多巴胺转运蛋白在调控红火蚁工蚁个体分工中的应用

摘要

本发明公开了多巴胺转运蛋白在调控红火蚁工蚁个体分工中的应用。本发明发现红火蚁多巴胺转运蛋白dopamine transporter(DAT)在觅食型工蚁头部中表达较高，而育幼型工蚁中表达较低。通过饲喂觅食型红火蚁工蚁DAT蛋白的dsRNA，发现觅食型工蚁在下调DAT的表达后，活动距离、速率均显著变弱；且对红火蚁幼虫产生了育幼行为，效果显著。

权利要求

1.多巴胺转运蛋白的编码基因的dsRNA在调控红火蚁工蚁个体分工中的应用，所述的dsRNA是由以下序列转录而成：

GCTGATAAGGGGTGTCACTTTGCCGGGTAGTACCGAAGGGATTCGCTATTATCTCAGTCCAAATTTCAACGTTATCACAAAGGCAGAGGTATGGGTGGACGCGGCGACGCAGGTATTTTTCTCTCTAGGACCGGGATTCGGAGTGTTATTGGCTTACGCGAGCTACAACAAGTATCACAACAACGTTTACAAGGACGCCCTGCTGACGAGCTTGATTAACAGCGCGACGTCCTTCGTCGCCGGATTCGTCATATTTTCGGTGCTCGGTTACATGGCACGCGCCAGCGGCAAATCCATCCAGGATGTCGCGACGGAAGGACCCGGTCTGGTATTCATTGTCTATCCGGCGGCCATCGCTACAATGCCCGGCTCAACATTCTGGGCGCTCATCTTTTTCATGATGCTGCTCACACTCGGTTTAGACAGCTCGTTCGGAGGTTCGGAGGCAATTATAACGGCACTCAGCGACGAG；所述的调控红火蚁工蚁个体分工是调控红火蚁工蚁活动距离和速率降低；且对红火蚁幼虫产生了育幼行为。

说明书

多巴胺转运蛋白在调控红火蚁工蚁个体分工中的应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域，具体涉及多巴胺转运蛋白在调控红火蚁工蚁个体分工中的应用。

背景技术

[0002] 红火蚁(Solenopsis invicta)是世界上最重要的100种入侵生物之一，是一种对农业生态环境和公共安全造成严重威胁的外来有害生物(杨伟东，2005)。据报道，2003年红火蚁入侵至中国台湾(周卫川等，2005)，2004年入侵广东(曾玲，2005；张润志，2005)，截止目前已在华南、华东、西南地区扩散分布，对我国农林产业、人畜安全及生态安全造成了巨大危害(黄俊，2010)。红火蚁之所以扩散快、易暴发成灾，主要的一个原因在于其特殊的生物学特性和高度的社会合作，属于典型的社会性昆虫。红火蚁工蚁承担的分工与发育时间有关，随着工蚁羽化后成虫生长发育时间，它们逐渐可被分为具有照顾后代行为的“育幼蚁”(nurse)和负责巢外搜寻和觅食行为的“觅食蚁”(forager)(Cassill et al.,1999；Tschinkel etal.,2006)。前人研究表明，红火蚁工蚁的育幼、觅食功能有转化现象，除了信息素之外还具有一定的分子遗传基础。多巴胺(dopamine，DA)是一种广泛分布于脊椎动物和无脊椎动物体内的儿茶酚胺神经递质。在昆虫体内，DA调控着昆虫的学习、记忆、运动、选择(Zhang et al.,2007)、觅食(Huang et al.,2022)以及东亚飞蝗形态的转变等(Yang et al.,2014)。尽管多巴胺调控动物行为的研究成果较多，但在社会性昆虫中，仅在蜜蜂中有少数报道。前人研究表明，多巴胺参与调控了蜜蜂复杂的社会行为如运动、繁殖以及处女蜂王的打斗行为等(Mustard et al.,2010；Pignatelli et al.,2017)。同时，蜜蜂脑部多巴胺水平在蜜蜂取食的不同行为阶段也存在显著的差异(Huang et al.,2022)。多巴胺介导的红火蚁工蚁分工的功能尚未清楚。

[0003] 近年来，已有不少文献报道，社会性昆虫的个体分工受到一系列基因的调控。如西方蜜蜂Apis mellifera工蜂的分工与王浆的主蛋白基因和参与酶调节、神经功能及觅食行为相关的基因有密切关系(刘芳等，2015)；此外，巢内的育幼型和巢外的觅食型差异表达基因也被陆续鉴定出来，包括for基因(Ben‑Shahar,2002；Ingram et al.,2011)、卵黄蛋白基因Vg(Antonio et al.,2008)，Malvolio(mvl)(Ben‑Shahar,2004)和昼夜节律相关基因period(per)(Ingram et al.,2009)等。多巴胺转运蛋白(dopamine transporter,DAT)位于多巴胺能神经元末梢，是一种膜蛋白，属于Na+/Cl‑依赖性转运体基因家族。近年来的研究表明，通过Na+，K+‑ATP酶的供能，多巴胺从神经元中被释放后很快由DAT再摄取，所以DAT能调控突触间隙中多巴胺的有效浓度(梁艳等，2003)。在物种进化的过程中，DAT具有高度的保守性(Kobayashi et al.,2023)。虽然前期已经有部分研究结果初步表明了哺乳动物中DAT在调控多巴胺浓度和个体行为中的作用(Kenton et al.,2021；Threlfell et al.,2021)，然而红火蚁DAT介导工蚁个体分工的功能尚不清楚。

[0004] 红火蚁高繁殖速率和攻击特性使其具有进攻性入侵者的能力，而工蚁则更具攻击性，因此改变工蚁巢内外行为是有效降低危害的方式之一。自然环境下，添加含dsRNA的液体饵剂更容易通过社会性昆虫的交哺行为在整个蚁巢传递，从而降低工蚁出巢觅食能力及活动强度，达到害虫防治的目的。

发明内容

[0005] 本发明的目的是提供多巴胺转运蛋白在调控红火蚁工蚁个体分工中的应用。

[0006] 所述的多巴胺转运蛋白，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0007] SEQ ID NO.1：

[0008] 5’—ATGTCGTCGACAGTAGTAAAAAATGCCGCAAAGGACGTCACCGCCGGCGACG GCAGGGAGACCTGGTCGGGGAAGCTCGATTTCTTGTTGTCGGTCATCGGGTTCGCCGTCGATCTCGCTAATGTGTGGCGATTCCCGTACCTCTGCTACAAGAACGGTGGTGGTGCATTTCTGGTTCCCTATTGCATTATGTTGGTGGTCGGCGGTATTCCTCTGTTTTACATGGAGCTCGCTCTTGGTCAATTCAACAGGAAAGGTGCTATCACTTGTTGGGGTCGACTGGTACCGCTTTTCAAAGGTATCGGATACGCGGTCGTCCTAATCGCGTTTTACGTTGATTTCTACTATAACGTTATCATCGCCTGGTCACTTCGCTATTTCTTCGCCTCGTTCGCCACGATGCTGCCGTGGACCTCTTGCGACAACGACTGGAACACGCCGCTGTGCCGTGAGTTTGACGCGAACGTCTCGTATGCATTTGAGGATATGGCCAACGAGATAAATGAGAATTTTGGAAACACGACCCGACTCCTGGTCGATTTAGGATCAGATGCCGCTCAGAGCACAGCGGATAATCATACAAGCGCTGCGCATGAATACTTCAATCGCGCTATTCTGGAGCTGCATCAAAGCGAGGGCTTACACGATCTTGGTGCCATTAAGTGGGACATCGCGCTATGCTTGCTCGTGGTCTATCTGGTGTGCTACTTTTCTCTATGGAAGGGCATTTCAACTTCCGGCAAGGTAGTCTGGTTTACCGCACTTTTCCCTTATGCCGTTTTACTGATTTTGCTGATAAGGGGTGTCACTTTGCCGGGTAGTACCGAAGGGATTCGCTATTATCTCAGTCCAAATTTCAACGTTATCACAAAGGCAGAGGTATGGGTGGACGCGGCGACGCAGGTATTTTTCTCTCTAGGACCGGGATTCGGAGTGTTATTGGCTTACGCGAGCTACAACAAGTATCACAACAACGTTTACAAGGACGCCCTGCTGACGAGCTTGATTAACAGCGCGACGTCCTTCGTCGCCGGATTCGTCATATTTTCGGTGCTCGGTTACATGGCACGCGCCAGCGGCAAATCCATCCAGGATGTCGCGACGGAAGGACCCGGTCTGGTATTCATTGTCTATCCGGCGGCCATCGCTACAATGCCCGGCTCAACATTCTGGGCGCTCATCTTTTTCATGATGCTGCTCACACTCGGTTTAGACAGCTCGTTCGGAGGTTCGGAGGCAATTATAACGGCACTCAGCGACGAGTTTCCTTTAATCGGCAATAATCGTGAGGTCTTCGTGGCGTGTTTGTTCACCCTATACTTTTTGGTCGGACTGGCTTCTTGTTCACAGGGCGGGTTTTACTTTTTCCACTTGTTGGATCGATACGCGGCCGGGTACTCGATGCTGTTTGCCGTTCTGGCAGAAACAATTGCGGTCAGCTGGATCTATGGAACGGACCGATTTTGCGCCGATATTAAAGACATGATCGGATTCAAACCGGGCATCTACTGGCGAGTGTGCTGGAAATTCGTAGCACCTCTATTTCTTATGTTCATCATTGTCTATGGTCTAATGGGCTACGAACCATTATCGTACGAGGGCTACGTTTATCCAGTTTGGGCAAATATATTAGGCTGGCTGATCGCGTGCTCTTCTATTATTATGATCCCAGGTATGGCAATCTACAAAATCAGTAGCACATCCGGATCCTTTGTTCAAAGGTTGAAGATCCTAACGACACCATGGAGGGACACGCAGCATCAGAGGAACGATCTGTCCTCAGTGGCGAACGGCGCGATTCGTCGAAGTTTCCTGGCCGAGCAAGATTTCGAAATCACCAAGGATCACGCGTTAACTAAGGAACAAACGGAGGTAATGATTCAATCTAGAGAGGGTGTCAAGGGGAACGATCCACCCCCTGAGCCAGTCTAG—3’。

[0009] 优选，是多巴胺转运蛋白的编码基因的dsRNA在调控红火蚁工蚁个体分工中的应用。

[0010] 优选，所述的dsRNA序列如下所示：

[0011] GCTGATAAGGGGTGTCACTTTGCCGGGTAGTACCGAAGGGATTCGCTATTATCTCAGTCCAAATTTCAACGTTATCACAAAGGCAGAGGTATGGGTGGACGCGGCGACGCAGGTATTTTTCTCTCTAGGACCGGGATTCGGAGTGTTATTGGCTTACGCGAGCTACAACAAGTATCACAACAACGTTTACAAGGACGCCCTGCTGACGAGCTTGATTAACAGCGCGACGTCCTTCGTCGCCGGATTCGTCATATTTTCGGTGCTCGGTTACATGGCACGCGCCAGCGGCAAATCCATCCAGGATGTCGCGACGGAAGGACCCGGTCTGGTATTCATTGTCTATCCGGCGGCCATCGCTACAATGCCCGGCTCAACATTCTGGGCGCTCATCTTTTTCATGATGCTGCTCACACTCGGTTTAGACAGCTCGTTCGGAGGTTCGGAGGCAATTATAACGGCACTCAGCGACGAG。

[0012] 优选，所述的调控红火蚁工蚁个体分工是调控红火蚁的活动距离、速率均显著变弱；且对红火蚁幼虫产生了育幼行为。

[0013] 本发明相对于所有技术具有如下的优点及效果：

[0014] 本发明鉴定出一种调控红火蚁工蚁个体分工的蛋白，觅食型工蚁在下调DAT的表达后运动强度显著下降，并对红火蚁幼虫或蛹产生了育幼行为，从觅食型工蚁向育幼型工蚁发生转变，改变工蚁巢内外行为而达到害虫防治的目的。附图说明：

[0015] 图1是觅食型和育幼型工蚁中DAT的表达水平图

[0016] 图2是觅食型工蚁在饲喂DAT的dsRNA后活动距离、速率行为统计图[0017] 图3是觅食型工蚁在饲喂DAT的dsRNA后对幼虫的育幼行为统计图具体实施方式：

[0018] 下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

[0019] 实施例1

[0020] 搭置人工蚁巢，获取觅食型和育幼型工蚁：将供试虫源放入红火蚁蚁巢塑料饲养盒(380mm×300mm×200mm)中，该塑料盒作为人工蚁巢区，将水试管及食物放入另一塑料盒(380mm×300mm×200mm)内，该塑料盒作为觅食区，并在内壁涂抹Fluon。用直径10mm，长1.0m的硅胶管连接人工蚁巢区和觅食区。红火蚁工蚁需经过硅胶管才能从“蚁巢区”到“觅食区”开展取食活动，待形成稳定的人工蚁路后，将在觅食区取食的工蚁称为“觅食蚁“，而将在“蚁巢区”的人工蚁巢内照顾卵、幼虫蛹和蚁后的工蚁定义为“育幼蚁“。分别从人工蚁巢区和觅食区取样若干头觅食型和育幼型工蚁，重复3巢。

[0021] 总RNA的提取：取100头觅食型和育幼型工蚁的头部，液氮中研磨，用TRIzol法提取总RNA。

[0022] cDNA第一链的合成：利用反转录试剂盒(PrimeScriptTM RT reagent Kit)反转录成用于定量PCR的第一链模板，将1ug总RNA反转录为cDNA。

[0023] 定量PCR检测：利用KAPA SYBR FAST Universal qPCR Kit进行qPCR检测。DAT和内参基因RPS3的扩增引物如下：

[0024]

[0025] 结果显示，红火蚁觅食型工蚁头部中DAT的表达量显著高于育幼型工蚁。(图1)[0026] 实施例2

[0027] 下载获得红火蚁DAT基因序列(GenBank登录号：LOC105193284)，在序列保守区域及主要功能区域选取目的基因序列(489bp)设计合成该基因dsRNA(dsDAT)引物；以绿色荧光蛋白GFP基因的序列(GenBank登录号：AF324407.1)设计GFP基因的dsRNA(dsGFP)引物。

[0028]

[0029] 以实施例1的cDNA为模板，扩增目的片段并构建到T载体上。随后经转化，挑斑和摇菌，选取阳性克隆送公司进行测序，测序正确的菌液保存备用。

[0030] 将保存的菌夜进行摇菌活化，提取质粒，以质粒为模板进行后续步骤。

[0031] 以质粒为模板，用5’端连接有T7启动子的正反向引物PCR扩增目的基因，得到两端均连接有T7启动子序列的目的基因片段，以此作为dsRNA合成的模板。

[0032] 根据Promege T7转录试剂盒(T7 RiboMAXTM Express RNAi System)说明书合成双链RNA，即得合成的DAT的dsRNA和GFP的dsRNA。

[0033] 实施例3

[0034] (1)取若干圆柱形塑料盒(8cm×10cm)，其含一层4cm厚湿沙，以维持湿度，其上有一层2cm厚石膏层，塑料盒的内壁涂有聚四氟乙烯，分别放100头红火蚁觅食型工蚁到塑料盒内，饥饿处理24h。随后，将合成的DAT的dsRNA和25％含蓝色素的蜂蜜水混合进行饲喂，使其终浓度为1.0ug/ul，饲喂体积为20ul，饲喂4D，每天更换一次，重复3巢。同时，合成的GFP的dsRNA和25％含蓝色素的蜂蜜水作为对照。96H后，测试觅食型工蚁的运动距离、速率。取2.0cm的塑料培养皿，将单头觅食型工蚁放入培养皿内静置15min，用DV(Sony HDR‑XR500,Japan)录制试验区域内工蚁的运动轨迹，录制1.5h，用EthoVision XT14软件分析中段1h内工蚁的爬行轨迹和活动热图，记录爬行距离(厘米)和时间(秒)，计算运动速率(厘米/秒)。
统计16头。实验结果显示，与饲喂dsGFP的蜂蜜水相比，觅食型工蚁在取食添加了dsDAT的蜂蜜水之后，运动距离和速率显著降低(图2)，表明下调DAT的表达可使红火蚁觅食型工蚁的活动能力显著减弱。

[0035] (2)取3.5cm的塑料培养皿，将单头觅食型工蚁放入培养皿内静置15min，然后放入同巢幼虫1头，观察5min内该觅食型工蚁是否具有育幼行为。根据觅食型工蚁对幼虫的反应分为三类行为：叼住、触碰和忽视，分别统计5min之内上述三种行为的时间，统计50头。实验结果显示，与饲喂dsGFP的蜂蜜水相比，觅食型工蚁在取食添加了dsDAT的蜂蜜水之后，叼住幼虫的时间显著增加(图3)，出现了明显的育幼行为，表明下调DAT的表达可使红火蚁工蚁的行为从觅食型向育幼型转化。

[0036] 上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均因为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。