红球菌菌株ND011的应用和烟草种植方法

摘要

本发明涉及烟草种植技术领域，提供了红球菌菌株ND011的应用和烟草种植方法。所述红球菌菌株ND011已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2023年4月25日，保藏编号为CCTCC NO:M 2023615。所述红球菌菌株ND011能够作为微生物农药，用于在烟草种植过程中防治烟草花叶病。

权利要求

1.红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）在防治烟草花叶病中的应用，其特征在于：所述红球菌菌株ND011已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2023年4月25日，保藏编号为CCTCC NO: M 2023615。

2.根据权利要求1所述的红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）在防治烟草花叶病中的应用，其特征在于：所述红球菌菌株ND011的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

3.根据权利要求1所述的红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）在防治烟草花叶病中的应用，其特征在于：所述烟草花叶病为烟草普通花叶病。

4.一种防治烟草花叶病的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）接种于液体培养基，得到发酵液；

将所述发酵液喷施在烟草叶片上；

其中，所述红球菌菌株ND011已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2023年4月25日，保藏编号为CCTCC NO: M 2023615。

5.根据权利要求4所述的防治烟草花叶病的方法，其特征在于：所述烟草叶片为三生烟草叶片。

6.根据权利要求4所述的防治烟草花叶病的方法，其特征在于：所述液体培养基为高氏一号液体培养基。

7.一种防治烟草花叶病的生物防治菌剂，其特征在于：以红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）为菌种制成，其中，所述红球菌菌株ND011已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2023年4月25日，保藏编号为CCTCC NO: M 2023615。

8.一种烟草种植方法，其特征在于：包括将权利要求7所述的防治烟草花叶病的生物防治菌剂喷施于烟草叶片上的步骤。

9.一种防治烟草花叶病的药物组合物，其特征在于：包括红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011），其中，所述红球菌菌株ND011已保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2023年4月25日，保藏编号为CCTCC NO: M 

2023615。

说明书

红球菌菌株ND011的应用和烟草种植方法

技术领域

[0001] 本发明涉及烟草种植技术领域，具体涉及红球菌菌株ND011的应用和烟草种植方法。

背景技术

[0002] 烟草花叶病毒（Tobacco mosaic virus, TMV）是一种严重危害烟草的病原体，其传播简单且宿主广泛，能够感染除烟草外的超过65科中的885种植物。TMV侵染烟草后，显著的症状是形成黄绿相间的斑驳花叶，病叶边缘有时向背面卷曲，严重影响烟草的生长，会造成烟田产量和烟叶质量的下降。

[0003] 目前，防治TMV的方法有农业防治、化学防治、生物防治等。微生物农药是生物农药的重要一种，包括活体微生物农药和农用抗生素。微生物农药是从天然产物中分离纯化出来的，可以直接作用于病虫害防治，也可以产生代谢产物作为新的农药。微生物本身含有丰富的资源并且分布广泛，从Mulvania在1926年发现使用细菌可以抑制植物病毒的生物活性后，便开始了从微生物及其次生代谢产物中寻找抑制TMV活性物质的研究，但是研究进展缓慢。

发明内容

[0004] 鉴于此，本发明提供红球菌菌株ND011的应用和烟草种植方法，至少解决现有技术中存在的一个问题。

[0005] 第一方面，本发明提供红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）在防治烟草花叶病中的应用，所述红球菌菌株ND011已保藏在中国典型培养物保藏中心（CCTCC），保藏地址为中国武汉市武汉大学，保藏日期为2023年4月25日，保藏编号为CCTCC NO: M 2023615。

[0006] 其中，所述红球菌菌株ND011的16S rDNA序列如SEQ ID NO：1所示。

[0007] 在一些优选的实施例中，所述烟草花叶病为烟草普通花叶病。

[0008] 第二方面，本发明提供一种防治烟草花叶病的方法，所述防治烟草花叶病的方法包括以下步骤：

[0009] 将所述红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）接种于液体培养基，得到发酵液；

[0010] 将所述发酵液喷施在烟草叶片上。

[0011] 在一些优选的实施例中，所述烟草叶片为三生烟草叶片。

[0012] 在一些优选的实施例中，所述液体培养基为高氏一号液体培养基。

[0013] 第三方面，本发明提供一种防治烟草花叶病的生物防治菌剂，所述生物防治菌剂以所述红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）为菌种制成。

[0014] 第四方面，本发明提供一种烟草种植方法，所述烟草种植方法包括将所述防治烟草花叶病的生物防治菌剂喷施于烟草叶片上的步骤。

[0015] 第五方面，本发明提供一种防治烟草花叶病的药物组合物，所述药物组合物包括所述红球菌菌株ND011（Rhodococcus sp. ND011）。

[0016] 由于采用了以上技术方案，本发明的实施例具有以下有益效果：提供了防治效果好的拮抗菌株，扩充抗植物病毒资源，实现了高效抑制病毒、促进植物生长，不破坏自然环境的目的。红球菌菌株ND011发酵液对烟草普通花叶病毒的抑制作用显著，首先是在三生烟枯斑实验中对TMV抑制率较高，红球菌菌株ND011发酵液对TMV钝化作用的抑制率可达82%。对红球菌菌株ND011发酵液对TMV的抑制作用进一步探究，在K326烟草内病毒表达量以及防御酶的变化情况中可以看出，红球菌菌株ND011能够诱导烟草产生抗病性；在接种TMV后，因其体内产生的抗性而使得烟草感染的病毒无法在其体内大量繁殖，从而达到比较好的抗病毒效果。将菌株ND011应用于抗花叶病毒生物农药的开发，能够开发出新的、高效、安全的微生物制剂来控制植物病毒病。

附图说明

[0017] 图1显示了本发明实施例中红球菌菌株ND011的培养形态特征。

[0018] 图2显示了本发明实施例中红球菌菌株ND011的系统发育树。

[0019] 图3为本发明实施例中发酵液处理组及缓冲液对照组心叶枯斑症状图。

[0020] 图4显示了本发明实施例中发酵液处理组（ND011）和喷施清水24h后接种TMV组（CK）的TMV表达量变化。

[0021] 图5显示了本发明实施例中发酵液处理组（ND011）、清水对照组（BL）和喷施清水24h后接种TMV组（CK）的防御酶活性的测定结果。

具体实施方式

[0022] 以下将结合实施例和附图对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地阐述本发明的目的、方案和效果。

[0023] 发明人在江西省抚州市黎川县潭溪乡烟草种植基地常年轮作烟草土壤中分离出一株无毒、无致病性、抗逆性强、抑菌活性稳定的抑制植物病毒的红球菌菌株ND011。以下实施例描述了红球菌菌株ND011的分离、鉴定、抗TMV活性检测等过程。

[0024] 实施例1

[0025] 红球菌菌株ND011的分离与纯化：

[0026] 将2020年7月烟草收割时期采自江西省抚州市黎川县潭溪乡烟草种植基地的土壤用于培养烟草，待烟草长至6‑7叶时，取根系土壤进行土壤微生物的分离与纯化，在PDA培养基、牛肉膏蛋白胨培养基以及高氏一号培养基上涂布分离单菌落，划线纯化后分离出红球菌菌株ND011。

[0027] 将分离纯化出的红球菌菌株ND011接种在三种培养基上，其中，将PDA培养基平板在30℃条件下培养，将牛肉膏蛋白胨培养基平板在37℃条件下培养，将高氏一号培养基平板在28℃条件下培养。培养时间为2‑5天，当能观察到明显菌落时，观察菌落形态。图1显示了本发明实施例中红球菌菌株ND011的培养形态特征，多形态菌丝体断裂不规则细胞，为球杆状，排列为之字形，无气生菌丝。

[0028] 实施例2

[0029] 红球菌菌株ND011的形态特征分析：

[0030] 形态学观察和培养特征：将红球菌ND011划线接种在高氏一号培养基上，将盖玻片倾斜插入培养基中，28℃培养3‑5 d后在显微镜下观察。

[0031] 乳酸酚棉蓝染色：在洁净载玻片上，滴1‑2滴乳酸酚棉蓝染色液，用接种环从菌落的边缘外取少量于染色液中，然后小心地盖上盖玻片于显微镜下观察。乳酸酚棉蓝染色结果显示菌丝体被染成亮蓝色，菌丝由中心向四周辐射生长，多为直线状，有些可以观察到少许弯曲菌丝，有分支。

[0032] 革兰氏染色：首先将涂片固定后，用结晶紫初染1 min；用无菌水洗净后，用碘液媒染1 min；以无菌清水洗净，使用95%乙醇进行脱色，冲洗并用番红染液染色10秒钟。最后，用油镜检查染色结果。如染色结果呈现出紫色则为革兰氏阳性菌，呈现出红色则为革兰氏阴性菌。本发明实施例中红球菌菌株ND011的染色观察结果为蓝紫色，属于革兰氏阳性菌。

[0033] 实施例3

[0034] 红球菌ND011的16S rDNA序列鉴定：

[0035] 利用DNA提取试剂盒提取红球菌ND011的DNA，在提取菌株基因组总DNA后，设计16S rDNA基因通用引物，扩增引物的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示，具体为：

[0036] 正向7F：5'‑CAGAGTTTGATCCTGGCT‑3'，

[0037] 反向1540R：5'‑AGGAGGTGATCCAGCCGCA‑3'；

[0038] 扩增片段长度约为1450bp。用提取的总DNA作为PCR模板，用1%琼脂糖凝胶进行电泳分析PCR产物，用凝胶成像仪观察对应结果。选用北京擎科生物科技股份有限公司SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒。将回收的PCR产物，送北京擎科生物科技股份有限公司进行测序。16S rDNA测序结果在NCBI数据库中进行BLAST搜索分析，进行同源性比较分析。图2显示了本发明实施例中红球菌菌株ND011的系统发育树，ND011菌株根据测序结果比对与红球菌菌属相似度达到了97%，初步判断其为红球菌菌属。

[0039] 红球菌ND011的16S rDNA测序结果如下：

[0040] 5'‑GCGGCGTGCTTACCTGCAGTCGAGCGGTAAGGCCTTTCGGGGTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTGATCTGCCCTGCACTTCGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAATACCGGATATGACCTCCTATCGCATGGTGGGTGGTGGAAAGATTTATCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGACGAAGCGCAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCACCGGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAACGTTATCCGGAATTACTGGGCGTAAAGAGTTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGTTTGTGAAAACCCGGGGCTCAACTTCGGGCTTGCAGGCGATACGGGCAGACTTGAGTGTTTCAGGGGAGACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGGTCTCTGGGAAACAACTGACGCTGAGGAACGAAAGCGTGGGTAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGTTCCTTCCACGGGATCTGTGCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAACCTTACCTGGGTTTGACATACACCAGACGGCCTCAGAGATGGGGTTTCCCTTGTGGCTGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCTTATGTTGCCAGCGCGTTATGGCGGGGACTCGTAAGAGACTGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCAGTACAGAGGGCTGCGAGACCGTGAGGTGGAGCGAATCCCTTAAAGCTGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCATGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCTTAACC‑3'。

[0041] 实施例4

[0042] 红球菌ND011发酵液的抗病毒活性检测：

[0043] (1)红球菌ND011发酵液的制备

[0044] 将红球菌ND011接种于高氏一号液体培养基(配置方法：可溶性淀粉20g，NaCl 0.5g，KNO31g，K2 HPO4·3H2O 0.5g，MgSO4·7H2O 0.5g，FeSO4·7H2O 0.01g，加水至1000 mL，调节pH 7.4‑7.6 )，在28℃、200 r/min条件下恒温振荡培养3d，获得ND011发酵液，在4℃条件下保存。

[0045] (2)枯斑法检测ND011发酵液在烟草上对TMV的防治效果

[0046] 选健康的8叶期三生烟(Nicotiana tabacum var samsunNN)，选取大小一致、中脉左右匀称的叶片。取感染TMV(Tobacco Mosaic Virus)引发烟草花叶病的发病症状严重的普通烟叶片，与接种PBS缓冲液(10mM磷酸缓冲液，pH7.4)以1：10（w/v）的比例研磨混匀，作为TMV病毒接种液。

[0047] 取上述得到的ND011发酵液与TMV病毒接种液1∶1混匀，将混合液置于25℃，静置30min后蘸取接种液摩擦接种选取的8叶期三生烟的左半边叶片；取接种上述缓冲液与病毒接种液1∶1混匀，半小时后摩擦接种右半边叶片作为对照；每个处理接种6个叶片，做3个重复处理；待出现明显枯斑后，记录枯斑数，取平均值，按以下公式计算抑制率：

[0048] 抑制率(％)＝[1‑(处理枯斑数/对照枯斑数)]×100。

[0049] 图3为本发明实施例中ND011发酵液处理组及缓冲液对照组心叶枯斑症状图，结果显示喷施ND011菌株发酵液的叶片TMV感染症状明显低于缓冲液对照组。

[0050] (3)ND011发酵液在烟草上抗TMV机理

[0051] 选择健康、长势一致的6‑8叶期普通烟K326，实验设不同处理组：

[0052] BL：仅喷施清水，不接种TMV；

[0053] CK：喷施清水后24h接种TMV；

[0054] T：喷施ND011菌种发酵液后24h接种上述所得TMV病毒液。

[0055] 分别于接种后1 d、3 d、5 d、7 d、9 d取各组烟草相同部位的叶片，每个处理随机选取3株，重复3次。收集叶片液氮速冻后存放在‑80℃冰箱中待测定相关防御酶活性及qRT‑PCR测定病毒表达情况。

[0056] (a)qRT‑PCR测病毒表达量

[0057] 采用Trizol法提取上述收集叶片的RNA，取50‑100 mg新鲜植物组织尽量剪碎，之后加入1 mL Total RNA Extraction Reagent混匀。将匀浆样品剧烈震荡后在室温条件下放置5分钟以使核蛋白体完全解离。4℃、12000 rpm离心10 min，取上清。向上述裂解液中加入0.2 mL氯仿。盖紧离心管盖，剧烈震荡15 sec，室温静置2‑3 min。4℃、12000 rpm离心10‑15 min。小心吸取上层水相至新离心管中，加入等体积异丙醇。颠倒混匀后室温放置10 min。4℃、12000 rpm离心10 min。小心弃去上清，加入1 mL 75%乙醇。涡旋充分洗涤，并轻弹管底，让沉淀悬浮起来。4℃、12000 rpm离心5 min，弃上清。室温放置5‑10 min。加入30‑100 μL 无RNase水溶解RNA，待完全溶解后，取少量检测，其余溶液‑70℃保存。

[0058] 使用Nanodrop超微量分光光度计对提取的总RNA进行核酸浓度的测定，测定后进行烟草cDNA的合成及扩增，利用烟草cDNA进行实时荧光定量PCR以测定烟草体内TMV含量，以不同时间段各处理普通烟K326样品β‑Actin为内参基因，各菌种发酵液处理的烟草体内‑ΔΔCtTMV‑CP为目标基因含量，以评估菌种发酵液对烟草抗性的影响，根据2 计算在不同时间段内各处理下的TMV‑CP基因的相对表达水平。

[0059] 图4显示了本发明实施例中发酵液处理组（ND011）和喷施清水24h后接种TMV组（CK）的TMV表达量变化，1‑7 d烟草体内TMV‑CP含量变化没有显著差异，在第7天后有所升高，但ND011发酵液明显低于CK组，说明ND011菌种发酵液可以抑制烟草体内TMV的增殖，保护烟草植株。

[0060] (b)防御酶活性测定

[0061] 采用愈创木酚法进行过氧化物酶(POD)活性测定，反应体系为2.9 mL 0.05 mol/L PBS缓冲液（pH 5.5）、1.0 mL 2% H2O2、1.0 mL 0.05 mol/L愈创木酚和0.1 mL酶液。37℃水浴锅内保温5 min，PBS替代酶液为空白对照。混匀后立刻计时，在470 nm下测定3 min内吸光度变化，每分钟变化0.01为一个酶活力单位U/（g·min）。

[0062] 测定超氧化物歧化酶（SOD）活性采用超氧化物歧化酶活性检测试剂盒检测，取0.1g烟草叶片，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；8000 g、4℃离心10 min，取上清，即为粗酶液，置于冰上待测。将粗酶液加入到试剂中混匀，不加入样本的预混液为空白对照组，37℃水浴30 min后，置于1 mL玻璃比色皿中测定560 nm下的吸光度。

[0063] 苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性用苯丙氨酸解氨酶检测试剂盒测定，取0.1g烟草叶片，加入1mL提取液，进行冰浴匀浆；8000 g、4℃离心10 min，取上清，即为粗酶液，置于冰上待测。将粗酶液加入到试剂中混匀，不加入样本的预混液为空白对照组，静置10 min 后，在290 nm处记录测定管吸光值。

[0064] 图5显示了本发明实施例中防御酶活性的测定结果，经ND011菌种发酵液处理的烟草PAL活性在第9天达到峰值，相比于CK组活性提高了94.87%；SOD活性在第一天达到峰值，相比于CK组活性提高了15.73%；POD活性在第3天达到峰值，相比于CK组活性提高了400%；结果表明经ND011菌种发酵液处理的烟草PAL、SOD、POD活性相较于CK组有不同程度提高。

[0065] 以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。