一种适用于毕赤酵母的4-异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法

摘要

本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种适用于毕赤酵母的4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法。本发明选用强组成型启动子PGCW14，并筛选了含有操纵基因CuO且具有启动活性的启动子PGCWCuO1；同时通过截短强启动子PGAP，筛选了可调控阻遏蛋白CymR适度表达的表达元件PGAP200/cymR。基于PGCWCuO1和PGAP200/cymR搭建新型毕赤酵母严谨性诱导表达系统。根据本申请的毕赤酵母诱导表达系统在表达重组蛋白时，以廉价的葡萄糖作为碳源和低浓度廉价无毒的4‑异丙基苯甲酸作为诱导剂，即可实现重组蛋白尤其是对毕赤酵母细胞有毒性的重组蛋白安全(56)对比文件Mullick A等.The cumate gene-switch: asystem for regulated expression inmammalian cells《.BMC Biotechnol》.2006,第6卷doi: 10.1186/1472-6750-6-43.Broussau S等.Packaging cells forlentiviral vectors generated using thecumate and coumermycin gene inductionsystems and nanowell single-cell cloning.《Mol Ther Methods Clin Dev》.2023,第40卷第40-57页.Kallunki T等.How to Choose the RightInducible Gene Expression System forMammalian Studies?《.Cells》.2019,第8卷(第8期),doi: 10.3390/cells8080796.

权利要求

1.一种适用于毕赤酵母的 4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统，其特征在于，所述诱导表达系统 包括含有操纵基因 CuO 且具有启动活性的启动子 PGCWCuO1  和阻遏蛋白 CymR 调控表达元 件 PGAP200/cymR，其中，所述启动子 PGCWCuO1 的核苷酸序列如 SEQ ID No:12 所示，所述阻遏蛋白 CymR 调控表达元件 PGAP200/cymR 的核苷酸序列如 SEQ ID No:21 所示。

2.一种在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

将含有操纵基因 CuO 且具有启动活性的启动子 PGCWCuO1 与目的蛋白的编码基因连接，使所述启动子 PGCWCuO1调控所述目的蛋白的编码基因的表达， 其中， 所述启动子 PGCWCuO1 的核苷酸序列如 SEQ ID No:12 所示；

将阻遏蛋白 CymR 调控表达元件 PGAP200/cymR、与所述目的蛋白的编码基因连接的所述启动 子 PGCWCuO1整合至毕赤酵母细胞的染色体，获得重组毕赤酵母细胞，其中，所述阻遏蛋白 CymR 调控表达元件 PGAP200/cymR的核苷酸序列如 SEQ ID No:21 所示；

向所述重组毕赤酵母细胞的培养基中添加 4‑异丙基苯甲酸，诱导表达重组目的蛋白。

3.根据权利要求 2 所述的在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：将含有操纵基因 CuO 且具有启动活性的启动子 PGCWCuO1 与含目的蛋白的编码基因的质粒连 接，再与阻遏蛋白 CymR 调控表达元件 PGAP200/cymR 连接，构建获得毕赤酵母的 4‑异丙基苯甲酸诱导表达质粒；

将所述毕赤酵母的 4‑异丙基苯甲酸诱导表达质粒导入毕赤酵母细胞中，获得重组毕赤酵母细胞；

向所述重组毕赤酵母细胞的培养基中添加 4‑异丙基苯甲酸，诱导表达重组目的蛋白。

4.根据权利要求 2 或 3 所述的在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法，其特征在于， 向所述重组毕赤酵母细胞的培养基中添加 4‑异丙基苯甲酸至 5μg/mL 150μg/mL。

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说明书

一种适用于毕赤酵母的4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导

表达方法

技术领域

[0001] 本发明涉及农业生物技术领域，具体涉及一种适用于毕赤酵母的4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统及诱导表达方法。

背景技术

[0002] 毕赤酵母是目前应用最广泛的重组蛋白表达宿主之一，超过4000种重组蛋白得以表达；随着合成生物学发展，毕赤酵母亦用作高效合成活性物质的底盘细胞。诱导型启动子可实现重组蛋白表达时序性表达，常用于重组蛋白（尤其是对表达宿主细胞有毒性的重组蛋白）表达和合成生物学中特定基因可调控性表达。毕赤酵母甲醇诱导启动子PAOX1以高强度转录和受甲醇严格诱导的优点得以普遍应用，但作为诱导剂的甲醇易燃易爆有毒在生产上存在较大的安全隐患。

[0003] 针对上述弊端，众多研究人员开展了PAOX1的改良工作，但并未取得满意结果。诸多文献中报道的其它诱导型启动子因转录强度低、严谨性差的缺点而未得以普遍使用。鼠李糖诱导型启动子PLRA3和PLRA4严格受鼠李糖诱导，其中PLRA3有较高的转录强度，可用于目的基因时序性表达，但作为碳源和诱导剂的鼠李糖因较高价格限制了该启动子的广泛应用。因而，开发价格低廉的、非甲醇诱导和非葡萄糖抑制的诱导型启动子在毕赤酵母中重组蛋白安全高效生产和合成生物学中有重要应用价值。

[0004] 来源于恶臭假单胞菌f1(pseudomonas putidaf1)的阻遏蛋白CymR可以结合在染色体上操纵基因CuO上，导致操纵基因CuO下游的基因不能转录，蛋白不能表达；4‑异丙基苯甲酸（Cumate）与CymR结合后，CymR从CuO上解离，从而使得操纵基因CuO下游的基因转录和表达。构建基于Cumate和CymR/CuO的诱导系统一般是将CuO嵌入组成型启动子序列的特定位置，从而构建含有CuO且具有生物学功能的启动子；在质粒或染色体上搭建由组成型启动子调控阻遏蛋白CymR适度表达的元件。依据这些元件构建的诱导表达系统在大肠杆菌、谷氨酸棒杆菌和哺乳细胞中均呈现严谨诱导而得到应用，但在有重要应用价值的酵母细胞中应用未有报道。

发明内容

[0005] 本申请的目的是提供适用于毕赤酵母的4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统。

[0006] 本申请的另一目的是提供在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法。

[0007] 根据本发明的适用于毕赤酵母的4‑异丙基苯甲酸诱导表达系统，包括含操纵基因有CuO且具有启动活性的启动子PGCWCuO1和实现阻遏蛋白CymR适度表达的调控表达元件PGAP200/cymR，其中，所述启动子PGCWCuO1的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示，所述阻遏蛋白CymR调控表达元件PGAP200/cymR的核苷酸序列如SEQ ID No:21所示。

[0008] 根据本发明的在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法，包括以下步骤：

[0009] 将含有操纵基因CuO且具有启动活性的启动子PGCWCuO1与目的蛋白的编码基因连接，使所述启动子PGCWCuO1调控所述目的蛋白的编码基因的表达，其中，所述启动子PGCWCuO1的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示；

[0010] 将阻遏蛋白CymR调控表达元件PGAP200/cymR、与所述目的蛋白的编码基因连接的所述启动子PGCWCuO1整合至毕赤酵母染色体，其中，所述阻遏蛋白CymR调控表达元件PGAP200/cymR的核苷酸序列如SEQ ID No:21所示；

[0011] 向所述重组毕赤酵母细胞的培养基中添加4‑异丙基苯甲酸，诱导表达重组目的蛋白。

[0012] 根据本发明的技术方案，涉及到两个功能元件，即调控阻遏蛋白CymR适度表达启动子和含有操纵基因CuO且有转录活性的调控目的基因表达的启动子，这两个元件同时存在于毕赤酵母染色体上时即可实现四‑异丙基苯甲酸诱导表达系统。本发明中将这两个元件构建于一个整合型质粒上，当质粒导入毕赤酵母细胞后，这两个元件整合于染色体同一位点（gas1位点）；亦可采用其它措施，使这两个片段先后整合于毕赤酵母染色体上。

[0013] 根据本发明的具体实施方式，本申请的在毕赤酵母中诱导表达重组蛋白的方法，包括以下步骤：

[0014] 将含操纵基因有CuO且具有启动活性的启动子PGCWCuO1与含目的蛋白的编码基因的质粒连接，再与阻遏蛋白CymR调控表达元件PGAP200/cymR连接，获得毕赤酵母的4‑异丙基苯甲酸诱导表达质粒，其中，所述启动子PGCWCuO1的核苷酸序列如SEQ ID No:12所示，所述阻遏蛋白CymR调控表达元件PGAP200/cymR的核苷酸序列如SEQ ID No:21所示；

[0015] 将所述毕赤酵母的4‑异丙基苯甲酸诱导表达导入毕赤酵母细胞中，获得重组毕赤酵母细胞；

[0016] 向所述重组毕赤酵母细胞的培养基中添加4‑异丙基苯甲酸至5 μg/mL 150 μg/~mL，诱导表达重组目的蛋白。

[0017] 根据本发明的技术方案，选用强组成型启动子PGCW14，并筛选了含操纵基因有CuO且具有启动活性的启动子PGCWCuO1；同时通过截短强启动子PGAP，筛选了可调控阻遏蛋白CymR适度表达的表达元件PGAP200/cymR。基于PGCWCuO1和PGAP200/cymR搭建新型毕赤酵母严谨性诱导表达系统。根据本申请的毕赤酵母诱导表达系统在表达重组蛋白时，以廉价的葡萄糖作为碳源和低浓度廉价无毒的4‑异丙基苯甲酸作为诱导剂，即可实现重组蛋白尤其是对毕赤酵母细胞有毒性的重组蛋白安全低成本生产。

[0018] 实现重组蛋白高效表达需要使用强组成型启动子，本发明在强组启动子PGCW14的基础上设计了诱导型启动子PGCWCuO1。在无阻遏蛋白CymR存在时，PGCWCuO1可实现下游基因的高效表达；在CymR存在时，CymR结合于PGCWCuO1上操纵基因CuO上，阻碍RNA聚合酶转录，从而阻遏下游基因表达。在诱导表达系统中，阻遏蛋白表达水平很大程度上决定了诱导表达的效果；阻遏蛋白表达水平过低，其不能与操纵基因有效结合，导致诱导表达系统呈现较高的渗漏表达；阻遏蛋白表达水平过高时，在添加诱导剂分子后仍有部分阻遏蛋白与操纵基因结合，从而阻遏目的基因表达，导致诱导表达强度不高。本发明中阻遏蛋白CymR调控表达元件PGAP200/cymR，其可实现阻遏蛋白CymR适度表达，在无诱导剂时CymR与操纵基因CuO充分结合，表达系统存在较低的渗漏表达；添加诱导剂后，诱导剂可与CymR重组结合，使其从操纵基因CuO上解离，进而实现目的基因高效表达。

附图说明

[0019] 图1显示操纵基因CuO在启动子PGCW14上嵌入位置，其中，A：启动子PGCWCuO1，B：启动子PGCWCuO2；

[0020] 图2显示不同菌株在YPD培养基生长的表型，其中，A：毕赤酵母GS115，B：染色体上整合PGCWCuO1调控gfp表达的毕赤酵母，C：染色体上整合PGCWCuO2调控gfp表达的毕赤酵母；

[0021] 图3显示不同菌株在含有不同浓度Cumate的液体MD培养基、不同培养时间时荧光强度 ，其中，50 bp、200 bp和480 bp分别是调控阻遏蛋白基因cymR表达的启动子PGAP的长度，培养基中Cumate浓度分别为0 μg/ml和25 μg/ml，诱导时间分别为16 h和36 h。

具体实施方式

[0022] 以下实施例中所用的菌株和培养基：毕赤酵母GS115（Pichia pastoris GS115）；YPD培养基（g/L）：酵母粉  10、蛋白胨 20、葡萄糖20；MD培养基参照文献（Current Genetics，2019，65：785–798）。
实施例1、含有CuO的PGCW14的设计

[0023] PGCW14是强组成型启动子，将其改造为诱导型启动子需要在特定位置嵌入可被阻遏蛋白CymR结合的操纵基因CuO；另一方面，嵌入CuO后启动子可能会失去基因转录启动活性。因此，需要优化获得嵌入CuO且有转录活性的PGCW14。

[0024] 真核生物启动子结构较原核生物启动子复杂，大部分包括核心启动子元件和上游调控元件。其中，核心启动子元件包括TATA框和转录起始点，保障RNA聚合酶的结合和DNA转录的起始。在原始启动子上嵌入外源DNA序列，会影响RNA聚合酶结合和转录效率。本发明构建可由4‑异丙基苯甲酸诱导的启动子，需要在强启动子PGCW14上嵌入阻遏蛋白CymR可结合的操纵基因CuO，而CuO插入位点选择及其对PGCW14转录活性的影响至关重要。在PGCW14的TATA序列之后嵌入操纵基因CuO，构建了PGCWCuO1；在PGCW14的TATA序列之前嵌入操纵基因CuO，构建了PGCWCuO2。

[0025] 1.1启动子PGCWCuO1构建

[0026] 1.1.1获得DNA片段PGCWL

[0027] 以毕赤酵母GS115染色体为模板，用引物PGCWL‑F1(SEQ ID No:1)、PGCWL‑R1(SEQ ID No:2)扩增PGCW14上1~727 bp的DNA片段PGCWL。

[0028] 1.1.2拼接获得含有CuO的DNA片段PGCWR1

[0029] 以PGCWR1‑F1(SEQ ID No:3)、PGCWR1‑F2(SEQ ID No:4)、PGCWR1‑F3(SEQ ID No:5)、PGCWR1‑R1(SEQ ID No:6)、PGCWR1‑R2(SEQ ID No:7)、PGCWR1‑R3(SEQ ID No:8)作为模板和引物进行PCR，此处，引物同时兼做模版，通过引物来拼接完整的DNA序列，拼接成含有CuO的DNA片段PGCWR1。

[0030] 1.1.3融合获得含有CuO的启动子PGCWCuO1

[0031] 以1.1.1步骤获得的PGCWL和1.1.2步骤获得的PGCWR1为模板，用引物PGCWL‑F1、PGCWR1‑R3进行Overlap‑PCR，将PGCWL和PGCWR1融合为含有CuO的全长PGCW14，将其命名为PGCWCuO1，CuO。

[0032] 1.2启动子PGCWCuO2构建

[0033] 1.2.1构建DNA片段PGCWR2

[0034] 以毕赤酵母GS115染色体为模板，用引物PGCWR2‑F1(SEQ ID No:9)、PGCWR2‑F2(SEQ ID No:10)、PGCWR2‑R(SEQ ID No:11)扩增含有CuO的DNA片段PGCWR2。

[0035] 1.2.2融合构建含有CuO的全长启动子PGCWCuO2

[0036] 以1.1.1步骤获得的PGCWL和1.2.1步骤获得的PGCWR2为模板，用引物PGCWL‑F1、PGCWR2‑R进行Overlap‑PCR，将PGCWL和PGCWR2融合为含有CuO的全长PGCW14，将其命名为PGCWCuO2。

[0037] 1.3启动子PGCWCuO1和PGCWCuO2转录活性验证

[0038] 为了检测PGCWCuO1（SEQ ID No:12）和PGCWCuO2（SEQ ID No:13）的转录活性，以绿色荧光蛋白基因gfp为报告基因的表达强度来表征。PGCWCuO1和PGCWCuO2分别经内切AscI和EcoR I酶切后与经相同内切酶处理的质粒pGHGAP/gfp连接（T4连接酶），从而构建分别有启动子PGCWCuO1和PGCWCuO2调控gfp表达的质粒pGCWCuO1/gfp和pGHGCWCuO2/gfp。质粒经内切酶SwaI处理后，按照Invitrogen公司毕赤酵母表达手册中转化方案进行毕赤酵母转化，并在MD培养基筛选转化子。将PCR验证的阳性转化子于YPD培养基上划线，观察菌体中绿色荧光强度。如图2所示，染色体上整合由PGCWCuO1调控gfp表达的菌株GS115‑pGCWCuO1/gfp成绿色（图2中的B），而对照菌株（毕赤酵母GS115）（图2中的A）和染色体上整合由PGCWCuO2调控gfp表达的菌株GS115‑pGCWCuO1/gfp则无绿色荧光（图2中的C）。结果表明，PGCWCuO1仍具有很好的转录活性，可以用于Cumate诱导系统的构建。实施例2、阻遏蛋白CymR表达强度调控单元的设计

[0039] 阻遏蛋白CymR通过结合启动子PGCWCuO1的CuO序列上阻遏下游基因转录，通过添加诱导剂Cumate的时间和剂量来调控CymR的解离和解离程度，从而调控下游基因表达强度。阻遏蛋白表达量过高，则需要将其从操纵基因上解离下来的诱导剂浓度较高；阻遏蛋白表达量过低，则会出现阻遏效应不强，在无诱导剂时出现渗漏表达。因而，控制阻遏蛋白表达强度亦是构建诱导表达系统的关键因素之一。

[0040] PGAP是常用的强组成型启动子，本发明中选用其来调控阻遏蛋白CymR表达。为了实现CymR不同强度的表达，通过启动子截短以构建含有起始密码子上游50 bp、200、480 bp的启动子PGAP50、PGAP200、PGAP480。随着启动子强度的降低，其转录活性逐渐降低，从而实现CymR不同强度的表达。

[0041] 以毕赤酵母染色体为模板，分别用正向引物PGAP480‑F(SEQ ID No:14)、PGAP200‑F(SEQ ID No:15)、PGAP50‑F(SEQ ID No:16)和反向引物PGAP‑R(SEQ ID No:17)扩增不同长度启动子PGAP480、PGAP200、PGAP50。在3’端加上蛋白核内定位信号的阻遏蛋白CymR的编码基因cymR‑nls。

[0042] 以酿酒酵母染色体为模板，用引物Tact‑F(SEQ ID No:18)、Tact‑R(SEQ ID No:19)扩增终止子Tact。以PGAP480、cymR‑nls和Tact为模板，用引物PGAP480‑F和Tact‑R进行Overlap‑PCR，搭建CymR表达单元PGAP480/cymR。同理，搭建CymR表达单元PGAP200/cymR和PGAP50/cymR。
实施例3、Cumate诱导系统构建与应用效果

[0043] 质粒pGCWCuO1/gfp经内切酶AscI处理后分别与阻遏蛋白CymR调控表达元件PGAP480/cymR（PGAP480/cymR ，SEQ ID No:20）、PGAP200/cymR（PGAP200/cymR，SEQ ID No:21）、PGAP50/cymR（PGAP50/cymR，SEQ ID No:22）进行无缝克隆，分别构建质粒pGAPGCW480/gfp‑cymR、pGAPGCW200/gfp‑cymR、pGAPGCW50/gfp‑cymR。上述质粒经内切酶SwaI处理后，转化毕赤酵母GS115，以MD培养基筛选转化子。转化子经PCR验证（引物为PGAP50‑F和通用引物3‑AOX1）后，筛选阳性转化子。分别挑选pGAPGCW480/gfp‑cymR、pGAPGCW200/gfp‑cymR和pGAPGCW50/gfp‑cymR上gfp和cymR表达单元整合于毕赤酵母GS115染色体的阳性转化子接种于液体YPD培养基，于30℃振荡培养至OD600~ 5。分别取100 μl 菌液接种于液体MD培养基中，于30℃振荡培养至OD600 为1，向培养基中添加Cumate至0 μg/ml和25 μg/ml后，16 h和36h测定菌液的OD600和绿色荧光值GFP，并GFP/ OD600数值的大小来表征细胞表达绿色荧光蛋白的强度。

[0044] 由图3可以看出，由PGAP50调控cymR表达时，在有或无诱导剂Cumate存在时，菌体已呈现较强的绿色荧光值，表明启动子长度过短导致了阻遏蛋白CymR不能有效表达，由PGCWCuO1调控gfp得以表达。由PGAP200调控cymR表达时，不添加诱导剂培养16 h和36 h后GFP/ OD600数值较低，表明在绿色荧光蛋白得以微弱表达，也说明阻遏蛋白CymR得以高效表达，其结合与启动子PGCWCuO1上的CuO，阻遏了绿色荧光蛋白的表达；添加诱导剂后GFP/ OD600数值显著升高，Cumate与CymR结合导致其从CuO上解离，由PGCWCuO1调控gfp得以表达。由PGAP480调控cymR表达时，添加或不添加诱导剂条件下GFP/ OD600数值均较低，这一现象来源于PGAP480有很强的转录活性，其使阻遏蛋白得以过量表达，即使添加25 μg/ml Cumate时，阻遏蛋白亦不能完全从CuO上解离下来，导致由PGCWCuO1调控gfp不能有效表达。

[0045] 液体MD培养基中含25 μg/ml Cumate时，菌体生长已会受到抑制；进一步提升Cumate浓度可能促进阻遏蛋白CymR从CuO上的解离，进而使得gfp表达，但菌体生长会受到明显抑制，因而不适用于实际生产中。值得注意的是，Cumate诱导浓度与毕赤酵母生长特性所使用的培养基有密切关联，以营养丰富的培养基（如YPD）培养毕赤酵母时，Cumate浓度提升到200 ug/ml时，毕赤酵母生长亦未受明显抑制。

[0046] 总体来讲，通过筛选阻遏蛋白CymR表达强度的启动子和构建含有操纵基因CuO且有转录活性的启动子，构建了4‑异丙基苯甲酸的毕赤酵母表达系统。此诱导表达系统使用廉价的葡萄糖为碳源和安全廉价低浓度的4‑异丙基苯甲酸为诱导剂即可实现重组蛋白低成本安全生产，亦可用于合成生物学中关键蛋白的时序性表达。

[0047] 以上实施例仅用于解释本申请的技术方案，不限定本申请的保护范围。