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。在本研究结果中，当植株正常生长时，野生型和转基因植株中的丙二醛含量差异不大，当植株遭受到低温胁迫时，野生型和转基因植株的丙二醛含量均上升，与对照组相比，野生型中的丙二醛含量增加得更多且高于转基因植株，因此，当受到低温胁迫时转基因植株能够降低植株的膜脂过氧化程度，从而提高植株的抗寒性。在正常环境条件下，植物体内游离脯氨酸含量较低，而在逆境胁迫下，植物体内游离脯氨酸含量增加，游离脯氨酸含量的积累量与植物的抗逆性成正比。在本研究结果中，在正常生长条件下，野生型和转基因植物中的丙二醛含量差异较小，而当植物受到低温胁迫时，野生型和转基因植株体内的脯氨酸含量均有所增加，而转基因植株的脯氨酸含量要明显高于野生型，说明PeERF‑2提高了转基因拟南芥的抗寒性。此外的，当植物在受到逆境胁迫时，原生质结构会收到影响，原生质半透膜的透性会发生变化，随着逆境胁迫增加，植物的离子渗透率会增加，因此测定植物的离子渗透率能够进一步指示植物的抗胁迫能力，通常离子渗透率低的植物抗逆性较强。在本研究中，正常生长时，野生型和转基因植株的离子渗透率相差不大，当低温胁迫时，各植株的离子渗透率均有所增加，而野生型远高于转基因植株，说明在低温胁迫时，PeERF‑2能够减少植株中的离子渗透而提高植株的抗寒性。

[0055] 以上对本发明的具体实施例进行了详细描述，但其只作为范例，本发明并不限制于以上描述的具体实施例。对于本领域技术人员而言，任何对该实用进行的等同修改和替代也都在本发明的范畴之中。因此，在不脱离本发明的精神和范围下所作的均等变换和修改，都应涵盖在本发明的范围内。