本发明公开了抗幽门杆菌UreA蛋白的单克隆抗体及其应用，具体涉及抗UreA蛋白的单克隆抗体或其抗原结合片段，所述单克隆抗体或其抗原结合片段包括SEQ ID NO:1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO:2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO:3所示的重链可变区CDR3，SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：10所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3。本发明还提供了编码所述单克隆抗体或其抗原结合片段的核苷酸分子、载体、宿主细胞、方法及应用。
1.一种抗幽门杆菌UreA蛋白的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体包括单克隆抗体7G8；
所述单克隆抗体7G8包含：SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3、SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：10所示的轻链可变区CDR2、和SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3。
2.根据权利要求1所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体7G8还包含具有与SEQ ID NO：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90%序列一致性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及具有与SEQ ID NO：12、13、14、15所示氨基酸序列至少90%序列一致性的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
3.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体7G8重链可变区具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少90%序列一致性。
4.根据权利要求3所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体7G8重链可变区具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少95%序列一致性。
5.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列至少90%序列一致性。
6.根据权利要求5所述的单克隆抗体，其特征在于，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：
7.根据权利要求1或2所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
8.根据权利要求7所述的单克隆抗体，其特征在于，所述单克隆抗体可以是无岩藻糖基化的抗体，或部分无岩藻糖基化的抗体。
9.核酸分子，所述核酸分子编码权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体。
10.重组表达载体，所述重组表达载体包含权利要求9中所述的核酸分子。
11.根据权利要求10所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体包括腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、DNA载体、mRNA载体。
12.根据权利要求11所述的重组表达载体，其特征在于，所述DNA载体包括质粒、基于转座子的载体或人工染色体，所述质粒包括真核细胞表达载体。
13.改造的宿主细胞，所述改造的宿主细胞包含权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体，或权利要求9所述的核酸分子、权利要求10‑12任一项所述的重组表达载体。
14.根据权利要求13所述的改造的宿主细胞，其特征在于，所述改造的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
15.根据权利要求14所述的改造的宿主细胞，其特征在于，所述原核细胞包括细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
16.根据权利要求15所述的改造的宿主细胞，其特征在于，所述细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。
17.根据权利要求14所述的改造的宿主细胞，其特征在于，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、除蓝藻外植物细胞、真菌细胞。
18.根据权利要求17所述的改造的宿主细胞，其特征在于，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞。
19.根据权利要求13所述的改造的宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞包括杂交瘤细胞。
20.抗体偶联物，所述抗体偶联物包含权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体直接或间接的偶联到可检测标记物形成的复合物。
21.一种检测幽门杆菌的产品，所述产品包含权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10‑12任一项所述的重组表达载体、权利要求13‑19任一项所述的改造的宿主细胞或权利要求20所述的抗体偶联物。
22.根据权利要求21所述的产品，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、或芯片。
23.组合物，所述组合物包括权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体，权利要求9所述的核酸分子、权利要求10‑12任一项所述的重组表达载体、权利要求13‑19任一项所述的改造的宿主细胞。
24.一种生产权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体的方法，其特征在于，该方法包括如下步骤：a）提供权利要求9所述的核酸分子或权利要求10‑12任一项所述的重组表达载体；
d）在宿主细胞培养液中分离纯化获得权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体。
25.一种制备权利要求13‑19任一项所述的改造的宿主细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：将权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体，权利要求9所述的核酸分子，或权利要求10‑12任一项所述的重组表达载体导入到宿主细胞中。
26.权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10‑
12任一项所述的重组表达载体、权利要求13‑19任一项所述的改造的宿主细胞在制备诊断幽门杆菌感染的产品中的应用。
27.权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10‑
12任一项所述的重组表达载体、权利要求13‑19任一项所述的改造的宿主细胞在制备预防或治疗幽门杆菌感染的药物中的应用。
28.权利要求1‑8任一项所述的单克隆抗体、权利要求9所述的核酸分子、权利要求10‑
12任一项所述的重组表达载体、权利要求13‑19任一项所述的改造的宿主细胞在制备调节幽门杆菌蛋白活性或水平的药物中的应用。
抗幽门杆菌UreA蛋白的单克隆抗体及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于生物技术领域，涉及抗幽门杆菌UreA蛋白的单克隆抗体及其应用。
背景技术
[0002] 螺旋菌是细菌界，ε‑变形菌纲，弯曲菌目，弯曲菌科的一种菌类。又称幽门螺杆菌、幽门螺旋菌。幽门螺旋菌简称HP(Helicobocton Pyloni)，此种菌类是由瑞典学者首先从人胃粘膜标本培养中发现的，也是近年来国内研究的热题。2017年10月27日，世界卫生组织首次将幽门螺旋杆菌收录在一类致癌物清单中。
[0003] 幽门螺旋菌是一种在胃黏膜上发现的革兰氏阴性螺旋杆菌，生长在微氧环境，氧化酶和过氧化氢酶阳性，有光滑的细胞壁及1‑5根鞭毛，后者套入鞘内且末端呈球状。螺旋菌感染主要是指幽门螺杆菌(Helicobacter pylori，Hp)感染。幽门螺杆菌为革兰染色阴性，菌体呈弧形、S形或螺旋形，有鞭毛，运动活泼，无芽胞。该菌对外界环境的抵抗力不强，对干燥和热均很敏感。各种常用的消毒剂很容易将之杀灭。幽门螺杆菌的致病性与它产生的毒素、有毒性作用的酶破坏胃黏膜和促使机体产生炎症和免疫反应等因素有关。幽门螺杆菌感染可引发炎症和免疫反应，在其感染的胃黏膜中可见细胞变性、坏死和炎细胞浸润，血清中可检测到特异性抗体。幽门螺杆菌与胃炎、消化性溃疡、胃癌、胃黏膜相关性淋巴样组织淋巴瘤(MALT淋巴瘤)、非甾体类抗炎药物相关性胃病功能性消化不良和胃食管反流病等多种疾病有关。
发明内容
[0004] 为了解决上述现实世界存在的技术问题，本发明的目的在于提供一种抗幽门杆菌UreA蛋白的单克隆抗体。
[0005] 本发明的第一方面提供了一种抗幽门杆菌UreA蛋白的单克隆抗体，所述单克隆抗体包括单克隆抗体7G8。
[0006] 所述单克隆抗体7G8包含：SEQ ID NO：1所示的重链可变区CDR1、SEQ ID NO：2所示的重链可变区CDR2、SEQ ID NO：3所示的重链可变区CDR3、SEQ ID NO：9所示的轻链可变区CDR1、SEQ ID NO：10所示的轻链可变区CDR2、SEQ ID NO：11所示的轻链可变区CDR3。
[0007] 在某些实施例中，本发明提供的抗体和其功能片段在CDR序列中的一或多个中包含一或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变体在CDR序列中包含总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
[0008] 进一步，所述单克隆抗体7G8还包含具有与SEQ ID NO：4、5、6、7所示氨基酸序列至少90％序列一致性的重链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4，以及具有与SEQ ID NO：12、13、14、15所示氨基酸序列至少90％序列一致性的轻链可变区框架区FR1、FR2、FR3、FR4。
[0009] 在某些实施例中，本发明提供的抗体和其功能片段在FR序列中的一或多个中包含一或多个氨基酸残基取代。在某些实施例中，亲和力变体在FR序列中包含总共不超过20、15、10、9、8、7、6、5、4、3、2或1个取代。
[0010] 进一步，所述单克隆抗体7G8重链可变区具有与SEQ ID NO：8所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的重链可变区，所述轻链可变区具有与SEQ ID NO：16所示的氨基酸序列至少90％序列一致性，优选95％序列一致性的轻链可变区。
[0011] 在某一具体的实施方案中，所述单克隆抗体7G8的重链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列；所述单克隆抗体7G8的轻链可变区具有SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列。
[0012] 进一步，所述单克隆抗体进一步包含重链恒定区和轻链恒定区。
[0013] 术语“抗体”包括是指免疫球蛋白分子和免疫球蛋白(Ig)分子的抗原结合部分，即，含有特异性结合抗原(与其免疫反应)的抗原结合位点的分子。“特异性结合”或“与…免疫反应”或“免疫特异性结合”意指抗体与所需抗原的一个或多个抗原决定簇反应和不与其‑6他多肽反应或以低得多的亲和力结合(Kd>10 )。抗体包括但不限于多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、全人抗体、结构域抗体、单链、Fab和F(ab')2片段、scFv和Fab表达文库。
[0014] 进一步，所述单克隆抗体可以是无岩藻糖基化的抗体，或部分无岩藻糖基化的抗体。
[0015] 在某些具体的实施方案中，所述单克隆抗体还包含免疫球蛋白恒定区，其任选地为重链和/或轻链恒定区。在某些具体的实施方案中，所述重链恒定区包括CH1、铰链和/或CH2‑CH3区(或任选地CH2‑CH3‑CH4区)。本发明提供的单克隆抗体的免疫球蛋白恒定区与野生型免疫球蛋白恒定区一致、相差一个突变、或相差多个突变。
[0016] 本发明的第二方面提供了一种核酸分子，所述核酸分子编码前面所述的单克隆抗体或其功能片段。
[0017] 进一步，所述单克隆抗体的功能片段包括核酸功能片段或氨基酸功能片段。
[0018] 进一步，所述核酸功能片段还包括抗体能够发挥功能的氨基酸片段的相对应核酸片段，包括RNA与DNA片段，包括但不限于mRNA、tRNA、rRNA、snRNA、hRNA、反义RNA、tCRNA、dsRNA、SCRNA、具有催化活性的RNA、各种病毒RNA、单链DNA、闭环DNA、连接DNA等。
[0019] 本发明的第三方面提供了一种重组表达载体，所述重组表达载体包含前面所述的核酸分子。
[0020] 进一步，所述重组表达载体包括慢病毒载体、腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、逆转录病毒载体、质粒、DNA载体、mRNA载体、基于转座子的载体或人工染色体。
[0021] 进一步，所述质粒包括真核细胞表达载体。
[0022] 术语“载体”是指可以被工程化的含有可以在宿主细胞中扩增克隆的一种多核苷酸或多种多核苷酸的核酸分子。载体包括但不限于：单链，双链或部分双链的核酸分子；包含一个或多个游离末端，没有游离末端(例如环状)的核酸分子；包含DNA，RNA或两者的核酸分子；以及本领域已知的其他多核苷酸种类。一种类型的载体是“质粒”，其是指可以插入额外DNA片段的环状双链DNA环。某些载体能够在引入它们的宿主细胞中自主复制。其他载体在引入宿主细胞后整合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。
[0023] 本发明的第四方面提供了一种改造的宿主细胞，所述改造的宿主细胞包含前面所述的单克隆抗体或其功能片段，或前面所述的核酸分子、前面所述的重组表达载体。
[0024] 进一步，所述改造的宿主细胞包括原核细胞或真核细胞。
[0025] 进一步，所述原核细胞包括细菌、放线菌、蓝细菌、支原体、衣原体、立克次氏体。
[0026] 进一步，所述细菌包括革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌。
[0027] 进一步，所述真核细胞包括哺乳动物细胞、昆虫细胞、除蓝藻外植物细胞、真菌细胞、酵母细胞。
[0028] 进一步，所述哺乳动物细胞包括成纤维细胞、淋巴细胞、上皮细胞、成髓细胞。
[0029] 进一步，所述宿主细胞包括杂交瘤细胞。
[0030] 术语“宿主细胞”指原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；细菌细胞如鼠伤寒沙门氏菌；真菌细胞如酵母；植物细胞；昆虫细胞如果蝇S2或Sf9；动物细胞如CHO、COS或Bowes黑素瘤细胞等。
[0031] 本发明的第五方面提供了一种抗体偶联物，所述抗体偶联物包含前面所述的单克隆抗体或其功能片段直接或间接的偶联到可检测标记物形成的复合物。
[0032] 如本文所用，术语“可检测标记物”是指任何部分，该部分通过与该部分偶联的分子状态的光学、电学或其它物理指标的改变生成可测定信号。此类物理指标包括光谱、光化学、生物化学、免疫化学、电磁、放射化学和化学手段，例如但不限于荧光、化学荧光和化学发光等。在关于经标记的检测剂使用时，“直接标记物”是通过任何手段附着至检测剂的可检测标记物。在关于经标记的检测剂使用时，“间接标记物”是特异性结合检测剂的可检测标记物。因此，间接标记物包括下述部分：其是检测剂部分的特异性结合伴侣。生物素和亲和素是所采用的此类部分的实例，其例如通过使生物素化抗体与经标记的亲和素接触以产生间接标记的抗体来应用。
[0033] 进一步，所述单克隆抗体的功能片段还包括核酸类功能片段，所述核酸类功能片段可以结合编码抗原幽门杆菌的核酸分子。
[0034] 本发明的第六方面提供了一种检测幽门杆菌的产品，所述产品包含前面所述的单克隆抗体或其功能片段、前面所述的核酸分子、前面所述的重组表达载体、前面所述的改造的宿主细胞或前面所述的抗体偶联物。
[0035] 进一步，所述产品包括试剂盒、试纸、核酸膜条、或芯片。
[0036] 本发明的第七方面提供了一种组合物，所述组合物包括前面所述的单克隆抗体或其功能片段，前面所述的核酸分子、前面所述的重组表达载体、前面所述的改造的宿主细胞。
[0037] 本发明的第八方面提供了一种生产前面所述的单克隆抗体的方法，该方法包括如下步骤：
[0038] a)提供前面所述的核酸分子或前面所述的重组表达载体；
[0039] b)用步骤a)所述的物质转化宿主细胞；
[0040] c)在适合条件下培养步骤b)所得的宿主细胞；
[0041] d)在宿主细胞培养液中分离纯化获得前面所述的单克隆抗体。
[0042] 本发明的第九方面提供了一种非诊断和非治疗目的地检测待测样品中幽门杆菌蛋白或编码其的核酸分子的方法，所述方法包括如下步骤：将待测样品与前面所述的单克隆抗体或其功能片段，或将待测样品与前面所述的抗体偶联物接触；检测幽门杆菌蛋白或编码其的核酸分子与前面所述的单克隆抗体，或前面所述的抗体偶联物的复合物的形成。
[0043] 本发明的第十方面提供了一种制备前面所述的改造的宿主细胞的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的单克隆抗体或其功能片段，前面所述的核酸分子，或前面所述的重组表达载体导入到宿主细胞中。
[0044] 本发明的第十一方面提供了一种特异性地抑制幽门杆菌的方法，所述方法包括如下步骤：将前面所述的单克隆抗体或其功能片段，或前面所述的核酸分子，或前面所述的重组表达载体导入到生物体细胞中，通过表达前面所述的单克隆抗体或其功能片段抑制幽门杆菌蛋白的活性。
[0045] 术语“幽门杆菌”是指幽门螺旋菌，是一种在胃黏膜上发现的革兰氏阴性螺旋杆菌，生长在微氧环境，氧化酶和过氧化氢酶阳性，有光滑的细胞壁及1‑5根鞭毛，后者套入鞘内且末端呈球状。螺旋菌是一类革兰氏阴性菌，呈螺旋状，身体细而长，为5‑50μm。它们极其活跃，呈螺旋状移动。螺旋菌可分为好氧、绝对厌氧、厌氧三类。它们通常在废水或废水样品处于有氧和无氧间的过渡状态时繁殖。该种菌类具有高度多样性。虽然有些螺旋体是致病的，如导致梅毒的病原体，但大多数都是自生生活于土壤中的。它们通过流入物和渗入物进入活性污泥工艺中
[0046] 本发明的第十二方面提供了前面所述的单克隆抗体或其功能片段、前面所述的核酸分子、前面所述的重组表达载体、前面所述的改造的宿主细胞，或前面所述的抗体偶联物在检测幽门杆菌UreA蛋白或其片段中的应用。
[0047] 进一步，所述幽门杆菌UreA蛋白或其片段包括UreA蛋白、UreA蛋白片段、编码UreA蛋白的核酸分子、编码UreA蛋白片段的核酸分子。
[0048] 本发明的第十三方面提供了前面所述的单克隆抗体或其功能片段、前面所述的核酸分子、前面所述的重组表达载体、前面所述的改造的宿主细胞在制备诊断幽门杆菌感染的产品中的应用。
[0049] 本发明的第十四方面提供了前面所述的单克隆抗体或其功能片段、前面所述的核酸分子、前面所述的重组表达载体、前面所述的改造的宿主细胞在制备预防或治疗幽门杆菌感染的药物中的应用。
[0050] 本发明的第十五方面提供了前面所述的单克隆抗体或其功能片段、前面所述的核酸分子、前面所述的重组表达载体、前面所述的改造的宿主细胞在制备调节幽门杆菌蛋白活性或水平的药物中的应用。
附图说明
[0051] 图1是检测单克隆抗体7G8的电泳结果图；
[0052] 图2是检测单克隆抗体7G8的HPLC结果图；
[0053] 图3是ELISA检测单克隆抗体7G8的结合活性结果图。
具体实施方式
[0054] 在描述本发明方法之前，应当理解本发明不限于所描述的具体方法和实验条件，因为此类方法和条件可以变化。还应理解，本发明所使用的术语仅出于描述具体实施例的目的，而不旨在是限制性的，因为本发明的范围仅受所附权利要求限制。
[0055] 实施例1单克隆抗体的筛选
[0056] 1、免疫原重组表达
[0057] 合成幽门杆菌UreA蛋白序列，构建至pEM5.1载体；抽提转染用质粒；转染至HEK293细胞，培养细胞7天；收获上清，Ni柱纯化，经过浓缩置换缓冲液，得到重组幽门杆菌UreA蛋白，重组幽门杆菌UreA蛋白序列来源Uniprot。序列如SEQ ID NO:17所示，具体见表1。
[0058] 表1重组幽门杆菌UreA蛋白序列
[0059]
[0060] 2、免疫
[0061] 第一次用福氏完全佐剂，每只100μg,腹腔注射，总剂量0.5ml/只，间隔3周进行第二次免疫；第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为50μg/0.5ml/只，间隔2周进行第三次免疫；第三次注射后10天准备细胞融合；
[0062] 取饲养细胞，可按105/孔使用，于融合前一天铺板105个/100μl/孔；取小鼠免疫脾细胞与准备好的骨髓瘤细胞用融合剂PEG进行融合，铺入已经加入饲养细胞的96细胞培养板，100μl/孔。
[0063] 3、杂交瘤细胞的筛选和克隆
[0064] 通过ELISA检测方法进行阳性孔筛选，铺重组幽门杆菌UreA蛋白过夜；洗板，加脱脂奶粉封闭，37℃，1h；洗板，加入100μl 96孔培养液上清，37℃，孵育1h；洗板，加入HRP标记羊抗鼠二抗，37℃，孵育30min；洗板，加入显色液，显色10min，加入终止液，读取OD450的数值；筛选高表达量细胞株进行亚克隆。
[0065] 4、序列钓取
[0066] 收集细胞，采用Trizol抽提总RNA，用oligo(dT)20为引物，逆转录生成cDNA。然后利用特异性引物PCR分别扩增其重、轻链可变区基因。PCR产物经电泳纯化后，通过TA克隆插入载体，进行转化，挑选阳性克隆送测序。
[0067] 5、实验结果
[0068] 筛选出靶向幽门杆菌UreA蛋白的抗幽门杆菌UreA蛋白的单克隆抗体7G8，序列如表2所示。
[0069] 表2单克隆抗体7G8的氨基酸序列
[0070]
[0071] 实施例2单克隆抗体7G8的功能性研究
[0072] 1、单克隆抗体的表达和纯化
[0073] (1)对筛选出的序列进行化学合成，并克隆至真核表达载体中。
[0074] (2)对质粒进行扩增并提取质粒。
[0075] (3)将编码抗体的质粒瞬时转染进入哺乳动物细胞HEK293。
[0076] (4)收集上清，利用亲和层析方法，纯化获得单克隆抗体。
[0077] (5)结果显示，纯化后的单克隆表达量是232mg/L。
[0078] 2、单克隆抗体的理化性质检测
[0079] (1)凝胶电泳检测
[0080] A、样品制备
[0081] 取20μL的样品与5μL的5×还原buffer混合均匀，在95℃中加热5min，冷却；取20μL的样品与5μL的5×非还原buffer混合均匀。
[0082] B、电泳
[0083] 配置胶，加适量的电泳缓冲液，加样，进行电泳。
[0084] C、染色与脱色
[0085] 电泳结束后，取凝胶放入适量考马斯亮蓝染色液中，室温染色1h或更长时间；倒出染色液，加入适量考马斯亮蓝染色脱色液，室温脱色4‑24h。完成脱色后，用ddH2O浸泡，参照Marker蛋白，与未染色凝胶对比，切下所需蛋白成分的凝胶，收集起来。然后把所要提纯的蛋白从凝胶中分离出来。
[0086] 3、实验结果
[0087] 结果如图1所示，从左至右条带分别是marker、还原条带；电泳结果图显示单克隆抗体7G8表达成功。
[0088] (2)HPLC检测单克隆抗体的纯度
[0089] A、流动相配制
[0090] 将磷酸氢二钾三水、磷酸二氢钾和氯化钾加入到约900mL纯化水中，搅拌溶解，定容至1L，用pH计测量，确定其pH在6.2±0.1之间。0.22μm滤膜过滤，室温保存。
[0091] B、样本制备
[0092] 系统适用性样品：MIL62标准品用流动相稀释至2mg/mL；
[0093] 供试品：待测样品用流动相稀释至2mg/mL。
[0094] 常规色谱条件下进行检测。
[0095] C、实验结果
[0096] 结果如图2所示，液相检测结果显示单克隆抗体7G8的检测纯度均大于95％。
[0097] (3)单克隆抗体的结合活性检测
[0098] A、包被：用包被液将抗原UreA蛋白稀释成2μg/ml，混匀，加入96孔包被板，100μl/孔，封膜封闭，4℃过夜。
[0099] B、洗板机洗涤3次，最后一次不能有液体残留在板子上，用吸水纸拍干板子表面的液体。
[0100] C、封闭：加入5％奶粉(0.5g奶粉溶于10mL DPBS)，300μL/孔，37℃孵育1h，按照步骤2)洗板3次。
[0101] D、将抗体进行梯度稀释，100μL/孔，37℃反应1h，按照步骤B洗板3次。
[0102] E、加二抗：用DPBS按照1:2000稀释，加入96孔板，100μL/孔，37℃反应1h，按照步骤B洗板3次。
[0103] F、显色：加入TMB，100μL/孔，室温避光显色10min。
[0104] G、终止：加入2N H2SO4，100μL/孔。
[0105] H、酶标仪测OD450，10min内检测。
[0106] I、实验结果
[0107] 结果如图3所示，结果显示，单克隆抗体7G8能够与UreA蛋白发生特异性的结合，并且呈现浓度依赖性，EC50为0.09152μg/mL。
[0108] 上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。
