一种二裂酵母发酵产物溶胞产物及其制备方法和应用

摘要

本发明属于微生物技术领域，公开了一种二裂酵母发酵产物溶胞产物及其制备方法和应用。本发明的二裂酵母发酵产物溶胞产物由长双歧杆菌发酵产物制得；所述长双歧杆菌为长双歧杆菌Bifidobacterium longum HGCW‑18，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221015。本发明选用筛选得到的长双歧杆菌HGCW‑18制备二裂酵母发酵产物溶胞产物，所得的二裂酵母发酵产物溶胞产物比现有技术中的长双歧杆菌所制备得到的二裂酵母发酵产物溶胞产物具有更好的保湿、抗皱和修复屏障功效，且本发明的二裂酵母发酵产物溶胞安全性高，适合应用在化妆品中。(56)对比文件Guéniche, A等.Bifidobacterium longumlysate, a new ingredient for reactiveskin《.EXPERIMENTAL DERMATOLOGY》.2010,第19卷(第8期),第E1-E8页.Amaretti, A等.Antioxidant propertiesof potentially probiotic bacteria: invitro and in vivo activities《.APPLIEDMICROBIOLOGY AND BIOTECHNOLOGY》.2012,第97卷(第2期),第809-817页.

权利要求

1.一种二裂酵母发酵产物溶胞产物，其特征在于，由长双歧杆菌发酵制得；所述长双歧杆菌为长双歧杆菌（Bifidobacterium sp.）HGCW‑18，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221015。

2.一种权利要求1所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）将所述长双歧杆菌（Bifidobacterium sp.）HGCW‑18接种于固体培养基中活化，得单菌落；将所述单菌落接种至液体培养基中静置培养，得种子液；

（2）将所得种子液接种至发酵培养基中静置培养，得发酵液；

（3）将所述发酵液离心处理，去除上清，用水清洗沉淀，裂解，得破壁菌体；将所得破壁菌体离心处理、过滤，得到二裂酵母发酵产物溶胞产物。

3.根据权利要求2所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法，其特征在于，在步骤（1）中，所述液体培养基为MRS培养基，所述固体培养基为TPY固体培养基或MRS固体培养基；

所述活化和静置培养的温度均为32℃ 40℃，时间均为35h 70h。

~ ~

4.根据权利要求2所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述发酵培养基包括氮源和碳源；所述氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼粉、黄豆粉中的至少一种；所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果葡糖浆、水解淀粉中的至少一种；以质量百分比计，所述氮源在所述发酵培养基中的添加量为0.5% 10%，所述碳源在所述发酵培~养基中添加量为0.2% 4%。

~

5.根据权利要求4所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法，其特征在于，在步骤（2）中，所述氮源和碳源的质量比为2 8：1；所述静置培养的温度为32℃ 40℃，时间为35h~ ~ ~

70h。

6.根据权利要求2所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法，其特征在于，在步骤（3）中，发酵液离心去上清时，转速为8000rpm 25000rpm，时间为5min 30min；所述裂解的温~ ~度为0℃ 20℃，压力为35Mpa 100Mpa，时间为10min 50min；所述破壁菌体离心的转速为~ ~ ~

8000rpm 25000rpm，时间为10min 40min；所述过滤采用陶瓷膜进行过滤，所述陶瓷膜为0.1~ ~μm 1.5μm的滤膜。

~

7.一种二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液，其特征在于，包括权利要求1所述的二裂酵母发酵产物溶胞产物。

8.根据权利要求7所述的二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液，其特征在于，按质量百分比计，所述二裂酵母发酵产物溶胞产物在所述精华液中的添加量为3% 20%。

~

9.权利要求1所述的二裂酵母发酵产物溶胞产物在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品为柔肤水类、乳液类、膏霜类、面贴膜类、啫喱类、粉类、喷雾类、精华类中的任意一种。

10.权利要求1所述的二裂酵母发酵产物溶胞产物在制备化妆品中的应用，其特征在于，所述化妆品为洗护类和彩妆类化妆品中的任意一种。

说明书

一种二裂酵母发酵产物溶胞产物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一种二裂酵母发酵产物溶胞产物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 双歧杆菌是定植于人体及动物肠道的重要菌群。长双歧杆菌作为双歧杆菌的重要益生菌，广泛定植于体肠道内，对人体具有多种潜在的益生功能，能合成并分泌各种多肽类物质和酶类，如抗菌肽、蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶等，促进营养物质的分解从而有利于人体对其吸收和利用。

[0003] 长双歧杆菌中含有多种营养成分，如氨基酸、多肽、维生素B族、维生素C、维生素K、叶酸等多种维生素等。通过长双歧杆菌发酵得到的细胞裂解产物也成称为二裂酵母发酵产物溶胞产物，长双歧杆菌中营养成分的存在使得二裂酵母发酵产物溶胞产物具有了各种各样的功效。比如抗衰老功效，二裂酵母发酵产物溶胞产物可以中和自由基，改善皱纹和细纹，增加皮肤弹性，让肌肤变得平顺、细致，还也可减轻和预防皮肤在早期衰老过程中产生的肤色暗沉问题。又如锁水保湿功效，二裂酵母发酵产物溶胞产物中含有的多糖类物质是天然的保湿剂，某些多糖成分还有消炎的效果。再比如亮肤功效，二裂酵母发酵产物溶胞产物可以促进含黑色素角质细胞的新陈代谢，加速角质脱落，促进合成表皮层蛋白质，改善肌肤质地，提亮肤色。

[0004] 然而，长双歧杆菌为严格的厌氧发酵菌种，现有技术中的长双歧杆菌通过裂解技术得到的二裂酵母发酵产物溶胞产物有效物质较少，二裂酵母发酵产物溶胞产物的护肤功效仍较差。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于克服现有技术的不足之处而提供一种二裂酵母发酵产物溶胞产物及其制备方法和应用。

[0006] 为实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：

[0007] 第一方面，本发明提供一种二裂酵母发酵产物溶胞产物，由长双歧杆菌发酵制得；所述长双歧杆菌为长双歧杆菌Bifidobacterium sp.HGCW‑18，其保藏编号为CCTCC NO：M 
20221015。

[0008] 本发明选用筛选得到的长双歧杆菌HGCW‑18制备二裂酵母发酵产物溶胞产物，所得的二裂酵母发酵产物溶胞产物比现有技术中的长双歧杆菌所制备得到的二裂酵母发酵产物溶胞产物具有更好的保湿、抗皱和修复屏障功效，且本发明的二裂酵母发酵产物溶胞安全性高，适合应用在化妆品中。

[0009] 第二方面，本发明提供一种所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法，包括以下步骤：

[0010] (1)将所述长双歧杆菌Bifidobacterium sp.HGCW‑18接种于固体培养基中活化，得单菌落；将所述单菌落接种至液体培养基中静置培养，得种子液；

[0011] (2)将所得种子液接种至发酵培养基中静置培养，得发酵液；

[0012] (3)将所述发酵液离心处理，去除上清，用水清洗沉淀，裂解，得破壁菌体；将所得破壁菌体离心处理、过滤，得到二裂酵母发酵产物溶胞产物。

[0013] 作为本发明所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法的优选实施方式，在步骤(1)中，所述液体培养基为MRS培养基，所述固体培养基为TPY固体培养基或MRS固体培养基；所述活化和静置培养的温度为32℃～40℃，时间为35h～70h。

[0014] 作为本发明所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述发酵培养基包括氮源和碳源；所述氮源为大豆蛋白胨、胰蛋白胨、鱼粉、黄豆粉、铵盐中的至少一种；所述碳源为葡萄糖、麦芽糖、蔗糖、果葡糖浆、水解淀粉中的至少一种。以质量百分比计，所述氮源在所述发酵培养基中的添加量为0.5％～10％，所述碳源在所述发酵培养基中添加量为0.2％～4％；优选的，所述氮源在所述发酵培养基中的添加量为1％～4％，所述碳源在所述发酵培养基中的添加量为0.5％～1％。

[0015] 作为本发明所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法的优选实施方式，在步骤(2)中，所述氮源和碳源的质量比为2～8：1；优选为4:1；所述静置培养的温度为32℃～40℃，时间为35h～70h。

[0016] 作为本发明所述二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备方法的优选实施方式，在步骤(3)中，发酵液离心去上清时，转速为8000rpm～25000rpm，时间为5min～30min；所述裂解的温度为0℃～20℃，压力为35Mpa～100Mpa，时间为10min～50min；所述破壁菌体离心的转速为8000rpm～25000rpm，时间为10min～40min；所述过滤采用陶瓷膜进行过滤，所述陶瓷膜为0.1μm～1.5μm的滤膜。

[0017] 第三方面，本发明提供了一种二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液，包括所述的二裂酵母发酵产物溶胞产物。

[0018] 作为本发明所述的二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液的优选实施方式，按质量百分比计，所述二裂酵母发酵产物溶胞产物在所述精华液中的添加量为3％～20％。

[0019] 第四方面，本发明将所述的二裂酵母发酵产物溶胞产物在化妆品中应用。

[0020] 作为本发明所述的应用的优选实施方式，所述化妆品为柔肤水类、乳液类、膏霜类、面贴膜类、啫喱类、粉类、喷雾类、精华类、洗护类和彩妆类化妆品中的任意一种。

[0021] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：

[0022] 本发明选用筛选得到的长双歧杆菌HGCW‑18制备二裂酵母发酵产物溶胞产物，所得的二裂酵母发酵产物溶胞产物比现有技术中的长双歧杆菌所制备得到的二裂酵母发酵产物溶胞产物具有更好的保湿、抗皱和修复屏障功效，且本发明的二裂酵母发酵产物溶胞安全性高，适合应用在化妆品中。

附图说明

[0023] 图1为分离得到长双歧杆菌HGCW‑18的菌落形态图；

[0024] 图2为显微镜下长双歧杆菌HGCW‑18的革兰氏染色图；

[0025] 图3为长双歧杆菌HGCW‑18的16S rDNA PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图；

[0026] 图4为使用精华液前后皮肤角质层水分含量的变化率统计图；

[0027] 图5为使用精华液前后皮肤经皮水分流失的变化率统计图；

[0028] 图6为使用精华液前后皮肤弹性R2的变化率统计图；

[0029] 图7为使用精华液前后皱纹面积占比的变化率统计图；

[0030] 图8为荧光定量PCR检测统计图。

具体实施方式

[0031] 为更好地说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。本领域技术人员应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0032] 实施例中所用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0033] 实施例1：长双歧杆菌HGCW‑18的分离和鉴定

[0034] 1、分离纯化和形态鉴定

[0035] 采集奶酪制品做样品，用TPY固体培养基分离奶酪制品中的微生物。将分离的微生物于工作站中37℃培养48h，挑取平板上的优势菌落划线分离得到纯菌落，通过革兰氏染色进行形态学观察，并将纯菌落接种于TPY固体培养基中37℃厌氧培养48h，培养结束后置于4℃保藏。得到单个菌株HGCW‑18。

[0036] 菌株HGCW‑18纯化后在TPY固体培养基中形成单菌落，其形态如图1所示，菌落形态几乎一致，大多数呈圆形，白色，表面粗糙较为干燥。在30℃～45℃环境下均能生长，接触酶、运动性、硝酸盐还原、吲哚、产H2S及明胶液化试验均为阴性，

[0037] 通过革兰氏染色结果如图2所示，在显微镜下观察到紫色杆状细胞形态，判定为乳酸杆菌中的一种。

[0038] 2、薄层层析法检测鉴定

[0039] 乳酸杆菌属糖酵解过程主要产生以乳酸、乙酸为主要的短链脂肪酸，利用此特性，通过采用薄层层析法检测不同糖源糖酵解过程中有机酸的产生来对菌株HGCW‑18进行鉴定。

[0040] 将上述步骤中分离的菌株HGCW‑18在含不同糖源的培养基中37℃培养24h，于5000rpm离心20min，收集上清液，以溶于70％酒精中的甲基化和溴酚蓝混合溶液为指示剂，进行薄层层析法检测。

[0041] 结果如表1所示。

[0042] 表1菌株HGCW‑18的薄层层析法检测结果

[0043]

[0044]

[0045] 3、16S rDNA鉴定

[0046] 细菌的16S rDNA序列在不同的物种间是高度保守的，不同物种间16S rDNA序列不同。因此，通过对16S rDNA序列进行PCR扩增、测序，与GenBank中的已知序列进行比对后，可判定细菌种类，将其划分到特定的属或种。16S rDNA(16S rRNA为核糖体的RNA的一个亚基，16S rDNA是编码16S rRNA的基因)鉴定是指用利用细菌16S rDNA序列测序的方法对细菌进行种属鉴定。

[0047] 采用细菌基因组DNA提取试剂盒提取纯化菌株HGCW‑18的DNA，将提取的基因组DNA作为16S rDNA‑PCR模板进行扩增。

[0048] 引物信息如表2所示。

[0049] 表2通用引物

[0050]

[0051] 扩增体系各组分如表3所示。

[0052] 表3PCR扩增体系

[0053] 1×TSE101金牌mix 45μLF(10P) 2μL
R(10P) 2μL
DNA模板 1μL

[0054] 以上扩增体系按表4所示的扩增程序扩增。

[0055] 表4PCR扩增程序

[0056]

[0057]

[0058] 将扩增好的PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳(2μL样品+6μL溴酚蓝)，300V电压下12分钟，获取鉴定胶图。电泳图如图3所示。

[0059] 将PCR产物进行一代测序(测序引物为27F/1492R)，将测序结果通过BLAST程序与GenBank基因库进行同源性比对。16S rDNA同源性分析结果显示，菌株与GenBank数据库中已知长双歧杆菌的同源性达100％。

[0060] 结合形态学鉴定、薄层层析法检测鉴定和16S rDNA同源性分析，将分离的乳酸杆菌鉴定为长双歧杆菌Bifidobacterium longum，于2022年7月4日保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC NO：M 20221015，其分类命名为长双歧杆菌Bifidobacterium sp.HGCW‑18，保藏单位地址为中国湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学。

[0061] 实施例2：二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备

[0062] (1)制备长双歧杆菌种子液

[0063] 将长双歧杆菌HGCW‑18接种于TPY固体培养基中，于37℃条件下培养活化48h，得到单菌落的长双歧杆菌；将单菌落的长双歧杆菌接种至100mL的MRS培养基中，于37℃条件下静置培养48h，得到长双歧杆菌种子液。

[0064] (2)制备长双歧杆菌发酵液

[0065] 按照1％接种量将长双歧杆菌种子液接种至发酵培养基中，于37℃条件下静置培养48h，得到长双歧杆菌发酵液；以质量百分比计，发酵培养基中含2％大豆蛋白胨和0.5％葡萄糖。

[0066] (3)制备二裂酵母发酵产物溶胞产物

[0067] 将得到的长双歧杆菌发酵液在15000rpm离心处理10min，弃去上清液，用去离子水清洗沉淀，在15000rpm二次离心处理10min，将水洗后的沉淀在无菌、15℃、50Mpa高压裂解下30min，得到破壁的菌体，将得到的破壁的菌体于15000rpm离心处理20min，将上清液用0.2μm的滤膜进行过滤，得到二裂酵母发酵产物溶胞产物。

[0068] 实施例3：二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备

[0069] 与实施例2不同之处仅在于：步骤(2)中，发酵培养基中大豆蛋白胨的含量为1％。

[0070] 实施例4：二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备

[0071] 与实施例2不同之处仅在于：步骤(2)中，发酵培养基中大豆蛋白胨的含量为3％。

[0072] 实施例5：二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备

[0073] 与实施例2不同之处仅在于：步骤(2)中，发酵培养基中大豆蛋白胨的含量为4％。

[0074] 对比例1：二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备

[0075] 与实施例2不同之处仅在于：长双歧杆菌为市售的长双歧杆菌ATCC55814，购自北京保藏生物科技有限公司。

[0076] 对比例2：二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备

[0077] 与实施例2不同之处仅在于：长双歧杆菌为市售的长双歧杆菌ATCC55816，购自北京保藏生物科技有限公司。

[0078] 对比例3：二裂酵母发酵产物溶胞产物的制备

[0079] 与实施例2不同之处仅在于：长双歧杆菌为市售的长双歧杆菌CICC6068，购自上海保藏生物科技有限公司。

[0080] 实施例6：二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液的制备

[0081] 分别将实施例2～5二裂酵母发酵产物溶胞产物制备成含3％～20％二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液。

[0082] 精华液的配方如表5所示。

[0083] 表5精华液的配方

[0084]

[0085]

[0086] 精华液的制备步骤如下：

[0087] (1)依据表5的配方将组分A、B、C、D、E分别预混，备用；

[0088] (2)将组分A搅拌加热至60℃～80℃，加入组分B组，继续加热至75℃～85℃，以使各成分完全溶解，保温10min～30min，以起到杀菌、消泡的目的，得到混合液I；

[0089] (3)将组分C加热至75℃～85℃，保温10min～30min，以起到杀菌、消泡的目的；

[0090] (4)在75℃～85℃条件下，将混合液I缓慢加入到预热的组分C中，均质2min～25min，至完全乳化均匀，得到混合液II；

[0091] (4)降温至45℃以下，向混合液II中加入组分D和组分E，搅拌均匀，得到精华液。

[0092] 实施例7：二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液的制备

[0093] 分别将实施例2～5和对比例1～3的二裂酵母发酵产物溶胞产物制备成含10％二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液，作为测试的样品。

[0094] 精华液的配方如表6所示。

[0095] 表6精华液的配方

[0096]

[0097]

[0098] 精华液的制备步骤如下：

[0099] (1)依据表6的配方将组分A、B、C、D、E分别预混，备用；

[0100] (2)将组分A搅拌加热至70℃左右，加入组分B，继续加热至82℃，以使各成分完全溶解，保温20min，得到混合液I；

[0101] (3)将组分C组加热至82℃，保温15min；

[0102] (4)在82℃条件下，将混合液I缓慢加入到预热的组分C中，均质5min，至完全乳化均匀，得到混合液II；

[0103] (5)降温至40℃，向混合液II中加入组分D和组分E，搅拌均匀，得到精华液。

[0104] 测试例1：皮肤角质层水分含量测试

[0105] 测试样品：10％二裂酵母发酵产物溶胞产物精华液(实施例2～5和对比例1～3).[0106] 测试步骤：选择年龄18～45岁健康的志愿者210名，每一样品30名志愿者。实施例2～5与对比例1～3的精华液按测试区域随机分布表分布于志愿者左、右侧脸，发放给志愿者连续使用28天，每天使用2次(早、晚各一次)，每次使用0.2g。在使用前、使用后2周、4周进行测试。

[0107] 测试仪器：皮肤水分测试仪Cornmeometer CM825(由德国CK公司生产)。

[0108] 变化率＝(使用后的平均值‑使用前的平均值)/使用前的平均值×100％。

[0109] 测试的数值越高，说明皮肤角质层的水分含量越高，精华液的保湿效果越明显。

[0110] 测试结果见表7和图4。

[0111] 表7使用精华液前、使用2、4周后皮肤角质层水分含量的结果汇总表[0112]

[0113]

[0114] 测试结果表明，与现有技术中的长双歧杆菌发酵得到的二裂酵母发酵产物溶胞产物相比，使用实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物制备得到的精华液具有更好的保湿效果。大豆蛋白胨加入量影响了长双歧杆菌的生长，进而影响了二裂酵母发酵产物溶胞产物的保湿效果，对比实施例2～4可知，当发酵培养基中大豆蛋白胨的含量为2％时(实施例2)，皮肤角质层的水分含量变化率最高，精华液的保湿效果最好。

[0115] 测试例2：皮肤经皮水分流式测试

[0116] 测试样品：同测试例1。

[0117] 测试步骤：同测试例1。

[0118] 测试仪器：皮肤水分散失测试仪Tewameter TM300(由德国CK公司生产)。

[0119] 变化率＝(使用后的平均值‑使用前的平均值)/使用前的平均值×100％。

[0120] 测试的数值越低，说明单位时间内皮肤经皮水分散失量越少，皮肤屏障越好。

[0121] 测试结果见表8和图5。

[0122] 表8使用精华液前、使用2、4周后皮肤经皮水分流失的结果汇总表

[0123]

[0124]

[0125] 测试结果表明，与常规的二裂酵母发酵产物溶胞产物相比，实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物具有更好的屏障修复作用。当发酵培养基中大豆蛋白胨的含量为2％(实施例2)时，单位时间内皮肤经皮水分散失量变化率最大，即皮肤屏障修复作用效果最好。

[0126] 测试例3：皮肤弹性测试

[0127] 测试样品：同测试例1。

[0128] 测试步骤：同测试例1。

[0129] 测试仪器：皮肤弹性测试仪MPA580(由德国CK公司生产)。

[0130] 变化率＝(使用后的平均值‑使用前的平均值)/使用前的平均值×100％。

[0131] 皮肤弹性R2值越高，说明皮肤的弹性越好。

[0132] 测试结果如表9和图6所示。

[0133] 表9使用精华液前，使用2、4周后皮肤弹性R2的结果汇总表

[0134]

[0135]

[0136] 测试结果表明，与常规的二裂酵母发酵产物溶胞产物相比，实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物具有更好的提高皮肤弹性的作用。当发酵培养基中大豆蛋白胨的含量为2％(实施例2)时，皮肤弹性R2值最高，说明皮肤的弹性最好。

[0137] 测试例4：抗皱性能测试

[0138] 测试样品：同测试例1。

[0139] 测试步骤：同测试例1。

[0140] 测试仪器：面部成像仪VISIA‑CR(由美国Canfield Scientific公司生产)。

[0141] 变化率＝(使用后的平均值‑使用前的平均值)/使用前的平均值×100％。

[0142] 皮肤皱纹面积占比越低，说明皱纹越不明显，产品的抗皱效果越好。

[0143] 测试结果如表10和图7所示。

[0144] 表10使用精华液前，使用2、4周后皱纹面积占比的结果汇总表

[0145]

[0146]

[0147] 测试结果表明，实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物具有更好的抗皱效果。当发酵培养基中大豆蛋白胨的含量为2％(实施例2)时，皮肤皱纹面积占比变化率最大，说明产品的抗皱效果最好。

[0148] 测试例5：修复屏障测试

[0149] 将二裂酵母发酵产物溶胞产物的屏障修复相关基因荧光定量PCR进行实验，评价二裂酵母发酵产物溶胞产物的屏障修复能力。

[0150] 测试样品：实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物水溶液、对比例1～3的二裂酵母发酵产物溶胞产物水溶液(浓度见表11)。

[0151] 表11细胞毒性测试浓度梯度设置表

[0152]

[0153] 测试细胞：角质形成细胞(购于广东博溪生物科技有限公司)。

[0154] 测试步骤：首先基于角质形成细胞开展样品细胞毒性测试，确定各样品在角质形成细胞上的最大安全给药剂量。其次，基于安全给药剂量，开展荧光定量PCR测试，评价样品在基因表达水平，对屏障修复是否具有提升功效，对结果进行统计分析，具体如下:

[0155] (1)细胞毒性测试

[0156] 细胞接种：按4×104个/孔的接种密度接种细胞至96孔板，于培养箱(37℃、5％CO2、95％相对湿度)中培养过夜。

[0157] 实验分组：实验设置空白对照组、阳性对照组与样品组。样品组中，每个样品设置8个浓度梯度，每个浓度梯度下设置3个重复孔。

[0158] 配液：按细胞毒性测试浓度梯度设置表(见表11)配制受试物工作液。

[0159] 给药：待96孔板中细胞铺板率达到40％～60％时进行给药。空白对照组每孔加入200μL细胞培养液；阳性对照组每孔加入200μL含4％DMSO的细胞培养液；样品组每孔加入
200μL含有相应浓度受试物的细胞培养液；调零孔无细胞接种，仅加入200μL细胞培养液。给药完成后将96孔板放置在培养箱(37℃、5％CO2、95％相对湿度)中培养。

[0160] 测试：细胞培养24h后，弃去上清液，加入MTT工作液(0.5mg/mL，现配现用)，37℃避光孵育4h，孵育结束后，弃去上清液，每孔加150μL含4％DMSO的细胞培养液，在490nm处读取OD值。

[0161] 细胞相对活力计算：根据公式计算，细胞相对活力＝(给药孔OD‑调零孔OD)/(空白对白对OD‑调零孔OD)*100％。

[0162] 由高到低设定8个给药浓度，在角质形成细胞上开展细胞毒性测试，细胞相对活力结果见表12。

[0163] 表12不同浓度下样品的细胞相对活力结果

[0164]

[0165] 选取细胞活力为80以上的浓度作为最大安全给药浓度，从表格中可以看出，最大安全给药浓度为10％时，实施例2～5的选择二裂酵母发酵产物溶胞产物溶液进行测试，细胞仍保持较高的活性，细胞仍在安全浓度范围内。

[0166] (2)荧光定量PCR测试

[0167] 细胞接种：按2.5×105/孔的密度接种细胞至6孔板中，于培养箱(37℃、5％CO2、95％相对湿度)中培养过夜。

[0168] 配液：按照荧光定量PCR测试的试验分组(见表13)进行受试物工作液的配置。

[0169] 表13荧光定量PCR测试分组

[0170]

[0171] 给药：根据表10的测试分组，每组设置3个重复孔，待6孔板中细胞的铺板率达到40％～50％时，进行分组给药，于培养箱(37℃、5％CO2、95％相对湿度)中培养24h。

[0172] 收集细胞：样品孵育培养24h后，用PBS溶液进行清洗，1mL/孔，清洗两次。清洗结束后，每孔加入1mL RNAiso Plus，吹打裂解细胞后，收集至1.5mL无酶EP管中，并保存至‑80℃冰箱。

[0173] 荧光定量PCR测试：根据RNAiso Plus说明书进行RNA提取操作，根据反转录试剂盒进行反转录操作，根据SYBR Premix Ex TaqTMII荧光染料(TaKaRa DRR081A)产品说明书进行荧光定量PCR反应体系配置及上机检测。

[0174] 结果计算：采用2‑AACT方法进行结果计算。

[0175] 荧光定量PCR测试结果如表14所示，基因变化趋势如图8所示。

[0176] 表14荧光定量PCR测试结果汇总

[0177]

[0178] 与空白对照组、相比，实施例2～5对比例1～3的样品对屏障相关基因TGM1、FLG、IVL和ABCA12的表达有显著的促进作用，说明实施例2～5提供的二裂酵母发酵产物溶胞产物具有更好的屏障修复效果。其中实施例2的二裂酵母发酵产物溶胞产物对于屏障相关基因TGM1、FLG、IVL和ABCA12的表达的促进作用最强，具有最好的屏障修复效果。

[0179] 测试例6：人体使用评价

[0180] 测试样品：同测试例1。

[0181] 测试步骤：选择年龄18～45岁健康的志愿者210名，每一样品30名志愿者。志愿者按习惯用量取出产品，均匀涂抹于面部肌肤，连续使用产品4周，每天使用产品2次。在样品使用前、使用第4周后对面部进行皮肤图像拍摄，数据记录为：使用前、使用4周后。志愿者通过问卷在使用前对面部肌肤进行初始肌肤状态评价，在使用第4周后对样品的使用感及效果进行程度评价。

[0182] 肌肤状态变化评分情况如表15所示。

[0183] 表15肌肤状态变化评分(满分为4分)

[0184]

[0185] 测试结果表明，含有实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物的精华液在使用过后，肌肤状态变化更加明显，志愿者的皮肤状态变得更好。实施例2二裂酵母发酵产物溶胞产物的肌肤状态变化各项评分均最高，使用后肌肤状态变化最优。

[0186] 使用4周的效果评价如表16所示。

[0187] 表16使用4周效果评价(人数、人数占比)

[0188]

[0189] 测试结果表明，含有实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物的精华液具有更好的收缩毛孔和提亮肤色的效果。其中实施例2二裂酵母发酵产物溶胞产物使用4周的效果评价相对最优。

[0190] 使用4周的总体效果评价如表17所示。

[0191] 表17使用4周总体效果评价(人数、人数占比)

[0192]

[0193] 测试结果表明，含有实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物的精华液总体效果评价更好。其中实施例2二裂酵母发酵产物溶胞产物使用4周的总体效果评价相对最优。

[0194] 测试例7：安全性测试

[0195] 眼刺激性测试参考《SN/T2329‑2009化妆品眼刺激性腐蚀性的鸡胚绒毛尿囊膜试验》。

[0196] 利用鸡胚绒毛尿囊膜实验，测试纳米乳液引起鸡胚绒毛尿囊膜毒性变化的能力，从而描述对纳米乳液潜在的眼刺激性要素和过程。绒毛尿囊膜(CAM)是一个呼吸性膜，包围在鸡胚周围。由于鸡胚绒毛尿囊膜表面血管丰富，可以看作一个完整的生物体，本实验利用孵化的鸡胚绒毛尿囊膜血管系统完整、清晰和透明的特点，将一定量的纳米乳液与鸡胚绒毛尿囊膜接触，作用规定时间最后观察绒毛尿囊膜毒性效应指标(如：出血、凝血和血管溶解的变化)，给予评分(IS)，计算数学平均值用于评估纳米乳液的眼刺激性。

[0197] 采用反应时间法计算刺激评分(IS)，计算公式如下：

[0198]

[0199] 式中：sec H(出血时间hemorrhage time)‑CAM膜上观察到开始发生出血的平均时间，单位为秒；sec L(血管溶血时间vessellysis time)‑CAM膜上观察到开始发生血管溶解的平均时间，单位为秒；sec C(凝血时间coagulation time)‑CAM膜上观察到开始发生凝血的平均时间，单位为秒。

[0200] 刺激评分法结果评价分类见表18。

[0201] 表18刺激评分刺激性分类

[0202]刺激评分 刺激性分类
IS<1 无刺激性
1≤IS<5 轻刺激性
5≤IS<9 中度刺激性
IS≥10 强刺激性/腐蚀性

[0203] 具体实验方法如下：

[0204] 测试对象为9日龄鸡胚。

[0205] 样品分别为实施例2～5和对比例1～3的二裂酵母发酵产物溶胞产物(20％的水溶液)。阴性对照组为生理盐水。阳性对照组为1％的十二烷基硫酸钠溶液(SDS溶液)。

[0206] 鸡胚的准备：将0日龄鸡蛋放入培养箱中培养9天(培养箱的温度为37.5℃，相对湿度为55％至70％)。选取血管发育良好的鸡胚，在蛋壳表面标记气室位置，分配好待测样品所需要的鸡蛋(一种样品用6只鸡胚，阴性对照用1只鸡胚，阳性对照用1只鸡胚)。

[0207] 进行测试：利用工具去掉标记的蛋壳部分。用吸管滴加0.9％氯化钠溶液(生理盐水)使蛋膜湿润，将氯化钠溶液倾出。小心地用镊子去掉内膜，保证血管不受损，观察鸡胚无明显出血或浑浊现象，即可判断可用于实验。取300μL受试物覆盖在绒毛尿囊膜上，作用3min后用生理盐水冲洗膜上的受试物，冲洗时间为30s。立刻观察绒毛尿囊膜反应，拍照记录鸡胚状态，结束观察。结果如表19所示。

[0208] 表19刺激性测试结果

[0209]名称 IS值 刺激性分类
实施例2 0.3 无刺激性
实施例3 0.4 无刺激性
实施例4 0.3 无刺激性
实施例5 0.3 无刺激性
对比例1 0.6 无刺激性
对比例2 0.5 无刺激性
对比例3 0.5 无刺激性

[0210] 上述结果表明，实施例2～5和对比例1～3的二裂酵母发酵产物溶胞产物均无眼刺激性，安全性较高。相较于对比例1～3的IS值，实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物IS值更低，这说明实施例2～5的二裂酵母发酵产物溶胞产物毒性更低。

[0211] 最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。