一种抗菌蛋白及其编码基因、应用、应用方法和产品

摘要

本发明涉及基因工程技术领域，公开了一种抗菌蛋白及其编码基因、应用、应用方法和产品；具体的，本发明公开一种抗菌蛋白，所述抗菌蛋白为单环刺螠抗菌蛋白，所述单环刺螠抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示；本发明在单环刺螠体内首次得到单环刺螠lumbricin基因，其不存在信号肽，与传统的lumbricin基因存在明显区别；本发明首次得到所述单环刺螠抗菌蛋白，与其他lumbricin基因的序列相似性不高；本发明公开的所述单环刺螠抗菌蛋白能够成功对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生抑制，所述单环刺螠抗菌蛋白可有效替代抗生素类药物，解决耐药性问题。

权利要求

1.一种抗菌蛋白，其特征在于，所述抗菌蛋白为单环刺螠抗菌蛋白，所述单环刺螠抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

2.一种抗菌蛋白的编码基因，其特征在于，所述编码基因为单环刺螠lumbricin基因，所述单环刺螠lumbricin基因为权利要求1所述的抗菌蛋白的编码基因。

3.权利要求1所述的抗菌蛋白和/或权利要求2所述的编码基因在抑制微生物中的应用；所述应用为非疾病治疗目的；所述微生物为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

4.权利要求1所述的抗菌蛋白和/或权利要求2所述的编码基因在制备抑制微生物产品中的应用；所述微生物为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

5.一种权利要求1所述的抗菌蛋白非疾病治疗目的的应用方法，其特征在于，所述应用方法包括：将微生物与权利要求1所述的抗菌蛋白混合；所述微生物为金黄色葡萄球菌或大肠杆菌。

6.一种抑制微生物的产品，其特征在于，所述产品为微生物抑制剂，所述微生物抑制剂含有权利要求1所述的抗菌蛋白。

说明书

一种抗菌蛋白及其编码基因、应用、应用方法和产品

技术领域

[0001] 本发明涉及基因工程技术领域，特别是涉及一种抗菌蛋白及其编码基因、应用、应用方法和产品。

背景技术

[0002] 自青霉素被发现以后，抗生素就作为治疗细菌感染性疾病的有力武器，被誉为现代医药的基石。然而抗生素滥用加速了细菌抗生素耐药性的产生，抗生素耐药性如果得不到有效控制，预测到2050年全球每年耐药感染的死亡人数可达1000万，造成的经济损失高达100万亿美元，抗生素耐药性已成为全球健康和发展的最大威胁之一，是世界范围内亟需解决的问题。因此，发现和开发抗生素替代品已经势在必行。

[0003] 抗菌蛋白是生物先天性免疫的重要组成部分，有关抗菌蛋白的抑菌机制表明，抗菌蛋白并非只有一种抑菌模式，不同的抗菌蛋白可以存在不同的作用方式，但抗菌蛋白只有接近或结合细胞膜时才具有功能。一般认为，与常规抗生素靶向细菌中特定蛋白受体中断代谢反应和细胞生长不同，抗菌蛋白的作用靶点是病原菌的细胞膜，而改变细菌细胞膜的结构需要大量的基因突变，因此细菌很难获得对抗菌蛋白的耐药性，这就为其在食品、医药和动物等领域的广泛应用提供了依据，成为抗生素最佳的替代品。

[0004] 海洋中蕴藏的经济动物和植物的群体数量，是有生命、能自行增殖和不断更新的海洋资源，海洋独特的环境以及丰富的生物多样性导致海洋生物抗菌蛋白具有独特的异于陆地生物抗菌蛋白的活性，成为科学家筛选新药的一大宝库，而且目前为止只开的海洋生物资源不足5%，大部分资源尚未开发，因此，开展海洋生物抗菌蛋白的研究是十分必要的。

[0005] 单环刺螠（Urechis unicinctus），是无管螠目刺螠科刺螠属无脊椎动物，是中国沿海唯一分布的无管螠目物种，体壁含有丰富的氨基酸和胶原蛋白，体内存在抗凝血肽、纤溶酶等多种生理活性物质，具有很高的食用和药用价值。目前还未见利用单环刺螠开发抗菌蛋白的报道。

发明内容

[0006] 有鉴于此，为了促进抗菌蛋白发展，解决由于抗生素滥用导致细菌抗生素耐药性加速产生，进而造成抗生素失效的问题，本发明提出了一种抗菌蛋白及其编码基因、应用、应用方法和产品，现采用如下技术方案：

[0007] 本发明提供一种抗菌蛋白，所述抗菌蛋白为单环刺螠抗菌蛋白，所述单环刺螠抗菌蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO：2所示。

[0008] 本发明还提供一种抗菌蛋白的编码基因，所述编码基因为单环刺螠lumbricin基因，所述单环刺螠lumbricin基因为所述的抗菌蛋白的编码基因。

[0009] 进一步的，所述单环刺螠lumbricin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

[0010] 本发明还提供所述的抗菌蛋白和/或所述的编码基因在抑制微生物中的应用。

[0011] 本发明还提供所述的抗菌蛋白和/或所述的编码基因在制备抑制微生物产品中的应用。

[0012] 进一步的，所述微生物为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

[0013] 进一步的，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。

[0014] 本发明还提供一种所述的抗菌蛋白的应用方法，所述应用方法包括：将所述微生物与所述的抗菌蛋白混合。

[0015] 进一步的，所述微生物为革兰氏阳性菌和/或革兰氏阴性菌。

[0016] 进一步的，所述革兰氏阳性菌为金黄色葡萄球菌；所述革兰氏阴性菌为大肠杆菌。

[0017] 本发明还提供一种抑制微生物的产品，所述产品为微生物抑制剂，所述微生物抑制剂含有所述的抗菌蛋白。

[0018] 本发明公开了一种抗菌蛋白及其编码基因、应用、应用方法和产品，与现有技术相比，其有益效果在于：

[0019] 本发明在单环刺螠体内首次得到单环刺螠lumbricin基因SEQ ID NO：1所示），单环刺螠lumbricin基因不存在信号肽，这与传统的lumbricin基因存在区别。本发明首次得到所述单环刺螠lumbricin基因表达的单环刺螠抗菌蛋白（SEQ ID NO：2所示），所述单环刺螠抗菌蛋白与其他lumbricin基因的序列相似性不高。

[0020] 本发明公开的所述单环刺螠抗菌蛋白能够成功对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌产生抑制，因此，所述单环刺螠抗菌蛋白可有效替代抗生素类药物，解决耐药性问题。

附图说明

[0021] 图1为本发明lumbricin基因的序列特征图；

[0022] 图2为本发明对SEQ ID NO.2所示的蛋白进行多序列比对结果图；

[0023] 图3为本发明umbricin基因的进化分析结果图；

[0024] 图4为本发明lumbricin基因的器官表达谱；

[0025] 图5为本发明LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的器官表达动力学分析结果图，其中，（a）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的体壁表达动力学分析结果图，（b）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的后肠表达动力学分析结果图，（c）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的肛门囊表达动力学分析结果图，（d）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的体腔液表达动力学分析结果图；

[0026] 图6为本发明lumbricin基因的表达载体示意图；

[0027] 图7为本发明单环刺螠lumbricin重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌动力学分析结果图，其中，（a）为单环刺螠lumbricin重组蛋白对大肠杆菌的抑菌动力学分析结果，（b）为单环刺螠lumbricin重组蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌动力学分析结果。

具体实施方式

[0028] 下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

[0029] 实施例1 lumbricin基因及其编码的蛋白

[0030] 单环刺螠体内首次得到lumbricin基因，其全长为454bp，序列如SEQ ID NO.1所示：

[0031] GACAGATGAACAAAGTTGGCAAGGAGGACAGAACTAAGAGAATTGCCCTCAAGGATGACGAGGTTGACAGGATCCAGGAACGCTTTGCTGGCGCACCGGCGAGAATTGAGATGTTCAGCCGCTACGAGCGCCAGAAGGACAAGCGTACCTATGAGGACCGCCATGTCGTCTTCCACGGCCCTACCTGGAAATACCCTGCTGCTCGTATTGCCCCATCCAAGATCGTCCGATGGGAGGAGGACACAGGACTGCCTATTTATGAGGAACTTGGTCAAGGTGCTGCCCCACTTCCGGAGCAGCCCGCCGCTGAATAAATGCAAGGTTCCCCAGTTTTGTCAAGTGCAACATCGCATCACTCATAAGTTCTCATTTCGTTCGACTCAATGCAGGACTTAATCGTTTTGTTGTACCATCCTTCCTTCGAATAAATGGATTATTGATGATAAAAAAAAAA。

[0032] 所述lumbricin基因含有一个长度为110bp的5’UTR（Untranslated Reagion，非编码区）和140bp的3’UTR，ORF（Open reading frame，开放阅读框）为204bp（大写字母表示）。

[0033] 所述长度为110bp的5’UTR的序列如SEQ ID NO.3所示：GACAGATGAACAAAGTTGGCAAGGAGGACAGAACTAAGAGAATTGCCCTCAAGGATGACGAGGTTGACAGGATCCAGGAACGCTTTGCTGGCGCACCGGCGAGAATTGAG。

[0034] 所述长度为140bp的3’UTR的序列如SEQ ID NO.4所示：ATGCAAGGTTCCCCAGTTTTGTCAAGTGCAACATCGCATCACTCATAAGTTCTCATTTCGTTCGACTCAATGCAGGACTTAATCGTTTTGTTGTACCATCCTTCCTTCGAATAAATGGATTATTGATGATAAAAAAAAAA。

[0035] 所述ORF的序列如SEQ ID NO.5所示：ATGTTCAGCCGCTACGAGCGCCAGAAGGACAAGCGTACCTATGAGGACCGCCATGTCGTCTTCCACGGCCCTACCTGGAAATACCCTGCTGCTCGTATTGCCCCATCCAAGATCGTCCGATGGGAGGAGGACACAGGACTGCCTATTTATGAGGAACTTGGTCAAGGTGCTGCCCCACTTCCGGAGCAGCCCGCCGCTGAATAA。

[0036] 所述lumbricin基因编码67个氨基酸的蛋白，序列如SEQ ID NO.2所示：

[0037] MFSRYERQKDKRTYEDRHVVFHGPTWKYPAARIAPSKIVRWEEDTGLPIYEELGQGAAPLPEQPAAE，其中含有7个脯氨酸，分子量为7814.78Da，理论等电点为6.08。序列特征图如图1所示。

[0038] 对SEQ ID NO.2所示的蛋白进行多序列比对，图2为序列比对结果图，结果表明脯氨酸和精氨酸位点具有高度的保守性，但是序列相似性不是特别高，与Lumbricus rubellus的lumbricin一致性只有63.5%。

[0039] 进化分析发现单环刺螠lumbricin基因与Eisenia andrei和Hirudo medicinalis的lumbricin基因聚为一支，与L. rubellus的蚯蚓素在不同的分支上，结果如图3所示。

[0040] 信号肽分析发现，单环刺螠lumbricin基因不存在信号肽，这也与传统的lumbricin基因存在区别。

[0041] 实施例2 lumbricin基因的提取以及重组蛋白的表达

[0042] 1、LPS应激处理及取样

[0043] 单环刺螠购买于山东省日照市石臼水产市场，产地为烟台近海潮间带，于实验室内通气人工海水(18℃、pH7 .8和盐度26)不投饵暂养三天后，挑取6只个体对体壁、肛门囊、中肠、后肠、肛门囊和体腔液进行取样，液氮冻存，‑80℃长期保存。剩余102只单环刺螠被平均分到PBS注射组和LPS注射组中，每个处理组中含有3个盛有30 L海水培养箱，每个培养箱放入17只海肠。LPS注射组注射150 μL LPS(0.5mg/ml)，而PBS注射组注射150 μL PBS作为对照，分别在注射3、6、24和48h对体壁、肛门囊、中肠、后肠、肛门囊和体腔液进行取样，液氮冻存，‑80℃长期保存用于RNA提取。

[0044] 2、RNA提取

[0045] 利用Trizol法提取RNA，取0.1 g单环刺螠组织(体腔液、体壁、中肠、后肠、肛门囊)加入到盛有1 ml Trizol的2 ml离心管中进行匀浆，加200 μl氯仿到盛有组织匀浆液的离心管中，剧烈震荡6‑8次，静置5 min，离心(4℃，12000 rpm，15 min)；取500 μl上清，加入等量预冷的异丙醇，温和上下颠倒混匀2‑3次，静置30 min，离心(4℃，12000 rpm，15 min)；弃上清，加入700 μl 75%乙醇吹打悬浮沉淀，离心(4℃，12000 rpm，10 min)；弃上清，吸掉残留液体，开盖使乙醇充分挥发；加入适量水使RNA沉淀溶解，分装稀释20倍；‑20℃保存，以备后续实验。

[0046] 3、反转录获得cDNA

[0047] 体系为2 μl RNase Free dH2O，2 μl 5×gDNA Eraser Buffer，1 μl gDNA Eraser，5 μl总RNA，42℃ 15 min去除基因组DNA反应完成。随后加入1 μl RNase Free dH2O，4 μl 5×gPrimerScript Buffer，4 μl RT Primer Mix，1 μl PrimerScript RT Enzyme Mix，37℃ 50 min；85℃ 5 sec获得cDNA。

[0048] 4、PCR获得单环刺螠lumbricin开放阅读框

[0049] 20 μl反应体系：2×PCR Mix：10 μl，2μM 正向引物：4 μl，2 μM反应引物：4 μl，cDNA模板：2 μl，以上反应体系混合均匀离心后，置于PCR仪中进行扩增。PCR扩增程序：预变性：98℃ 10 min；变性：95℃ 30 sec；退火：55℃ 30 sec；延伸：72℃ 30 sec；变性、退火、延伸过程循环35次；延伸：72℃ 10 min。随后对PCR产物进行测序验证。序列确定后利用Clustal X2程序进行单环刺螠lumbricin进行多序列比对，获得其保守位点，并结合MEGA7.0程序以邻位相连法进行进化分析。

[0050] 5、单环刺螠lumbricin器官表达分析

[0051] 将单环刺螠体壁、中肠、后肠、肛门囊和体腔液提取的RNA反转录为cDNA模板，利用SYBR Premix Ex Tap试剂盒在伯乐CFX Connect Real‑Time PCR仪器上进行qRT‑PCR检测。

[0052] 用到的引物为正向引物序列如SEQ ID NO.6所示ATGTTCAGCCGCTACGAG，反向引物为序列如SEQ ID NO.7所示GACGATCTTGGATGGGGCAA，反应体系为20 μl，包含10 μl TB Green Premix Ex TaqII (Tli RNaseH Plus) (2x)、4 μl正向引物(2 μM)、4 μl反向引物(2 μM)和2 μl cDNA。qRT‑PCR反应程序为95℃预变性10min；95℃变性 15sec，60℃退火和延伸1 min，40循环；随后进行溶解曲线反应验证产物扩增的特异性。以单环刺螠β‑actin（GenBank注册号：GU592178.1）作为内参基因，lumbricin在各个器官的相对表达量用2‑ΔΔCt来表示。

[0053] 如图4所示，lumbricin的mRNA在体壁中表达量最高，其次是后肠和中肠，然后是肛门囊，而体腔液中表达量最低，仅为体壁表达量的0.2%。

[0054] 6、单环刺螠LPS诱导下lumbricin表达动力学分析

[0055] 将LPS诱导3、6、24和48h的单环刺螠体壁、中肠、后肠、肛门囊和体腔液提取RNA并进行反转录获得cDNA，同样利用SYBR Premix Ex Tap 试剂盒在伯乐CFX Connect Real‑Time PCR仪器上进行qRT‑PCR检测，用到的引物为正向引物序列如SEQ ID NO.8所示ATGTTCAGCCGCTACGAG，反向引物序列如SEQ ID NO.9所示GACGATCTTGGATGGGGCAA，反应体系为20 μl，包含10 μl TB Green Premix Ex TaqII(Tli RNaseH Plus)(2x)、4 μl正向引物(2 μM)、4 μl反向引物(2 μM)和2 μl cDNA。qRT‑PCR反应程序为95℃预变性10min；95℃变性15 sec，60℃退火和延伸1 min，40循环；随后进行溶解曲线反应验证产物扩增的特异性。以单环刺螠β‑actin（GenBank注册号：GU592178.1）作为内参基因，lumbricin在LPS诱导后各器官的相对表达量用2‑ΔΔCt来表示。

[0056] 图5为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的器官表达动力学分析，其中，图5中的（a）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的体壁表达动力学分析结果图，图5中的（b）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的后肠表达动力学分析结果图，图5中的（c）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的肛门囊表达动力学分析结果图，图5中的（d）为LPS诱导下单环刺螠lumbricin基因的体腔液表达动力学分析结果图；如图5的结果所示，发现体壁和体腔液中lumbricin的mRNA的表达最先出现统计学差异，而体壁随后表达量恢复正常，而体腔液中持续增加，结果显示lumbricin与单环刺螠抗细菌先天免疫密切相关。

[0057] 7、单环刺螠lumbricin重组蛋白获得及纯化

[0058] 将ORF PCR验证获得的条带与pMD19‑T载体连接，按常规方法进行连接转化挑克隆，经过测序验证后提取含有的lumbricin pMD19‑T的质粒。

[0059] 采用利BamHI和XhoI限制性内切酶分别酶切含有单环刺螠lumbricin ORF的pMD19‑T质粒和pET28‑a质粒，酶切体系为：0.5 μl QuickCutBamHI，0.5 μl QuickCutXhoI，1 μl 10×QuickCut Green Buffer，4 μl质粒，4 μl水。

[0060] 回收纯化单环刺螠lumbricin ORF，与胶回收纯化的pET28‑a线性化质粒进行连接，连接体系为：5 μL pET28‑a线性化质粒，3 μL lumbricin ORF胶回收片段，1 μL T4 DNA连接酶，1 μl 10×T4 DNA Ligase Buffer，总体积为10 μL，16℃连接过夜，获得单环刺螠lumbricin基因的表达载体（如图6所示）。

[0061] 构建后的表达载体转化进大肠杆菌BL（DE3），菌液PCR和测序验证有进行诱导表达。当OD600达到0.6时，加入1 mM IPTG诱导重组蛋白的表达，19℃诱导，每2 h取样一次，过夜后，5000 g离心10 min收集菌体。用预冷的PBS缓冲液重悬菌体，采用Scientz JY92‑IID超声波细胞粉碎机以100W的功率在冰浴中超声破碎细菌15 min，随后4℃、13000g离心30 min，对上清和沉淀进行SDS‑PAGE分析检测。

[0062] 最后利用康为世纪的溶解蛋白试剂盒进行蛋白纯化，纯化过程：吸取1 ml镍柱到纯化柱中；加入5 ml灭菌水，沉淀后弃掉；加入10 ml Binding Buffer，沉淀后弃掉；2 ml上清与2 ml Binding Buffer混合后加入到纯化柱，沉淀后弃掉；加入15 ml Bingding Buffer沉淀后弃掉；加入6 ml Elution Buffer并收集获得蛋白。

[0063] 实施例3 单环刺螠重组蛋白抗菌分析

[0064] 选择革兰氏阴性菌(大肠杆菌)和革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌)进行抗菌分析。

[0065] 所有细菌在LB培养基（100 mL含有1 g NaCl，0.5 g酵母提取物，1 g胰蛋白胨）培养至OD600（600nm的吸光值）=0.5。

[0066] 将50 μl细菌培养物与50 μl单环刺螠lumbricin重组蛋白(PBS中50 μg)混合，置于96孔板中。阴性对照分别是在50 μl细菌培养物加入50 μl PBS和50 μl His‑tag重组物分离样品。

[0067] 利用酶标仪分别在1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11和12 h时间点读取600 nm的吸光值，然后绘制单环刺螠lumbricin重组蛋白对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌抑菌动力曲线。

[0068] 如图7所示，图7中的（a）为单环刺螠lumbricin重组蛋白对大肠杆菌的抑菌动力学分析结果，图7中的（b）为单环刺螠lumbricin重组蛋白对金黄色葡萄球菌的抑菌动力学分析结果，根据抑菌动力曲线来看，体外重组表达及其纯化后蛋白对大肠杆菌金黄色葡萄球菌的生长具有较好的抑制作用。

[0069] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。