水稻OsFbx156基因在提高水稻抗稻瘟病上的应用

摘要

本发明公开了水稻OsFbx156基因在提高水稻抗稻瘟病上的应用，属于基因工程领域。上述水稻OsFbx156基因的核苷酸序列为SEQ ID NO：1所示。通过转基因实验及接种实验证明OsFbx156的过量表达促进水稻对稻瘟病菌的抗性，因此，该基因可作为目的基因导入水稻，提高水稻抗病性，以进行水稻品种改良。转入的OsFbx156基因所表达的蛋白通过促进防御相关基因OsPR1和OsPR10表达调控PTI响应过程，有效提高水稻防御能力。(56)对比文件Liu Z等.The E3 ubiquitin ligaseOsRGLG5 targeted by the Magnaportheoryzae effector AvrPi9 confers basalresistance against rice blast《.PlantCommun》.2023,第04卷(第05期),第1-15页.杨珍珍等.水稻泛素连接酶功能研究进展.《中国农学通报》.2013,第29卷(第18期),第1-5页.Wang,R.等.ON752826.1《.Genbank》.2022,第1-663位.

权利要求

1.水稻OsFbx156基因在如下（1）或（2）中的应用：（1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

（2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用；

其中，所述水稻OsFbx156基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.权利要求1中所述水稻OsFbx156基因编码的蛋白在如下（1）或（2）中的应用：（1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

（2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用；

其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

3.含有权利要求1中所述水稻OsFbx156基因的重组载体在如下（1）或（2）中的应用：（1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

（2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用。

4.含有权利要求3中所述重组载体的宿主菌在如下（1）或（2）中的应用：（1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

（2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用。

5.如权利要求1‑4任一项所述的应用，其特征在于，过表达所述水稻OsFbx156基因，提高水稻抗稻瘟病的能力。

6.一种提高水稻抗稻瘟病的方法，其特征在于，将水稻OsFbx156基因导入水稻中，过表达所述水稻OsFbx156基因，所述水稻OsFbx156基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，将水稻OsFbx156基因导入水稻中包括以下步骤：将所述水稻OsFbx156基因导入表达载体，构建重组表达载体；

将所述重组表达载体转入农杆菌，构建重组菌；

将所述重组菌接种水稻，以将所述水稻OsFbx156基因导入水稻。

说明书

水稻OsFbx156基因在提高水稻抗稻瘟病上的应用

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程领域，特别是涉及水稻OsFbx156基因在提高水稻抗稻瘟病上的应用。

背景技术

[0002] 蛋白质泛素化参与蛋白质的降解、激活和转运，常与磷酸化伴随发生，从而实现对靶蛋白的丰度和活性的精准调节。这个过程涉及到了泛素激活酶E1、泛素结合酶E2和泛素连接酶E3这三个酶，分别经过三个步骤完成。依据E3的结构特征和作用机制的不同可以将其划分为四个亚家族：HECT（Homologous to E6‑associated protein C‑Terminus），RING（Really Interesting New Gene），CRL（Cullin‑RING Ligases）和U‑Box蛋白。近年来，越来越多的研究证据表明植物中26S泛素蛋白酶体系，尤其是其中的E3泛素连接酶参与了各种抗病信号反应途径的调控。而蛋白泛素化的特异性主要是通过E3对底物蛋白的特异识别得以实现的，因此，E3连接酶的功能是蛋白泛素化研究中的热点。

[0003] 近年来发现泛素连接酶作为调节子，不但参与植物细胞质膜PRRs识别病原菌PAMPs所介导的PTI免疫响应过程，而且还直接调控R基因介导的ETI抗病反应过程，也涉及到调控抗病相关信号途径和细胞程序性死亡途径。例如，拟南芥在受到细菌鞭毛蛋白(flagellin)诱导后，FLS2受体复合体招募两个同源性极高的U‑box蛋白PUB12和PUB13，BIK1作为FLS2/BAK1复合体相关的激酶，能够增强BAK1磷酸化PUB12/13的能力，接着PUB12/13才能够泛素化FLS2，并促进其降解，从而负调控FLS2介导的PTI免疫反应。在烟草以及番茄中，ACRE74和ACRE276都作为ETI响应的正调控因子，参与抵抗番茄叶霉病。在辣椒中，CaRING是一个定位在质膜上，有活性的E3连接酶基因，在辣椒抵御病原菌Xanthomonas campestris pvvesicatoria侵染时，参与调控HR反应以及免疫响应。在水稻中，水稻类受体激酶XA21的互作蛋白XB3，是一个RING型的泛素化连接酶，它通过调节XA21蛋白的稳定性，进而调控XA21介导的水稻对白叶枯病的抗病性。稻瘟病菌效应因子AvrPiz‑t的互作蛋白APIP6，作为一个水稻RING型泛素连接酶，通过调控ROS含量以及防御相关基因的表达来参与水稻对稻瘟病的抗病性。综上，泛素连接酶在调控植物抗病中发挥着至关重要的作用。

[0004] 在烟草中筛选参与Cf9介导的ETI反应蛋白中，发现了一个具有亮氨酸富集结构域的F‑box型E3连接酶蛋白Avr9/Cf‑9‑INDUCED F‑Box1(ACIF1)，沉默该基因，会使烟草响应许多效应子诱导的HR反应减弱，同时也会降低由N基因介导的烟草对TMV病毒的抗性，减轻由丁香假单孢菌诱导的细胞死亡。然而，对F‑box型E3连接酶参与水稻抗病反应的研究甚少。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供水稻OsFbx156基因在提高水稻抗稻瘟病上的应用，以解决上述现有技术存在的问题，水稻OsFbx156基因在水稻中过表达可以显著提高抗稻瘟病的能力。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0007] 本发明提供水稻OsFbx156基因在如下（1）或（2）中的应用：

[0008] （1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

[0009] （2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用；

[0010] 其中，所述水稻OsFbx156基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示：

[0011] ATGGAGGTTGCTACTCCCAATAATAACGCTCACCAGGTCATTGATGAACTAGTATCCAATGATGATGATGACGATAGGCTCAGCGCCCTCCCAAATGAAATTTCGATCTACATCCTCCAACGCCTGCCGCTGCGCACTTCAGCACAGACCACCATCCTCGCAAGGCGATGGACCCATCTTTTCCCATCCATGACACATCTCAAAATAGATATCAATGAATTTGTACCACGCATCCTCACTAGGCACAATGTGGCTCGAAGCATGGCCATGTCGTGGTACACCCAAGCACTAAGGACATTGCTAGCTCCTACAATTGACCCTGATCGGACCATAAGGACCATGCATCTACGCTTCTACCCCACAGACTCATACCTGCTCTCCATTGCCCGCATGGTCGACGATGCGGTTCAGAGTGCCAGTGCCAGCAAGATTGAGGTCCTTGACTTTGCCATTCTGAATGAGGTGTCCGAGGTGCACTGCACCGAGAAACAGATGTCACGATACGGGCGACGCTTCATGTCCTTCTTTCAGGCTTGCCCCAATGGATTCAGGTGCCTAACAAGCCTCTCTCTATGGGCCCTCAGGTTTCGGGATTCAGATATCCCAAGCCTACTAGGCTCCTGCCACCAGCTGCAGCACCTCCTTCTACGGGCTTTGCGATAG。

[0012] 本发明还提供所述水稻OsFbx156基因编码的蛋白在如下（1）或（2）中的应用：

[0013] （1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

[0014] （2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用；

[0015] 其中，所述蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示：

[0016] MEVATPNNNAHQVIDELVSNDDDDDRLSALPNEISIYILQRLPLRTSAQTTILARRWTHLFPSMTHLKIDINEFVPRILTRHNVARSMAMSWYTQALRTLLAPTIDPDRTIRTMHLRFYPTDSYLLSIARMVDDAVQSASASKIEVLDFAILNEVSEVHCTEKQMSRYGRRFMSFFQACPNGFRCLTSLSLWALRFRDSDIPSLLGSCHQLQHLLLRALR。

[0017] 本发明还提供含有所述水稻OsFbx156基因的重组载体在如下（1）或（2）中的应用：

[0018] （1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

[0019] （2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用。

[0020] 本发明还提供含有所述重组载体的宿主菌在如下（1）或（2）中的应用：

[0021] （1）在提高水稻抗稻瘟病上的应用；

[0022] （2）在构建抗稻瘟病的转基因水稻中的应用。

[0023] 优选的是，过表达所述水稻OsFbx156基因，提高水稻抗稻瘟病的能力。

[0024] 本发明还提供一种提高水稻抗稻瘟病的方法，将水稻OsFbx156基因导入水稻中，过表达所述水稻OsFbx156基因，所述水稻OsFbx156基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0025] 优选的是，将水稻OsFbx156基因导入水稻中包括以下步骤：

[0026] 将所述水稻OsFbx156基因导入表达载体，构建重组表达载体；

[0027] 将所述重组表达载体转入农杆菌，构建重组菌；

[0028] 将所述重组菌接种水稻，以将所述水稻OsFbx156基因导入水稻。

[0029] 本发明公开了以下技术效果：

[0030] 本发明将OsFbx156基因在水稻中过表达构建转基因水稻，通过抗病性检测发现：该基因的过量表达提高了水稻对稻瘟病菌的抗性。因此，OsFbx156基因可作为目的基因导入水稻，提高水稻抗病性，以进行水稻品种改良。转入的OsFbx156基因所表达的蛋白通过促进防御相关基因OsPR1和OsPR10表达调控PTI响应过程，有效提高水稻防御能力。

附图说明

[0031] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0032] 图1为pRHV‑cHA表达载体图谱；

[0033] 图2为转基因水稻中OsFbx156的表达量分析；TG394表示野生型水稻品种，OsFbx156‑OE‑20，OsFbx156‑OE‑24和OsFbx156‑OE‑26表示以TG394为背景转化的三个过表达株系；

[0034] 图3为OsFbx156‑OE转基因植株对稻瘟菌生理小种RO1‑1的抗病性检测；

[0035] 图4为OsFbx156‑OE转基因植株病斑数量统计；

[0036] 图5为OsFbx156‑OE转基因植株中OsPR1和OsPR10的基因表达量分析。

具体实施方式

[0037] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0038] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0039] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0040] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

[0041] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0042] 实施例1 OsFbx156‑OE过表达株系构建

[0043] 1、总RNA的提取

[0044] 选用水稻品种日本晴，待水稻幼苗长至两周左右取样，在液氮中将水稻叶片研磨成粉末，转移入盛有Trizol裂解液的1.5 mL EP管，充分振荡后，抽提总RNA，电泳鉴定总RNA质量，保存至‑80℃冰箱。

[0045] 2、水稻F‑box型E3泛素连接酶蛋白基因OsFbx156的克隆和植物表达载体的构建[0046] 设计两端引物

[0047] P1：5’‑ GGATCCCCGGGTGAGCTCATGGAGGTTGCTACTCCCAA ‑3’(SEQ ID NO：3)；

[0048] P2：5’‑ CTTAGCGGCCGCACTAGTTCGCAAAGCCCGTAGAA ‑3’(SEQ ID NO：4)。

[0049] 将上述获得的总RNA反转录合成cDNA第一链，以此为模板用高保真KOD酶进行PCR扩增，PCR扩增反应体系如下：cDNA 1 µL，P1和P2引物各1 µL，KOD‑plus 1 µL，10×buffer 5 µL，MgSO45 µL，dNTP 4 µL，ddH2O补充体系至50 µL；PCR反应程序如下：95 ℃预变性5 min，95 ℃变性30 s，58 ℃复性30 s，68 ℃延伸1 min，32个循环后，68 ℃延伸10 min，进行琼脂糖凝胶电泳，切胶并回收获得OsFbx156基因片段。同时，用限制性内切酶SacI和SpeI双酶切pRHV‑cHA载体，然后回收酶切后的载体片段。进一步通过同源重组法将OsFbx156基因片段克隆到表达载体pRHV‑cHA（见图1），连接体系如下：同源重组酶Exnase II 2 µL，5×CE buffer 2 µL，目的基因2 µL，载体2 µL，ddH2O 2 µL；37 ℃，30 min。将连接产物42 ℃热击转化大肠杆菌感受态JM109，涂于含有50 µg/mL卡那霉素的LB固体培养基，37 ℃，倒置培养12 h左右，挑取转化成功的单克隆于含有50 µg/mL卡那霉素的LB液体培养基，摇培10‑
12 h，提取质粒，测序鉴定确保表达载体中编码区阅读框架正确，获取重组载体pRHV‑cHA‑OsFbx156。

[0050] 3、转基因植株的获得

[0051] 将上述获得的重组载体pRHV‑cHA‑OsFbx156通过电击转化法转入农杆菌菌株EHA105，涂于含有50 µg/mL的卡那霉素和利福平的LB固体培养基，28 ℃，倒置培养2 d左右，挑取转化的农杆菌单菌落接种于含50 µg/mL的卡那霉素和利福平的LB液体培养基中，28 ℃，220 rpm摇培16 h，进一步转化水稻品种泰粳394，获得转基因水稻。

[0052] 取转基因水稻苗幼嫩叶片，提取RNA并反转录cDNA，设计引物OsFbx156‑F1：ATACGGGCGACGCTTCAT和OsFbx156‑F2：CCGTAGAAGGAGGTGCTGC，通过qRT‑PCR检测OsFbx156基因表达量，qRT‑PCR反应体系如下：引物F1和F2各1 µL，2×SYBR qPCR Mix 10 µL，稀释的cDNA 8 µL；反应程序如下 95 ℃预变性30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环，然后95℃ 
15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s生成溶解曲线。对获得的OsFbx156过表达植株进行继代培养用于水稻的抗病性检测。经检测，得到过表达植株OsFbx156‑OE‑20、OsFbx156‑OE‑24和OsFbx156‑OE‑26。

[0053] 实施例2 OsFbx156‑OE过表达株系抗病性鉴定

[0054] 喷雾接种：待OsFbx156‑OE过表达植株和野生型对照组水稻植株长至4周叶龄时，5
用0.05% Tween2.0重悬浮稻瘟菌生理小种RO1‑1孢子，使悬浮液浓度达到1.2x10个/mL，用小喷壶进行喷雾接种，使孢子悬浮液垂直落到“三叶一心”期水稻苗叶片上，待叶片有白色水雾出现即可，封口膜小心封住接种箱以保证湿度，然后将水稻置于植物生长箱中黑暗培养24小时，转移至12小时光照/12小时黑暗条件下生长，7天后观察病斑扩展情况，调查病情，统计病斑数量，与野生型对照相比具有明显抗性的转基因水稻植株即为获得的抗稻瘟病转基因植株。

[0055] 结果发现：与野生型TG394植株相比，OsFbx156过表达植株增强了对稻瘟菌生理小种RO1‑1的抗病性（见图3），同时，统计了转基因株系和野生型发病叶片的病斑数量（见表1），具体表现为OsFbx156过表达转基因植株接种后病斑数量与对照组相比下降了50%左右（见图4）。

[0056] 同时，设计引物OsPR1‑F1：CGTCTTCATCACCTGCAACTACTC和OsPR1‑F2：CATGCATAAACACGTAGCATAGCA；OsPR10‑F1：CCCTGCCGAATACGCCTAA和OsPR10‑F2：
CTCAAACGCCACGAGAATTTG，qRT‑PCR检测OsFbx156过表达植株防御相关基因OsPR1和OsPR10的表达量。qRT‑PCR反应体系如下：引物F1和F2各1 µL，2×SYBR qPCR Mix 10 µL，稀释的cDNA 8 µL；反应程序如下 95 ℃预变性30 s，95℃ 10 s，60℃ 30 s，40个循环，然后95℃ 
15 s，60℃ 60 s，95℃ 15 s生成溶解曲线。

[0057] qRT‑PCR检测结果显示：防御相关基因OsPR1和OsPR10的表达量在过表达植株中显著上升（见图5）。

[0058] 表1转基因株系和野生型发病叶片的病斑数量统计

[0059]

[0060] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。