一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法

摘要

本发明涉及细胞培养技术领域，尤其涉及一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+0.5‑10μg/mL第一激活剂+0.1‑0.25mg/mL第二激活剂+0.1‑0.5mg/mL蛋白保护剂；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按(0.2‑0.35):1的质量比混合而成；S2：将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，于37℃、5%CO2、100‑160rpm条件下，悬浮培养24h后，再于32℃低温诱导培养6d。本发明通过在HEK293细胞培养过程中添加激活剂，有效提高了重组蛋白的表达水平。

权利要求

1.一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在于，包括以下步骤：S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+0.5‑10μg/mL第一激活剂+0.1‑0.25mg/mL第二激活剂+0.1‑0.5mg/mL蛋白保护剂；

其中，第一激活剂为Akt激活剂SC79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按(0.2‑0.35):

1的质量比混合而成；

所述基础培养基配方为：DMEM/F12培养基+10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸+100ng/mL胰岛素样生长因子1+10ng/mL 白血病抑制因子+100μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯+100nM皮质醇+

1mM N‑乙酰半胱胺酸；

所述蛋白保护剂为甘露醇、山梨醇、海藻糖中的一种；

S2：将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%CO2、100‑

160rpm的摇床培养箱中，悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。

2.根据权利要求1所述的一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在

6 6 

于，所述重组HEK293细胞的接种密度为0.6×10‑1.4×10 cells/mL。

3.根据权利要求1所述的一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，其特征在于，所述重组HEK293细胞为包含乙肝表面抗原序列的表达载体转染HEK293细胞。

说明书

一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及细胞培养技术领域，还涉及重组蛋白生产领域，尤其涉及一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法。

背景技术

[0002] HEK293细胞，又名人胚胎肾细胞293，是一个衍生自人胚胎肾细胞的细胞系，常用于外源基因或重组蛋白的表达，具有转染效率高、易于培养等特点。HEK293细胞可用于稳定和瞬时基因表达，具有高度可重复性的优点，可高效、批量化生产重组蛋白，已成为生物医药领域的研究热点之一。如公告号为CN115537378B的发明专利，公开一种对HEK293细胞进行悬浮培养的方法及其培养基；如公告号为CN114854695B的发明专利，公开一种提高β‑2微球蛋白在HEK‑293细胞中表达水平的细胞转染培养方法；如公告号为CN113717927B的发明专利，公开一种HEK‑293细胞无血清和悬浮培养的制备方法；如公告号为CN111304149B发明专利，公开一种支持HEK293细胞悬浮培养的无血清无蛋白培养基及其制备方法和应用；如公开号为CN111808822A的发明专利，公开细胞培养用补料液及提高重组HEK293细胞蛋白表达量的方法；如公开号CN 115747138 A的发明专利，公开一种HEK 293细胞培养基及其应用，该培养基在保证HEK293细胞高活率，快速生长的同时，能够明显提高瞬转蛋白产量和病毒包装效率的培养基。

[0003] 但是，HEK293细胞随着培养周期的延长，会出现细胞活力及健康状况的下降，因而，致使其表达重组蛋白的能力较为有限。如公告号为CN113621577B的发明专利，公开人源化HEK293细胞系表达重组蛋白用培养基添加剂、重组乙肝疫苗、表达方法，包括丁酸钠和氢化肉桂酸；重组蛋白表达载体转染HEK293细胞，悬浮培养过程中添加所述培养基添加剂；其中丁酸钠添加量为2.0 2.5 mol/L，氢化肉桂酸的添加量为0.6 0.8 mol/L，但当丁酸钠添~ ~加量为2.0mol/L、氢化肉桂酸的添加量为0.6mol/L时，HBsAg的体积表达量仅为46.34mg/L，当丁酸钠添加量为2.5mol/L、氢化肉桂酸的添加量为0.8mol/L时，HBsAg的体积表达量仅为
51.49mg/L。因此，如何进一步提高HEK293细胞对于重组蛋白的表达量是亟待解决的技术难题。

发明内容

[0004] 有鉴于此，本发明的目的在于提出一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，以解决HEK293细胞的蛋白表达水平较低的问题。

[0005] 基于上述目的，本发明提供了一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：

[0006] S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+第一激活剂0.5‑10μg/mL+第二激活剂0.1‑0.25mg/mL+蛋白保护剂0.1‑0.5mg/mL；

[0007] 其中，第一激活剂为Akt激活剂SC79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按(0.2‑0.35):1的质量比混合而成；

[0008] S2：将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%CO2、100‑160rpm的摇床培养箱中，悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。

[0009] 优选的是，所述基础培养基配方为：DMEM/F12培养基+10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）+100ng/mL胰岛素样生长因子1（IGF‑1）+10ng/mL 白血病抑制因子（LIf）+100μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯（VC磷酸酯）+100nM皮质醇+1mM N‑乙酰半胱胺酸（NAC）。

[0010] 优选的是，所述蛋白保护剂为甘露醇、山梨醇、海藻糖中的一种。

[0011] 优选的是，所述重组HEK293细胞的接种密度为0.6×106‑1.4×106 cells/mL。

[0012] 优选的是，所述重组HEK293细胞为包含乙肝表面抗原序列的表达载体转染HEK293细胞。

[0013] 本发明的有益效果：

[0014] 本发明首次以Akt激活剂SC79为第一激活剂，以香草酸、三磷酸肌醇复配第二激活剂，二者协同提高HEK293细胞对于HBsAg基因的表达水平及重组蛋白的表达量。发明人意外地发现，在基础培养基中，仅添加0.5‑10μg/mL的Akt激活剂SC79，即能明显提升HBsAg重组蛋白的表达量，相比于不添加Akt激活剂SC79和香草酸、三磷酸肌醇的培养体系，在诱导蛋白生产周期结束时，可将重组HEK293细胞活率提高1.83倍，且HBsAg重组蛋白的表达量至少提高了181.8%，而相比于不添加Akt激活剂SC79但含有香草酸、三磷酸肌醇的培养体系，重组HEK293细胞活率也得到了大幅度地提升，且HBsAg重组蛋白的表达量至少提高了118.2%，证明了Akt激活剂SC79对于HEK293细胞生长活率及高效表达HBsAg基因具有重要影响。可能的原因是，Akt激活剂SC79通过激活Akt信号通路，增强了细胞活性，促进HEK293细胞中的蛋白质合成，从而提高HBsAg重组蛋白的表达，以及促进蛋白质分子在合成过程中的正确折叠和定位，进而提高HEK293细胞对重组蛋白的转运及分泌能力；Akt激活剂SC79还可能通过调节Akt的核转位以及与转录因子的相互作用，从而间接影响HEK293细胞中HBsAg重组蛋白的转录和表达；Akt激活剂SC79对HEK293细胞具有一定的保护作用，抑制细胞凋亡和程序性坏死，进而维持HEK293细胞活力，提高存活率，并促进HEK293细胞增殖。

[0015] 发明人还发现，在基础培养基中引入香草酸、三磷酸肌醇复配的第二激活剂，对于HEK293细胞表达HBsAg重组蛋白也具有诱导和增效作用。究其原因是，一方面，香草酸可作为抗氧化剂应用于培养基中，有效清除培养基体系的自由基含量，抑制HEK293细胞的氧化应激作用，使HEK293细胞及DNA免受氧化性损伤，进而保护HEK293细胞、调控细胞活力，另一方面，香草酸还可能通过激活细胞信号转导途径、调节转录因子活性等，以此正向调控HEK293细胞中HBsAg基因的表达；而三磷酸肌醇是调控细胞内钙离子通道的重要信号分子，影响HEK293细胞对HBsAg重组蛋白转运及分泌，进而间接影响HEK293细胞对重组蛋白的表达能力。

附图说明

[0016] 为了更清楚地说明本发明或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0017] 图1为本发明激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法流程图；

[0018] 图2为实施例1‑4及对比例1‑5及空白对照组在低温诱导培养过程中的细胞活率曲线；

[0019] 图3为实施例1‑4及对比例1‑5及空白对照组所得培养液上清液的HBsAg重组蛋白表达量柱形图；

[0020] 图4为实施例1‑4及对比例1‑5所得培养液上清液的SDS‑PAGE电泳图；其中，M表示蛋白标准品；实1‑4依次表示实施例1‑4所得培养液上清液；对1‑5依次表示对比例1‑5所得培养液上清液。

具体实施方式

[0021] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本发明进一步详细说明。

[0022] 需要说明的是，除非另外定义，本发明使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本发明中使用的“第一”、“第二”以及类似的词语并不表示任何顺序、数量或者重要性，而只是用来区分不同的组成部分。“包括”或者“包含”等类似的词语意指出现该词前面的组分涵盖出现在该词后面列举的组分及其等同，而不排除其他组分。

[0023] 本发明下列实施例所选用的重组HEK293细胞为包含乙肝表面抗原序列的表达载体转染HEK293细胞，构建方法依据“公告号为CN113621577B的发明专利：人源化HEK293细胞系表达重组蛋白用培养基添加剂、重组乙肝疫苗、表达方法”，在构建过程中，所选用的启动子具体为CAG 增强子(GenBank:

[0024] AJ575208.1)，构建正确的质粒命名为pIRES‑CAGen、构建的含HBsAg基因重组表达载体命名为pIRES‑CAGen‑HBsAg。具体包括以下步骤：

[0025] S1：EGFP重组表达载体pIRES‑EGFP的构建：

[0026] S101：PCR扩增EGFP基因：参照pEGFP‑C1载体的EGFP基因序列(GenBank：U55763.1，第613‑1332位碱基)设计引物P1和P2(用于扩增720bp的EGFP基因DNA)，引物的5′端分别引入EcoRV、NheI酶切位点；

[0027] 以pEGFP‑C1质粒为模板，使用引物P1（其序列如CN113621577B发明专利中序列2所示）、P2（其序列如CN113621577B发明专利中序列3所示）扩增EGFP基因，PCR扩增体系如表1所示：

[0028] 表1

[0029] PCR反应体系 试剂浓度 终浓度 体积（μL）10×PCR缓冲液 10× 1× 2.5
引物P1 10μM 0.4μM 1.0
引物P2 10μM 0.4μM 1.0
dNTP 25μM 200μM 2.0
模板DNA 100ng/μL 4.0ng/μL 1.0
Taq酶 5U/μL 0.1U/μL 0.5
ddH2O ‑ ‑ 17

[0030] 反应程序：95℃ 3min，94℃ 40s，56‑60℃ 30s，72℃ 40s，每个退火温度4个循环，最后55℃ 1min，30个循环，72℃ 3min；

[0031] S102：构建含EGFP序列的表达载体：

[0032] 用EcoRV、NheI双酶切EGFP的PCR扩增产物(经测序验证正确的序列)，同时用EcoRV、NheI双酶切pIRES‑Neo质粒；琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的EGFP序列片段和pIRES‑Neo线性质粒DNA；

[0033] EGFP的PCR扩增产物的酶切体系为：1μL 10×NEB缓冲液 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.3μg/μL EGFP扩增产物0.78μL，补足水至20μL，充分混匀后，37℃孵育6h；

[0034] pIRES‑Neo质粒的酶切体系为：1μL 10×NEB缓冲液 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.0μL质粒pIRES‑Neo(1.0μg/μL)，补足水至20μL，充分混匀后，37℃孵育3h；

[0035] 取酶切后的EGFP序列片段和pIRES‑Neo线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×快速连接缓冲液10μL，pIRES‑Neo线性质粒DNA 200ng，酶切后的EGFP序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜；

[0036] 将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌培养；提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES‑EGFP，即为所需构建的EGFP重组表达载体；

[0037] S2：含CAG启动子表达载体的构建：选用CAG增强子(GenBank:AJ57

[0038] 208.1)作为启动子片段，并采用无缝克隆技术替换pIRES‑EGFP上原有的启动子，构建正确的质粒，命名为pIRES‑CAGen；

[0039] S3：含HBsAg基因重组表达载体的构建：人工合成HBsAg（乙肝表面抗原）基因序列（其序列如CN113621577B发明专利中序列1所示），并在基因的5′端分别引入EcoRV、NheI酶切位点；

[0040] 用EcoRV、NheI双酶切合成HBsAg基因片段，同时用EcoRV、NheI双酶切pIRES‑CAGen；琼脂糖凝胶电泳鉴定酶切结果，凝胶回收酶切后的HBsAg基因序列片段和线性质粒DNA；

[0041] HBsAg基因片段的酶切体系为：1μL 10×NEB缓冲液 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.3μg/μL HBsAg基因片段0.78μL，补足水至20μL，充分混匀后，37℃孵育6h；

[0042] 质粒的酶切体系为：1μL 10×NEB缓冲液 2.1，10U/μL EcoRV、NheI酶各0.5μL，1.0μL质粒(1.0μg/μL)，补足水至20μL，充分混匀后，37℃孵育3h；

[0043] 取酶切后的HBsAg基因片段序列片段和线性质粒DNA，用T4连接酶进行连接(连接体系为：2×快速连接缓冲液 10μL，线性质粒DNA 200ng，酶切后的HBsAg基因片段序列片段87.2ng，350U/μL T4连接酶1μL，补足水至20μL)，16℃连接过夜；

[0044] 将连接产物加入E.coli JM109感受态细菌悬液中转化，取100μL转化菌液接种在含有氨苄青霉素的LB固体培养板上，37℃培养过夜，挑取单菌落摇菌培养；提取细菌质粒并进行重组质粒的酶切验证，选取酶切鉴定正确的质粒，进行测序验证，将目的基因序列完全正确的载体命名为pIRES‑CAGen‑HBsAg；

[0045] S4：细胞转染：用含10%胎牛血清的DMEM高糖完全培养基培养HEK293细胞，次日细胞融合度达到80 90％，得含HEK293细胞培养基；取1个新灭菌的1.5mL EP管，加入用DMEM高~糖培养基(不含血清)稀释的Lipofectamine® 3000，并加入pIRES‑CAGen‑HBsAg载体质粒，且每1μL质粒(1.0μg/μL)各需要25μL的DMEM高糖培养基及1μL的Lipofectamine® 3000，使其充分吹打混匀，再滴加至含HEK293细胞培养基中，进行细胞转染，转染48h后，用PBS缓冲液洗去死细胞以及不贴壁的细胞，获得重组HEK293细胞。

[0046] 本发明提供一实施例的激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：

[0047] S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+0.5‑10μg/mL第一激活剂+0.1‑0.25mg/mL第二激活剂+0.1‑0.5mg/mL蛋白保护剂；

[0048] 其中，基础培养基配方为：DMEM/F12培养基+10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸（HEPES）+100ng/mL胰岛素样生长因子1（IGF‑1）+10ng/mL 白血病抑制因子（LIf）+100μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯（VC磷酸酯）+100nM皮质醇+1mM N‑乙酰半胱胺酸（NAC）；

[0049] 第一激活剂为Akt激活剂SC79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按(0.2‑0.35):1的质量比混合而成；

[0050] 蛋白保护剂为甘露醇、山梨醇、海藻糖中的一种；

[0051] S2：按0.6×106‑1.4×106 cells/mL的接种密度将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%CO2、100‑160rpm的摇床培养箱中，悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d，离心获取上清液，并用ELISA试剂盒检测上清液中蛋白产量。

[0052] 该实施例以Akt激活剂SC79为第一激活剂，以香草酸、三磷酸肌醇复配第二激活剂，二者协同提高HEK293细胞对于HBsAg基因的表达水平及重组蛋白的表达量。可能的原因是，Akt激活剂SC79通过激活Akt信号通路，增强了细胞活性，促进HEK293细胞中的蛋白质合成，从而提高HBsAg重组蛋白的表达，以及促进蛋白质分子在合成过程中的正确折叠和定位，进而提高HEK293细胞对重组蛋白的转运及分泌能力；Akt激活剂SC79还可能通过调节Akt的核转位以及与转录因子的相互作用，从而间接影响HEK293细胞中HBsAg重组蛋白的转录和表达；Akt激活剂SC79对HEK293细胞具有一定的保护作用，抑制细胞凋亡和程序性坏死，进而维持HEK293细胞活力，提高存活率，并促进HEK293细胞增殖。同时，香草酸、三磷酸肌醇复配的第二激活剂，对于HEK293细胞表达HBsAg重组蛋白也具有诱导和增效作用。究其原因是，一方面，香草酸可作为抗氧化剂应用于培养基中，有效清除培养基体系的自由基含量，抑制HEK293细胞的氧化应激作用，使HEK293细胞及DNA免受氧化性损伤，进而保护HEK293细胞、调控细胞活力，另一方面，香草酸还可能通过激活细胞信号转导途径、调节转录因子活性等，以此正向调控HEK293细胞中HBsAg基因的表达；而三磷酸肌醇是调控细胞内钙离子通道的重要信号分子，影响HEK293细胞对HBsAg重组蛋白转运及分泌，进而间接影响HEK293细胞对重组蛋白的表达能力。实施例1

[0053] 一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：

[0054] S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+0.5μg/mL第一激活剂+0.1mg/mL第二激活剂+0.1mg/mL蛋白保护剂甘露醇；

[0055] 其中，基础培养基配方为：DMEM/F12培养基+10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸+100ng/mL 胰岛素样生长因子1+10ng/mL 白血病抑制因子+100μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯+100nM皮质醇+1mM N‑乙酰半胱胺酸；

[0056] 第一激活剂为Akt激活剂SC79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按0.2:1的质量比混合而成；

[0057] S2：按0.6×106 cells/mL的接种密度将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%CO2、100rpm的摇床培养箱中悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。实施例2

[0058] 一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：

[0059] S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+1.0μg/mL第一激活剂+0.15mg/mL第二激活剂+0.2mg/mL蛋白保护剂山梨醇；

[0060] 其中，基础培养基配方为：DMEM/F12培养基+10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸+100ng/mL胰岛素样生长因子1+10ng/mL白血病抑制因子 +100μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯+100nM皮质醇+1mM N‑乙酰半胱胺酸；

[0061] 第一激活剂为Akt激活剂SC79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按0.25:1的质量比混合而成；

[0062] S2：按0.8×106 cells/mL的接种密度将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%CO2、120rpm的摇床培养箱中悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。实施例3

[0063] 一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：

[0064] S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+5.0μg/mL第一激活剂+0.2mg/mL第二激活剂+0.35mg/mL蛋白保护剂海藻糖；

[0065] 其中，基础培养基配方为：DMEM/F12培养基+10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸+100ng/mL胰岛素样生长因子1+10ng/mL 白血病抑制因子+100μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯+100nM皮质醇+1mM N‑乙酰半胱胺酸；

[0066] 第一激活剂为Akt激活剂SC79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按0.3:1的质量比混合而成；

[0067] S2：按1.1×106 cells/mL的接种密度将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%CO2、140rpm的摇床培养箱中悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。实施例4

[0068] 一种激活剂促进HEK293细胞蛋白产量提高的方法，包括以下步骤：

[0069] S1：配制HEK293细胞专用培养基：基础培养基+10μg/mL第一激活剂+0.25mg/mL第二激活剂+0.5mg/mL蛋白保护剂甘露醇；

[0070] 其中，基础培养基配方为：DMEM/F12培养基+10mM 4‑羟乙基哌嗪乙磺酸+100ng/mL 胰岛素样生长因子1+10ng/mL 白血病抑制因子 +100μM L‑抗坏血酸‑2‑磷酸酯+100nM皮质醇+1mM N‑乙酰半胱胺酸；

[0071] 第一激活剂为Akt激活剂SC79；第二激活剂由香草酸、三磷酸肌醇按0.35:1的质量比混合而成；

[0072] S2：按1.4×106 cells/mL的接种密度将重组HEK293细胞接种至HEK293细胞专用培养基中，并置于37℃、5%CO2、160rpm的摇床培养箱中悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。

[0073] 对比例1与实施例1相同，区别在于：HEK293细胞专用培养基中不含第一激活剂Akt激活剂SC79。

[0074] 对比例2与实施例1相同，区别在于：以表皮生长因子EGF代替第一激活剂Akt激活剂SC79。

[0075] 对比例3与实施例1相同，区别在于：HEK293细胞专用培养基中不含第二激活剂。

[0076] 对比例4与实施例1相同，区别在于：第二激活剂中不含香草酸，仅为三磷酸肌醇。

[0077] 对比例5与实施例1相同，区别在于：第二激活剂中不含三磷酸肌醇，仅为香草酸。

[0078] 空白对照组：按0.6×106 cells/mL的接种密度将重组HEK293细胞接种至基础培养基中，并置于37℃、5%CO2、150rpm的摇床培养箱中悬浮培养24h后，再将培养温度降至32℃，低温诱导培养6d。

[0079] 分别统计实施例1‑4、对比例1‑5、空白对照组在低温诱导培养的6天中细胞活率，细胞活率通过细胞计数仪Countstar检测获得，检测结果见图2：各实验组别的培养基所培养的HEK 293细胞活率在生长过程中总体呈下降趋势，与蛋白产量趋势呈负相关，不过相较于空白对照组，添加了第一激活剂Akt激活剂SC79与第二激活剂香草酸+三磷酸肌醇的实施例1‑4在诱导蛋白生产过程中细胞活率更高，其中，以实施例4的HEK293细胞活率最高，在为期6天的低温诱导培养过程中，细胞活率下降趋势较缓，在生产周期结束时，HEK293细胞活率仍为空白对照组的1.83倍，其他实施例相对于空白对照组亦有不同程度地提高。这表明，在添加了第一激活剂Akt激活剂SC79与第二激活剂香草酸+三磷酸肌醇的基础上，能大幅提高重组HEK293细胞在蛋白生产的细胞活率，其中，以基础培养基+第一激活剂10μg/mL+第二激活剂0.25mg/mL+蛋白保护剂甘露醇0.5mg/mL效果最佳。

[0080] 分别收集实施例1‑4、对比例1‑5、空白对照组所得培养液，离心获取上清液，并用ELISA试剂盒检测各上清液中的HBsAg重组蛋白表达量，并根据100%×（试验组HBsAg重组蛋白表达量‑空白对照组HBsAg重组蛋白表达量）/空白对照组HBsAg重组蛋白表达量计算重组蛋白表达提高率，试验结果如表2所示：

[0081] 表2

[0082]组别 HBsAg重组蛋白表达量/mg/L 重组蛋白表达提高率/%
实施例1 93 181.8
实施例2 101 206.1
实施例3 115 248.5
实施例4 142 330.3
对比例1 54 63.6
对比例2 79 139.4
对比例3 62 87.9
对比例4 74 124.2
对比例5 81 145.5
空白对照组 33 ‑

[0083] 结合表2及图3‑4可知，相比于对比例1‑5，实施例1‑4明显提升了HEK293细胞对于HBsAg基因的表达水平及重组蛋白的表达量。通过对比实施例1‑4和对比例1数据可知，在基础培养基中，仅添加0.5‑10μg/mL的Akt激活剂SC79，即能明显提升HBsAg重组蛋白的表达量，相比于不添加Akt激活剂SC79的培养体系，HBsAg重组蛋白的表达量提高了118.2‑266.7%。通过对比实施例1和对比例1、对比例3数据可知，第一激活剂Akt激活剂SC79与第二激活剂香草酸+三磷酸肌醇协同提高了HEK293细胞对于HBsAg基因的表达水平及蛋白的表达量，且Akt激活剂SC79对于HEK293细胞表达重组蛋白的影响程度高于香草酸及三磷酸肌醇；此外，通过对比实施例1、对比例2数据可知，在其他条件相同的情况下，相比于对比例2的表皮生长因子EGF，实施例1选择Akt激活剂SC79作为第一激活剂能明显提高HBsAg重组蛋白的表达量，进一步说明了SC79的特定性选择对于HEK293细胞高效重组蛋白具有关键性影响；通过比较对比例3‑5数据可知，香草酸和三磷酸肌醇联合促进HEK293细胞表达HBsAg重组蛋白，具有一定的协同诱导作用。

[0084] 所属领域的普通技术人员应当理解：以上任何实施例的讨论仅为示例性的，并非旨在暗示本发明的范围（包括权利要求）被限于这些例子；在本发明的思路下，以上实施例或者不同实施例中的技术特征之间也可以进行组合，步骤可以以任意顺序实现，并存在如上所述的本发明的不同方面的许多其它变化，为了简明它们没有在细节中提供。

[0085] 本发明旨在涵盖落入所附权利要求的宽泛范围之内的所有这样的替换、修改和变型。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何省略、修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。