一株屎肠球菌CD6、微生物菌剂及其应用

摘要

本发明公开了一株屎肠球菌CD6、微生物菌剂及其应用，属于益生菌制剂技术领域。该菌株于2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63640。屎肠球菌CD6的单一益生菌制剂及复合益生菌制剂能有效增加犬粪便中乳酸菌数量，降低大肠杆菌数量，降低粪便异味和脂代谢水平。还有改善宠物犬毛质、提亮毛色光泽、促进皮肤健康的益生功能，在宠物产品中具有广阔的应用前景。

权利要求

1.一株屎肠球菌CD6(Enterococcus faecium)，其特征在于，该菌株于2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63640。

2.一种微生物菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述屎肠球菌CD6。

3.如权利要求1所述屎肠球菌CD6或权利要求2所述微生物菌剂在宠物犬饲养中的应用。

4.一种宠物犬饲料，其特征在于，包括权利要求1所述屎肠球菌CD6或权利要求2所述微生物菌剂。

5.如权利要求1所述屎肠球菌CD6或权利要求2所述微生物菌剂在调整宠物犬肠道菌群中的应用。

6.如权利要求1所述屎肠球菌CD6或权利要求2所述微生物菌剂在改善宠物犬粪便气味中的应用。

7.如权利要求1所述屎肠球菌CD6或权利要求2所述微生物菌剂在制备降低宠物犬血清TC、TG、LDL‑C浓度的产品中的应用。

说明书

一株屎肠球菌CD6、微生物菌剂及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及益生菌制剂技术领域，特别是涉及一株屎肠球菌CD6、微生物菌剂及其应用。

背景技术

[0002] 随着人们生活水平的提高，宠物逐渐走进大多数家庭，成为主人情感的寄托。与宠物长期生活在一起时，由于空间较为密闭、宠物掉毛、散发异味等问题经常困扰着人们。宠物犬散发的异味主要来自粪便，大多由肠道内有害微生物降解产生的氨气、硫化氢、吲哚等物质组成。尤其到了夏季，宠物粪便中的臭味更加明显，还会招引蝇、蛾等虫类，给人类和宠物的健康和生活质量造成了威胁。此外，由于当今宠物的营养不均衡，宠物犬的肥胖问题也日益突出。

[0003] 益生菌是指在给予足够的量时，对宿主健康产生有益的活的微生物。益生菌可产生抑菌物质，改善动物肠道菌群平衡，提高动物免疫机能的特性。乳酸菌是一类有着长期的安全食用史的益生菌。有研究表明，益生菌有显著清除食用动物牛、猪、鸡等饲养环境中氨气、硫化氢等物质，净化养殖场环境的效果。然而，目前能有效清除宠物犬猫粪便臭味的益生菌报道较少，而具有知识产权的宠物益生菌产品在市场上更少。因此，筛选宠物用益生菌菌株及研发相关益生菌产品具有重要的现实意义，并助力我国宠物产业的健康发展和人类的公共卫生发展。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一株屎肠球菌CD6、微生物菌剂及其应用，以解决上述现有技术存在的问题。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明提供一株屎肠球菌CD6(Enterococcus faecium)，该菌株于2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63640。

[0007] 本发明还提供一种微生物菌剂，包括所述屎肠球菌CD6。

[0008] 优选的是，还包括植物乳杆菌F3a和嗜热链球菌BMD3。

[0009] 优选的是，所述屎肠球菌CD6、植物乳杆菌F3a和嗜热链球菌BMD3的活菌数比例为1:1:1。

[0010] 本发明还提供所述屎肠球菌CD6或所述微生物菌剂在宠物饲养中的应用。

[0011] 优选的是，所述宠物包括犬。

[0012] 本发明还提供一种宠物饲料，包括所述屎肠球菌CD6或所述微生物菌剂。

[0013] 本发明还提供所述屎肠球菌CD6或所述微生物菌剂在调整宠物肠道菌群中的应用。

[0014] 本发明还提供所述屎肠球菌CD6或所述微生物菌剂在改善宠物粪便气味中的应用。

[0015] 本发明还提供所述屎肠球菌CD6或所述微生物菌剂在制备降低宠物血清TC、TG、LDL‑C浓度的产品中的应用。

[0016] 本发明还提供所述屎肠球菌CD6或所述微生物菌剂在制备改善宠物毛质、提亮毛色、促进皮肤健康的产品中的应用。

[0017] 本发明还提供所述屎肠球菌CD6或所述微生物菌剂在降低宠物粪便中氨气、硫化氢和吲哚的水平中的应用。

[0018] 本发明公开了以下技术效果：

[0019] 本发明提供一株屎肠球菌CD6、微生物菌剂及其应用，屎肠球菌CD6的单一益生菌制剂及复合益生菌制剂能有效增加犬粪便中乳酸菌数量，降低大肠杆菌数量，降低粪便异味和脂代谢水平。还有改善宠物犬毛质、提亮毛色光泽、促进皮肤健康的益生功能，在宠物产品中具有广阔的应用前景。

附图说明

[0020] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0021] 图1为屎肠球菌CD6的菌落形态图；

[0022] 图2为屎肠球菌CD6的革兰氏染色镜检图；

[0023] 图3为屎肠球菌CD6的PCR扩增图；M泳道为2000bp的DNA Marker，泳道1：本发明菌株CD6；目的条带长度约为1500bp。

具体实施方式

[0024] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0025] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0026] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0027] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0028] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0029] 本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规方案，所用试剂或原料，如未特别说明，均购自商业渠道或是已公开。

[0030] 本发明培养基配方：

[0031] MRS液体培养基：葡萄糖20.0g、牛肉浸粉10.0g、蛋白胨10.0g、酵母浸粉5.0g、无水乙酸钠5.0g、柠檬酸三铵2.0g、K2HPO4·3H2O 2.0g、吐温80 1.0mL、MgSO4·7H2O0.29g、MnSO4·H2O 0.058g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH为7.2，于121℃高压灭菌20min。

[0032] MRS固体培养基：在液体MRS培养基成分基础上加入琼脂15.0g，调节pH为7.2，于121℃高压灭菌20min。

[0033] 含0.75％碳酸钙MRS固体培养基：在液体MRS培养基成分基础上加入碳酸钙7.5g，琼脂15.0g，调节pH为7.2，于121℃高压灭菌20min。

[0034] 实施例1乳酸菌的分离、筛选及鉴定

[0035] 1.1菌株的分离

[0036] 采集健康犬的新鲜粪便样品与无菌PBS混匀、过滤；滤液梯度稀释后涂布于含0.75％碳酸钙的MRS平板上，37℃厌氧培养；选择有溶钙圈且形态、色泽不同的单菌落在平板上划线纯化。挑取单菌落接种于MRS液体培养基中，37℃厌氧培养24h，共计初步分离得到
300株新分离株。

[0037] 1.2菌株的形态观察

[0038] 菌株CD6(本实验室分离)在MRS平板上呈乳白色，菌落成圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，凸起的菌落(图1)。镜检CD6的菌体形态为圆形或椭圆形，革兰氏染色阳性，菌体多呈单个、对生和链状较少(图2)。

[0039] 1.3胆盐和耐酸的初步筛选

[0040] 将上述新分离株的菌液接种于pH＝2.5的MRS液体培养基中，37℃培养3h后平板计数；结果显示，其中83株新分离株在pH＝2.5条件下存活率高于85％。

[0041] 将上述83株新分离株接种于含0.3％牛胆盐的MRS液体培养基中，37℃培养3h后平板计数；结果显示，其中35株新分离株在含0.3％牛胆盐的条件下存活率高于80％。

[0042] 1.4菌株的分子生物学鉴定

[0043] 提取上述35株分离株的基因组，用细菌16S rDNA通用引物27F及1492R进行PCR扩增。

[0044] PCR反应体系如下：模板DNA 1μL、10μmol/L上下游引物各2μL、2×Taq Master Mix 25μL、ddH2O补至50μL；

[0045] PCR反应程序如下：95℃，5min；95℃，45s；55℃，45s；72℃，1min；共35个循环；72℃，8min。

[0046] PCR产物经琼脂糖凝胶电泳检测得到约为1500bp的目的片段(图3)，测序结果提交NCBI进行Blast分析，鉴定确认为屎肠球菌。

[0047] 该菌株于2023年7月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC NO：63640。

[0048] 实施例2屎肠球菌的益生特性研究

[0049] 1.屎肠球菌的表面性质测定

[0050] 自凝集率测定：调节屎肠球菌在波长600nm处的吸光值为0.5±0.02(A0)，静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)＝(A0‑A24)/A0×100％。

[0051] 屎肠球菌与大肠杆菌共聚集率测定：1:1制备屎肠球菌和大肠杆菌ATCC43888的混合悬菌液，并调节其在波长600nm处的吸光值为0.5±0.02(A0)，静置24h后测定吸光值A24，共聚集率(％)＝(A0‑A24)/A0×100％。

[0052] 疏水性测定：调节波长600nm处屎肠球菌的吸光值为0.5±0.02(A0)；分别取1mL二甲苯加入到3mL屎肠球菌悬液中，室温预培养10min后涡旋振荡2min将两相体系充分混匀；37℃静置共培养1h后去除有机相，测定水相的吸光值A1，疏水率(％)＝(A0‑A1)/A0×
100％。

[0053] 屎肠球菌CD6的表面性质如表1所示，其自凝集率为70.22％，与大肠杆菌的共凝集率为60.80％，疏水性为55.39％。

[0054] 表1屎肠球菌表面性质测定结果

[0055] 菌株 自凝集率 共凝集率 疏水率屎肠球菌CD6 70.22％ 60.80％ 55.39％

[0056] 2.屎肠球菌CD6的抑菌特性

[0057] 本实施例用指示菌包括大肠杆菌、沙门氏菌等8株病原菌，其中大肠埃希氏杆菌ATCC43888、巴氏杆菌453、鲍氏志贺氏菌ATCC9207、以及金黄色葡萄球菌ATCC6538购自中国兽医药品监察所；大肠埃希氏杆菌LXR1、沙门氏菌BSC1、大肠埃希氏杆菌LXR2、产气荚膜梭菌MQ5由本实验室分离。用琼脂平板扩散法测定屎肠球菌对大肠埃希氏杆菌ATCC43888、大肠埃希氏杆菌LXR1、巴氏杆菌453、鲍氏志贺氏菌ATCC9207、沙门氏菌BSC、大肠埃希氏杆菌LXR2、金黄色葡萄球菌ATCC6538和产气荚膜梭菌MQ5的抑菌活性。结果显示(表2)，屎肠球菌CD6可抑制大肠杆菌、沙门氏菌、巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、鲍氏志贺氏菌和产气荚膜梭菌等致病菌的生长，表明CD6具有抑菌性强和抑菌谱广的特性。

[0058] 表2屎肠球菌CD6抑菌能力测定(mm)

[0059] 致病菌菌株 抑菌圈直径 致病菌菌株 抑菌圈直径大肠埃希氏杆菌ATCC43888 15.40 沙门氏菌BSC1 13.25
大肠埃希氏杆菌LXR1 12.81 大肠埃希氏杆菌LXR2 16.05
巴氏杆菌453 13.66 金黄色葡萄球菌ATCC6538 16.51
鲍氏志贺氏菌ATCC9207 14.17 产气荚膜梭菌MQ5 12.23

[0060] 3.屎肠球菌的黏附性测定

[0061] 用异硫氰酸荧光素(FITC)溶液标记屎肠球菌及对照菌株鼠李糖乳杆菌GG；调节菌8
悬液浓度为2×10CFU/mL并测定其在吸收光波长为485nm、发射光波长为530nm时的荧光强度，为初始相对荧光值R0。

[0062] 分别向单层细胞中加入0.5mL屎肠球菌菌悬液或鼠李糖乳杆菌GG；孵育2h，无菌PBS漂洗4次；胰酶消化5min后；测定细胞悬液的荧光强度，即为黏附后相对荧光值R2。

[0063] 菌株的黏附率＝(R2/R0)×100％

[0064] 屎肠球菌CD6对上皮细胞Caco‑2的黏附率为11.95％，略低于参考菌株鼠李糖乳杆菌GG，但差异不显著(表3)。

[0065] 表3屎肠球菌CD6的黏附率

[0066]菌株 黏附率(％)
屎肠球菌CD6 11.95±1.25
鼠李糖乳杆菌GG 12.22±0.30

[0067] 4.屎肠球菌CD6抑制致病菌黏附Caco‑2细胞的特性研究

[0068] 荧光标记大肠杆菌和沙门氏菌，调节浓度为2×108CFU/mL。调节屎肠球菌菌悬液8
浓度为2×10CFU/mL。

[0069] 竞争试验：试验孔向单层细胞中分别加入0.25mL屎肠球菌(或鼠李糖乳杆菌GG(由美国田纳西州立大学惠赠))和致病菌并混合均匀；空白孔加入0.5mL致病菌；共孵育2h；无菌PBS洗涤4次。

[0070] 排斥试验：试验孔向单层细胞中加入0.5mL屎肠球菌(或鼠李糖乳杆菌GG)，空白孔加入等体积细胞培养液；孵育1h，弃去孔内液体，无菌PBS漂洗3次；每孔加入0.5mL致病菌，孵育1h，无菌PBS漂洗4次。

[0071] 置换试验：单层细胞中加入0.5mL致病菌，孵育1h；弃去孔内液体，无菌PBS漂洗3次；试验孔加入0.5mL屎肠球菌(或鼠李糖乳杆菌GG)，空白孔加入等体积细胞培养液；孵育1h，无菌PBS漂洗4次。

[0072] 试验结束后，胰酶消化细胞5min并用1mL细胞培养液终试验，测定荧光强度。

[0073] 屎肠球菌对致病菌黏附Caco‑2的抑制率(％)＝1‑(1‑RT/RB)×100％

[0074] 其中，RT为试验菌株孔细胞悬液的相对荧光值，RB为空白孔细胞悬液的相对荧光值。

[0075] 如表4所示，屎肠球菌CD6和鼠李糖乳杆菌GG均可通过竞争、排斥和置换的方式抑制大肠杆菌和沙门氏菌黏附Caco‑2细胞，主要通过竞争黏附位点的方式抑制大肠杆菌和沙门氏菌的黏附。屎肠球菌CD6对大肠杆菌的竞争黏附率为46.29％，对沙门氏菌的竞争黏附率为50.17％。

[0076] 表4屎肠球菌CD6抑制致病菌黏附Caco‑2细胞

[0077]

[0078] 实施例3基于屎肠球菌CD6的单一及复合益生菌制剂的制备

[0079] 将本发明提供的屎肠球菌CD6以2.5％的接种浓度接种至5L R3发酵培养基中，379
℃、厌氧发酵36h；离心收集菌体、用MRS培养基重悬沉淀，调整菌液浓度为1×10CFU/mL，
15％甘油保存，即含有屎肠球菌CD6的单一益生菌制剂。

[0080] 将本发明提供的屎肠球菌CD6、植物乳杆菌F3a、嗜热链球菌BMD3以2.5％的接种浓度接种至5L R3发酵培养基中，37℃、厌氧发酵36h；离心收集菌体、用MRS培养基重悬沉淀，9
调整菌液浓度为1×10CFU/mL；屎肠球菌CD6、植物乳杆菌F3a(本实验室分离)、和嗜热链球菌BMD3(本实验室分离)以活菌数1:1:1比例配伍，15％甘油保存，即含有屎肠球菌CD6的复合益生菌制剂。

[0081] R3发酵培养基配方如下：葡萄糖70.0g、牛肉膏20.0g、蛋白胨20.0g、酵母浸粉20.0g、乙酸钠4.0g、磷酸氢二钾1.0g、柠檬酸三铵1.0g、硫酸镁0.6g、硫酸锰0.6g、吐温80 
1.0mL、碳酸钙20.0g，将上述成分加入蒸馏水中，定容至1000mL，调节pH为8.0，于121℃高压灭菌20min。

[0082] 实施例4基于屎肠球菌CD6的单一及复合益生菌制剂在宠物犬中的应用

[0083] 将本发明公开的基于屎肠球菌CD6的单一及复合益生菌制剂应用于30只小型犬中。试验分为3组：对照组，单一益生菌制剂组，复合益生菌制剂组，每组10只。对照组饲喂正9
常犬饲料；单一益生菌制剂组在正常犬饲料的基础上加入屎肠球菌CD6，剂量为1×10CFU/mL/只/天；复合益生菌制剂组在正常犬饲料的基础上加入施例3中制备的复合益生菌制剂。
试验期为60d。

[0084] 1.CD6益生菌制剂对宠物犬粪便微生物的影响

[0085] 试验结束后，收集每个组每只犬的粪便，平板计数测定粪便中乳酸菌和大肠杆菌的数量。由表5可以看出，屎肠球菌CD6单一益生菌制剂组和复合益生菌制剂组宠物犬粪便中乳酸菌的数量分别是对照组的2.01倍和4.39倍，大肠杆菌的数量分别是对照组的0.60倍和0.37倍。

[0086] 表5CD6益生菌制剂对宠物犬粪便微生物的影响(log cfu/g)

[0087]

[0088] 2.屎肠球菌CD6益生菌制剂对宠物犬粪便气味的影响

[0089] 在试验第0d，30d和60d收集每只犬的新鲜粪便，并对粪样气味进行评分记录，评分标准如下：0分，无臭；1分，能稍微感觉到极弱臭味；2分，能辨别何种气味的臭味；3分，能明显嗅到臭味；4分，强烈臭味；5分，强烈恶臭气味，让人感到恶心、头疼甚至呕吐。并测定每份粪便样品中氨气，硫化氢及吲哚的含量。

[0090] 检测结果如表6所示，对照组的粪便气味评分有轻微上升趋势，单一益生菌制剂组和复合益生菌制剂组粪便气味的评分逐渐下降，且混合益生菌制剂组评分下降明显。对照组的粪便中氨气、硫化氢和吲哚的含量上升，而单一屎肠球菌CD6饲喂幼型犬60天后，粪便中氨气、硫化氢和吲哚的水平分别下降54.00％、47.77％、48.25％；基于屎肠球菌CD6制备的复合益生菌制剂饲喂幼型犬60天后，粪便中氨气、硫化氢和吲哚的水平分别下降65.52％、68.19％、57.48％。由此可知，本发明提供的屎肠球菌CD6及其复合益生菌制剂有显著减少宠物犬粪便异味的效果。

[0091] 表6益生菌制剂对宠物犬粪便气味的影响

[0092]

[0093] 3.屎肠球菌CD6益生菌制剂对宠物犬脂代谢的影响

[0094] 在试验第0d，30d和60d，每只犬的臂头静脉采血并分离血清，‑20℃保存。使用生化试剂盒，按照说明检测犬血清样本中的总胆固醇(TC)、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白胆固醇(LDL‑C)和高密度脂蛋白胆固醇(HDL‑C)的水平。结果如表7所示，试验期间对照组的TC、TG、LDL‑C和HDL‑C的浓度基本保持不变，单一益生菌组和复合益生菌组的血清TC、TG、LDL‑C和HDL‑C水平有下降趋势。其中，单一屎肠球菌CD6饲喂幼型犬60天后，血清中的TC、TG、LDL‑C浓度分别下降13.16％、16.33％、10.11％，HDL‑C的浓度上升29.69％；基于屎肠球菌CD6制备的复合益生菌制剂饲喂幼型犬60天后，血清中的TC、TG、LDL‑C浓度分别下降16.93％、24.55％、22.01％，HDL‑C的浓度上升39.91％。上述结果说明，基于本发明提供的屎肠球菌CD6制备的单一和复合益生菌制剂有降低幼型犬脂代谢的作用及预防由高血脂引起的肥胖及心血管疾病的潜力。

[0095] 表7益生菌制剂对宠物犬脂代谢的影响(mmol/L)

[0096]

[0097] 4.屎肠球菌CD6益生菌制剂对宠物犬毛发的影响

[0098] 试验期内每天观察并记录所有犬的被毛手感力度、柔顺度、光亮度，测量掉毛量和胱氨酸含量。以抚摸犬被毛时被毛对手掌的作用力度作为评价被毛手感力度的标准；以被毛外观方向的一致性和手感作为评价被毛柔顺度的标准；以自然光为光源，被毛亮度作为评价光亮度的标准。上述感官评估以10分制计量。

[0099] 表8益生菌制剂对宠物犬毛质的影响

[0100] 组别 犬数量 被毛手感力度 柔顺度 光亮度 掉毛量(g) 胱氨酸含量(％)对照组 10 8.20 7.60 8.10 15.15 4.60
单一益生菌组 10 9.35 8.80 9.15 10.25 6.10
复合益生菌组 10 9.70 9.45 9.80 7.60 7.55

[0101] 结果如表8所示，单一益生菌制剂组和复合益生菌制剂组宠物犬的被毛手感力度、柔顺度、光亮和胱氨酸含量菌高于对照组，掉毛量低于对照组。表明屎肠球菌CD6有增加宠物犬毛质，提亮毛色光泽，促进皮肤健康的益生功能。

[0102] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。