天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化或美白皮肤产品中的应用转让专利
申请号 : CN202311474586.0
文献号 : CN117180164B
文献日 : 2024-01-30
发明人 : 王夜宇 , 张振兴 , 张旭辉 , 高琦
申请人 : 北京尧景基因技术有限公司
摘要 :
本发明涉及一种天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化或美白皮肤产品中的应用，抗氧化或美白皮肤产品包括I)~V）中的至少一种：I）促进DPPH自由基的清除的皮肤产品；II）抑制ROS产生的皮肤产品；III）抑制酪氨酸酶的活性的皮肤产品；IV）抑制细胞内黑色素的生成的皮肤产品；V）促进细胞增殖迁移的皮肤产品。本发明的天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡能够促进DPPH自由基的清除、能够抑制ROS的产生、能够抑制酪氨酸酶的活性、能够抑制细胞内黑色素的生成、能够促进细胞增殖迁移，天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在抗氧化和美白方面拥有着极好的效果。
权利要求 :
1.一种天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在制备抗氧化或美白皮肤产品中的应用；
所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡来源于天山雪莲紫色愈伤组织培养液；
所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡为主要活性成分。
2.根据权利要求1的应用，其特征在于，所述抗氧化或美白皮肤产品包括I）V）中的至~少一种：
I）促进DPPH自由基的清除的皮肤产品；
II）抑制ROS产生的皮肤产品；
III）抑制酪氨酸酶的活性的皮肤产品；
IV）抑制细胞内黑色素的生成的皮肤产品；
V）促进细胞增殖迁移的皮肤产品。
3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在产品
7 12
中的浓度为10 10 particles/mL。
~
4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在产品
9 12
中的浓度为10 10 particles/mL。
~
5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在产品
10 12
中的浓度为10 10 particles/mL。
~
6.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡采用如下方法制备：
1）将天山雪莲紫色愈伤组织进行光照培养，收集培养液；
2）从步骤1）的培养液中分离获得天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡，分离方法包括：收集上清、过滤收集滤液，将滤液浓缩，将浓缩液进行纯化，获得天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，过滤的滤膜孔径≥0.2μm；
和/或，浓缩采用中空纤维，中空纤维的截留分子量≥100KD；
和/或，步骤2）中，浓缩倍数为50 200倍。
~
8.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，滤膜孔径为0.45μm 1.5μm；
~
和/或，浓缩采用中空纤维，中空纤维的截留分子量100KD 750KD；
~
和/或，浓缩倍数为80 150倍。
~
9.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，滤膜孔径为0.8μm。
10.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，浓缩采用中空纤维，中空纤维的截留分子量为100KD 300KD。
~
11.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）中，浓缩倍数为100 150倍。
~
12.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，步骤2）中，收集上清时采用离心，离心条件为差速离心：分别依次采用300g‑1000g、2000g‑4000g、8000g‑10000g离心，前两次离心均是取上清液用于后续离心，第三次离心后取上清液用于过滤。
13.根据权利要求6至12任一所述的应用，其特征在于，步骤1）中，所述天山雪莲紫色愈伤组织通过将天山雪莲植株的幼茎或叶片组织诱导获得。
14.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，所述天山雪莲紫色愈伤组织经诱导获得，诱导培养基包括：以MS培养基为基础培养基，还添加有蔗糖18 22g/L、琼脂3 5g/L、奈乙~ ~酸3 4mg/L和6‑苄氨基嘌呤2 3mg/L，pH值为5.8 6.2。
~ ~ ~
15.根据权利要求13所述的应用，其特征在于，步骤1）中，光照培养的培养基为：以MS培养基为基础培养基，还添加有蔗糖27 33g/L、琼脂4 5g/L、奈乙酸2 3mg/L和6‑苄氨基嘌呤2~ ~ ~
3mg/L，pH值为4.8 5.2。
~ ~
说明书 :
天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化
或美白皮肤产品中的应用
技术领域
[0001] 本发明属于护肤品或药品技术领域，涉及一种天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化或美白皮肤产品中的应用，皮肤产品包括：I)促进DPPH自由基的清除的皮肤产品；II)抑制ROS的产生的皮肤产品；III）抑制酪氨酸酶的活性的皮肤产品；IV）抑制细胞内黑色素的生成的皮肤产品；V）促进细胞增殖迁移的皮肤产品。
背景技术
[0002] 天山雪莲是我国高山地区民间常用的一类名贵药用植物，是菊科凤毛菊属多年生草本植物。作为一种名贵的传统药材，因其显着的疗效受到越来越多的关注。多项研究表明，天山雪莲中含有多种酚类化合物，包括酚酸类、黄酮类和木脂素等。其中一些已被鉴定，例如：绿原酸、伞形酮、东莨菪素、紫丁香苷、牛蒡苷、芦丁和槲皮素。药理研究表明，天山雪莲具有很好的抗氧化、抗炎镇痛、活血化瘀和抗衰老、抗辐射等作用。
[0003] 因此人们做了许多以天山雪莲为原料的药用、美容、保健和食品产品。过去30年来人们对雪莲的兴趣日益浓厚，导致野生植物被过度采伐。如今雪莲几近绝迹，已被列为我国国家二级保护野生植物。通过植物细胞培养技术获取含有大量生物活性物质的天山雪莲细胞，是解决野生雪莲资源问题的一种有效方式，因具有不占用耕地、不受自然环境影响、生产可控等优势，受到学术界和工业界的广泛关注。
[0004] 天山雪莲细胞的培养方式主要有愈伤组织培养、悬浮细胞培养和毛状根培养。这些培养技术已经比较成熟，能够获得含有较高活性物质含量的细胞系，且能实现规模化培养。经过系统的成分研究，已确定了60余种化学成分。
[0005] 近年来研究发现植物细胞能够分泌一种类囊泡，直径在30‑500nm之间，其内选择性包裹脂质蛋白质、mRNA及miRNA等多种生物活性物质，具有明确的减轻组织损伤程度、促进损伤组织形态学及功能学修复的作用。
[0006] 在现有的植物类囊泡提取方案中，直接从植物愈伤组织或者整颗植株提取存在很多弊端。首先植物类囊泡的提取需要耗费大量的愈伤组织或者植株，而愈伤组织的培养或者植株的培养周期都很漫长少则数月多则数年，而且很多珍惜植物受国家保护已经无法采摘。其次，愈伤组织或者整株提取需要将其绞碎，对滤渣进行充分的过滤，操作繁杂耗时，纯度也比较低。此外由于植物渗透压差异性，采用磷酸盐缓冲液（PBS）在长时间的提取过程中可能因为渗透压差异而导致外泌体囊泡结构破裂，使得外泌体提取产量降低，无法发挥功效性。
发明内容
[0007] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的提取方法及其在制备抗氧化或美白皮肤产品中的应用。
[0008] 本发明针对现有技术中植物类囊泡提取上存在的各种缺陷提供了一种从天山雪莲紫色愈伤组织培养液中分离纯化类囊泡的方法，本发明大大简化了植物类囊泡的提取步骤，提高了类囊泡的纯度及产率，并且降低了生产成本，缩短了生产时间。而且本发明中的天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡具有比细胞提取物更加优异的功效，可促进DPPH自由基的清除，减少ROS的产生，抑制酪氨酸酶的活性，降低黑色素的产生水平，帮助皮肤有效抵抗光氧化，改善肤色，使皮肤更加美白焕亮。天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡中的活性物质有助于从肌肤内部深层发挥功效，抑制皮下色素沉积，有效改善皮肤的暗沉发黄问题。还可以增强细胞活力使受损肌肤快速修复，让皮肤状态更加健康稳定。
[0009] 解决方案
[0010] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0011] 第一方面，本发明提供一种天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在制备抗氧化或美白皮肤产品中的应用。
[0012] 进一步地，所述抗氧化或美白皮肤产品包括I）V）中的至少一种：~
[0013] I）促进DPPH自由基的清除的皮肤产品；
[0014] II）抑制ROS产生的皮肤产品；
[0015] III）抑制酪氨酸酶的活性的皮肤产品；
[0016] IV）抑制细胞内黑色素的生成的皮肤产品；
[0017] V）促进细胞增殖迁移的皮肤产品。
[0018] 进一步地，所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在产品中的浓度为107~
12 9 12 10 12
10 particles/mL，可选地为10 10 particles/mL，可选地为10 10 particles/mL。
~ ~
12 9 12 10 12
10 particles/mL，可选地为10 10 particles/mL，可选地为10 10 particles/mL。
~ ~
[0019] 进一步地，所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡来源于天山雪莲紫色愈伤组织培养液。
[0020] 进一步地，所述天山雪莲紫色愈伤组织采用如下方法制备：
[0021] 1）将天山雪莲紫色愈伤组织进行光照培养，收集培养液；
[0022] 2）从步骤1）的培养液中分离获得天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡，分离方法包括：收集上清、过滤收集滤液，将滤液浓缩（可选地采用切向流法浓缩），将浓缩液进行纯化，获得天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡。
[0023] 第二方面，提供一种天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的提取方法，包括如下步骤：
[0024] 1）将天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡进行光照培养，收集培养液；
[0025] 2）从步骤1）的培养液中分离获得天山雪莲愈伤组织类囊泡，分离方法包括：收集上清、过滤收集滤液，浓缩（可选地采用切向流法浓缩），纯化，获得天山雪莲愈伤组织类囊泡。
[0026] 上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，收集上清时采用离心，离心条件为差速离心：可选地，分别依次采用300g 1000g、2000g‑4000g、8000g‑10000g离心，前两次离心均是~取上清液用于后续离心，第三次离心后取上清液用于过滤。
[0027] 上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，过滤的滤膜孔径≥0.2μm，可选地≥0.45μm，可选地为0.45μm 1.5μm或为0.8μm。~
[0028] 上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，浓缩采用中空纤维，中空纤维的截留分子量≥100KD，可选地为100KD 800KD，可选地为100KD 750KD，可选地为100KD 300KD。~ ~ ~
[0029] 上述第一方面或第二方面中，步骤2）中，浓缩倍数为50 200倍或80 150倍或100~ ~ ~150倍。
[0030] 上述第一方面或第二方面中，步骤1）中，所述天山雪莲紫色愈伤组织通过将天山雪莲植株的幼茎或叶片组织诱导获得。
[0031] 上述第一方面或第二方面中，所述天山雪莲紫色愈伤组织经诱导获得，诱导培养基包括：以MS培养基为基础培养基，还添加有蔗糖18 22g/L、琼脂3 5g/L、奈乙酸3 4mg/L和~ ~ ~6‑苄氨基嘌呤2 3mg/L，pH值为5.8 6.2（优选地添加有蔗糖20g/L、琼脂5g/L、奈乙酸3mg/L~ ~
和6‑苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为6.0）。
和6‑苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为6.0）。
[0032] 进一步地，步骤1）中，光照培养的培养基为：以MS培养基为基础培养基，还添加有蔗糖27 33g/L、琼脂4 5g/L、奈乙酸2 3mg/L和6‑苄氨基嘌呤2 3mg/L，pH值为4.8 5.2（优选~ ~ ~ ~ ~地有蔗糖30g/L、琼脂4.5g/L、奈乙酸3mg/L和6‑苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为5.0）。
[0033] 进一步地，愈伤组织诱导培养方法包括：培养时间14 18天，培养温度为20 24℃，~ ~光照时间：7 9小时/天，光照强度：58 62mol/m·s；
~ ~
~ ~
[0034] 和/或，天山雪莲组织的无菌处理方法为：将天山雪莲新鲜植株的幼茎和/或叶片清洗、酒精杀菌、氯化汞杀菌，无菌水漂洗，无菌操作剪切为小块。
[0035] 进一步地，天山雪莲组织的无菌处理方法为：将天山雪莲新鲜植株的幼茎和/或叶片清洗，75%的酒精浸泡15s进行表面灭菌，将经酒精灭菌处理的幼茎和/或叶片浸泡0.1%氯化汞中浸泡4 6min，无菌水漂洗3 8次，无菌操作剪切为0.3 0.5cm小块。~ ~ ~
[0036] 进一步地，步骤2）中，天山雪莲紫色愈伤组织的光照培养方法为：培养时间14 18~天，培养温度为20 24℃，光照时间：7 9小时/天，光照强度：58 62mol/m·s；
~ ~ ~
~ ~ ~
[0037] 进一步地，步骤2）中，纯化的方法包括：将浓缩液通过PBS换液，通过SEC纯化柱纯化(纯化效果更好，也更容易实现工艺放大量产。)。
[0038] 进一步地，还包括步骤3），将天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡冷冻干燥。
[0039] 第三方面，提供如下I）V）中的至少一种皮肤产品，包括第二方面所述的提取方法~提取的天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡；
[0040] I）促进DPPH自由基的清除的皮肤产品；
[0041] II）抑制ROS的产生的皮肤产品；
[0042] III）抑制酪氨酸酶的活性的皮肤产品；
[0043] IV）抑制细胞内黑色素的生成的皮肤产品；
[0044] V）促进细胞增殖迁移的皮肤产品。
[0045] 可选地，所述天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在产品中的浓度为107~
12 9 12 10 12
10 particles/mL(可选地为10 10 particles/mL，可选地为10 10 particles/mL)。
~ ~
12 9 12 10 12
10 particles/mL(可选地为10 10 particles/mL，可选地为10 10 particles/mL)。
~ ~
[0046] 本发明的一种天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的制备方法为：
[0047] I）天山雪莲紫色愈伤组织培养：
[0048] 1）天山雪莲植物体的选择及无菌处理：
[0049] a)选择7月份海拔3500m以上的野生天山雪莲新鲜植株的幼茎及叶片用水清洗，再浸泡于蒸馏水中；
[0050] b)将清洗的幼茎及叶片用75%的酒精浸泡15s进行表面灭菌；
[0051] c)将经过酒精灭菌的幼茎及叶片置于0.1%氯化汞溶液中浸泡5min，浸泡过程中不断轻轻搅拌使植物体表面充分接触到氯化汞溶液；
[0052] d)将经过氯化汞溶液浸泡灭菌的植物体用高温灭菌处理的蒸馏水漂洗5遍，将植物体表面粘附的氯化汞溶液漂洗干净，再将植物体用无菌滤纸吸干水分；
[0053] e)用无菌剪刀将幼茎及叶片剪成0.3 0.5cm大小，无菌条件下，将上述表面灭菌处~理的材料，每瓶接种5块接种于诱导培养基中培养。
[0054] 2）天山雪莲紫色愈伤组织诱导培养：
[0055] 将经过无菌处理后的天山雪莲组织在诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养时间16天，培养温度22℃，光照时间8小时/天，光照强度60mol/m·s，所述的诱导培养基为：基本培养基MS+蔗糖20g/L+琼脂5g/L+α‑奈乙酸3mg/L+6‑苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为6.0。
[0056] 3）天山雪莲紫色愈伤组织的大规模培养：
[0057] 选取经过诱导培养产生的紫色愈伤组织，在大规模培养基中进行大规模培养。所述的大规模培养基为：基本培养基MS+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L+a‑萘乙酸3mg/L+6‑苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为5.0。在培养过程中收集愈伤组织培养液。
[0058] Ⅱ)天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡提取
[0059] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液进行梯度离心。首先300g‑1000g离心，取其上清，称为上清液I；然后，将上清液I，2000g‑4000g离心，取其上清，称为上清液II；再将上清液II，8000g‑10000g离心，取其上清，称为上清液III（即第三次离心的上清液）；最后将上清液III，依次使用0.2μm或0.8μm的滤膜过滤，收集滤液。
[0060] 使用切向流法将得到的滤液浓缩，具体的使用截流分子量为100Kd/300Kd/500Kd/750Kd的中空纤维将滤液浓缩到一定的体积后，用5‑10倍的PBS进行换液，得到溶剂为PBS的浓缩液。最后将得到的浓缩液通过SEC纯化柱纯化得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡。
[0061] 目前尚未有文献或专利报道过从天山雪莲紫色愈伤组织培养液中分离纯化类囊泡的方法，因此本专利发明了一种使用切向流和柱层析结合的方法从天山雪莲紫色愈伤组织培养液中提取类囊泡。
[0062] 有益效果
[0063] 1)本发明从天山雪莲紫色愈伤组织培养液中利用切向流和柱层析结合的方法实现了天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的大规模工业化生产。通过一系列的实验证明天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡在抗氧化和美白方面拥有着极好的效果。
[0064] 2）本发明公开的天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡提取方法简便，不仅缩短了生产周期降低了生产成本，所提取的类囊泡纯度和产量也得到了提升，适合用于放大生产。天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡是天然活性植物成分，生物安全性高，环境友好。
[0065] 3）本发明通过体外抗氧化实验对天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡和细胞提取物进行功效验证，发现天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡能够促进DPPH自由基的清除。本发明通过细胞实验对天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡和细胞提取物进行功效验证，发现天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡能够抑制ROS的产生。本发明通过细胞实验对天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡和细胞提取物进行功效验证，发现天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡能够抑制酪氨酸酶的活性。本发明通过细胞实验对天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡和细胞提取物进行功效验证，发现天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡能够抑制细胞内黑色素的生成。本发明通过细胞实验对天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡和细胞提取物进行功效验证，发现天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡能够促进细胞增殖迁移。
附图说明
[0066] 一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。
[0067] 图1：本发明测试例1的不同截流分子量的中空纤维提取的紫雪莲类囊泡的透射电镜图。
[0068] 图2：本发明的测试例1的紫雪莲类囊泡的SEC分析色谱图。
[0069] 图3：本发明的试验例1的紫雪莲类囊泡及细胞提取物的ROS清除实验，其中，A为紫9
雪莲类囊泡（10 Particles/mL），B为紫雪莲细胞提取物（0.3g/mL），C为紫雪莲细胞提取物（0.03g/mL）。
雪莲类囊泡（10 Particles/mL），B为紫雪莲细胞提取物（0.3g/mL），C为紫雪莲细胞提取物（0.03g/mL）。
[0070] 图4：本发明的试验例2的紫雪莲类囊泡及细胞提取物的DPPH自由基清除实验。
[0071] 图5：本发明的试验例3的紫雪莲类囊泡及细胞提取物的相对酪氨酸酶活性测定。
[0072] 图6：本发明的试验例4的紫雪莲类囊泡及细胞提取物的相对黑色素含量测定。
[0073] 图7：本发明的试验例5的天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡的促进人成纤维细胞迁移实验结果图。
具体实施方式
[0074] 为更好的说明本发明，现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。
[0075] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施案例仅是示例性的。
[0076] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。除非特殊说明，以下所用到的各种试剂均为商品化试剂，其中所用的化学试剂不低于分析纯。
[0077] 以下实施例中，天山雪莲紫色愈伤组织的培养方法为：
[0078] 天山雪莲紫色愈伤组织培养：
[0079] 1）天山雪莲植物体的选择及无菌处理：
[0080] a)选择7月份海拔3500m以上的野生天山雪莲新鲜植株的幼茎及叶片用水清洗，再浸泡于蒸馏水中；
[0081] b)将清洗的幼茎及叶片用75%的酒精浸泡15s进行表面灭菌；
[0082] c)将经过酒精灭菌的幼茎及叶片置于0.1%氯化汞溶液中浸泡5min，浸泡过程中不断轻轻搅拌使植物体表面充分接触到氯化汞溶液；
[0083] d)将经过氯化汞溶液浸泡灭菌的植物体用高温灭菌处理的蒸馏水漂洗5遍，将植物体表面粘附的氯化汞溶液漂洗干净，再将植物体用无菌滤纸吸干水分；
[0084] e)用无菌剪刀将幼茎及叶片剪成0.3 0.5cm大小，无菌条件下，将上述表面灭菌处~理的材料，每瓶接种5块接种于诱导培养基中培养。
[0085] 2）天山雪莲紫色愈伤组织诱导培养：
[0086] 将经过无菌处理后的天山雪莲组织在诱导培养基中进行愈伤组织诱导培养，培养时间16天，培养温度22℃，光照时间8小时/天，光照强度：60mol/m·s；所述的诱导培养基为：基本培养基MS+蔗糖20g/L+琼脂5g/L+α‑奈乙酸3mg/L+6‑苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为6.0。
[0087] 3）天山雪莲紫色愈伤组织的大规模培养：
[0088] 选取经过诱导培养产生的紫色愈伤组织，在大规模培养基中进行大规模培养。所述的大规模培养基为：基本培养基MS+蔗糖30g/L+琼脂4.5g/L+a‑萘乙酸3mg/L+6‑苄氨基嘌呤2mg/L，pH值为5.0。在培养过程中收集愈伤组织培养液。
[0089] 将愈伤组织培养液按照不同的方法分离获得天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡，部分实施例如下。
[0090] 实施例1
[0091] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0092] 将第三次离心收集的上清液用0.8μm的滤膜过滤。
[0093] 将过滤的滤清液通过截流分子量为100Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为5.4×10 Particles/mL。
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为5.4×10 Particles/mL。
[0094] 实施例2
[0095] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0096] 将第三次离心收集的上清液用0.8μm的滤膜过滤。
[0097] 将过滤的滤清液通过截流分子量为300Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为4.9×10 Particles/mL。
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为4.9×10 Particles/mL。
[0098] 实施例3
[0099] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0100] 将第三次离心收集的上清液用0.8μm的滤膜过滤。
[0101] 将过滤的滤清液通过截流分子量为500Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为3.7×10 Particles/mL。
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为3.7×10 Particles/mL。
[0102] 实施例4
[0103] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0104] 将第三次离心收集的上清液用0.8μm的滤膜过滤。
[0105] 将过滤的滤清液通过截流分子量为750Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为2.3×10 Particles/mL。
10
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为2.3×10 Particles/mL。
[0106] 对比例1：
[0107] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0108] 将第三次离心收集的上清液用0.2μm的滤膜过滤。
[0109] 将过滤的滤清液通过截流分子量为100Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为8.1×10Particles/mL。
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为8.1×10Particles/mL。
[0110] 对比例2：
[0111] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0112] 将第三次离心收集的上清液用0.2μm的滤膜过滤。
[0113] 将过滤的滤清液通过截流分子量为300Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为6.4×10Particles/mL。
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为6.4×10Particles/mL。
[0114] 对比例3：
[0115] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0116] 将第三次离心收集的上清液用0.2μm的滤膜过滤。
[0117] 将过滤的滤清液通过截流分子量为500Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为5.7×10Particles/mL。
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为5.7×10Particles/mL。
[0118] 对比例4：
[0119] 收集天山雪莲紫色愈伤组织的培养液5L，然后梯度离心，梯度离心方法为：首先300g，离心10min，收集上清液，弃掉沉淀。然后再将收集的上清液2000g，离心20min，收集上清液，弃掉沉淀。最后将收集的上清液10000g，离心30min，收集上清液。
[0120] 将第三次离心收集的上清液用0.2μm的滤膜过滤。
[0121] 将过滤的滤清液通过截流分子量为750Kd的中空纤维浓缩至50mL，使用250mL的1xPBS换液，最后将50mL的浓缩液通过SEC纯化柱纯化，得到天山雪莲紫色愈伤组织类囊泡
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为4.9×10Particles/mL。
9
50mL，经纳米颗粒跟踪分析(NTA)测定粒子浓度为4.9×10Particles/mL。
[0122] 对比例5：
[0123] 将上述培养的天山雪莲紫色愈伤组织细胞冷冻干燥得到天山雪莲紫色愈伤组织细胞粉末，冷冻干燥的方法为：‑80℃预冻2h，之后放入冷冻干燥机中真空冷冻干燥16h。称量20g上述冷冻干燥的天山雪莲紫色愈伤组织细胞粉末加入到400mL的50%乙醇溶液中处理12h，然后再加入1%的果胶酶，1%的纤维素酶，50℃条件下利用柠檬酸和氢氧化钠调节pH为
4，酶解3h，之后100℃热回流3h，冷却后，用0.45μm的滤膜抽滤，收集滤液，再次冷冻干燥得到天山雪莲紫色愈伤组织细胞粉末。
4，酶解3h，之后100℃热回流3h，冷却后，用0.45μm的滤膜抽滤，收集滤液，再次冷冻干燥得到天山雪莲紫色愈伤组织细胞粉末。
[0124] 测试例1
[0125] 将实施例1 4、对比例1 4提取的类囊泡进行透镜电镜观察，结果如图1。~ ~
[0126] 图1的结果表明，在实验过程中选用0.8μm的滤膜效果更佳，选用0.2μm的滤膜抽滤会导致类囊泡粒子浓度降低，说明很多囊泡在抽滤的过程中损失掉，并且由于滤膜孔径小，抽滤的过程中很容易堵塞，需要频繁更换滤膜增加了操作的复杂性。
[0127] 而在实施例1 4中使用切向流法（切向流法：是指液体流动方向与过滤方向呈垂直~方向的过滤形式）浓缩的过程中四种不同截留分子量的中空纤维100Kd/300Kd/500Kd/
750Kd浓缩效果差别不大，其中使用100kd中空纤维浓缩后囊泡粒径分布范围较广，由透射电镜图可以看到20nm至200nm均有分布，并且产生的杂质比较多；而使用750kd中空纤维浓缩后粒子浓度显著减少，从透射电镜图中也可看出粒子数明显减少且粒径集中在100nm至
160nm之间，粒径低于100nm的类囊泡几乎完全损失；使用500kd中空纤维浓缩虽然保留了一些小粒径的类囊泡，但是也损失了较多的类囊泡；因此选用300kd中空纤维即实施例2效果最佳，粒径主要集中在50nm至170nm，类囊泡几乎没有损失。
750Kd浓缩效果差别不大，其中使用100kd中空纤维浓缩后囊泡粒径分布范围较广，由透射电镜图可以看到20nm至200nm均有分布，并且产生的杂质比较多；而使用750kd中空纤维浓缩后粒子浓度显著减少，从透射电镜图中也可看出粒子数明显减少且粒径集中在100nm至
160nm之间，粒径低于100nm的类囊泡几乎完全损失；使用500kd中空纤维浓缩虽然保留了一些小粒径的类囊泡，但是也损失了较多的类囊泡；因此选用300kd中空纤维即实施例2效果最佳，粒径主要集中在50nm至170nm，类囊泡几乎没有损失。
[0128] 实施例1 4、对比例1 4纯化后获得的类囊泡粒子浓度如表1：~ ~
[0129] 。
[0130] 将实施例2的类囊泡液进行SEC色谱分析，结果如图2，SEC分析色谱图表明实施例2提取的类囊泡粒径均一。
[0131] 采用实施例2所得的类囊泡进行功效试验：
[0132] 功效实验
[0133] 试验例1：紫雪莲类囊泡及细胞提取物的ROS清除率的测定
[0134] 取对数生长期的HaCaT细胞(来源于ATCC)接种到12孔细胞培养板中，每孔接种2×5
10个细胞，培养24h，使细胞贴壁。
10个细胞，培养24h，使细胞贴壁。
[0135] 将实施例2中得到的紫雪莲类囊泡用DMEM完全培养基稀释成109Particles/mL的9
溶液，即10Particles/mL的紫雪莲类囊泡液。
溶液，即10Particles/mL的紫雪莲类囊泡液。
[0136] 将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用DMEM完全培养基依次稀释成0.03g/mL、0.3g/mL的溶液，分别记为0.03g/mL紫雪莲细胞提取物、0.3g/mL紫雪莲细胞提取物。
[0137] 将12孔细胞培养板中的培养液吸出，用PBS洗一遍细胞，分别加入1mLDMEM完全培9
养基（用于作为对照组和空白组）、1mL的10 Particles/mL紫雪莲类囊泡液或不同浓度的（0.03g/mL、0.3g/mL）紫雪莲细胞提取物溶液（作为实验组）。
养基（用于作为对照组和空白组）、1mL的10 Particles/mL紫雪莲类囊泡液或不同浓度的（0.03g/mL、0.3g/mL）紫雪莲细胞提取物溶液（作为实验组）。
[0138] 孵育24h后将培养上清吸出，每孔加400μL胰酶将细胞消化下来，加800μLDMEM完全培养基终止，进行如下操作：
[0139] 1）将细胞悬液转移至1.5mL离心管中。
[0140] 2）500g离心5min，弃掉上清液。实验组加入100μL染液吹打混匀，37℃避光孵育60min，对照组和空白组不加染液直接加等体积PBS。
[0141] 3）每管加900μLPBS清洗，500g离心5min，弃掉上清。实验组和对照组分别加入200μL200μM的H2O2，孵育30min；空白组不加H2O2，加入等体积的培养基孵育。
[0142] 4）再次加900μLPBS清洗，500g离心5min，弃掉上清。然后加200μLPBS重悬。流式细胞仪检测平均荧光强度。
[0143] ROS的清除率计算公式如下：
[0144] 。
[0145] 式中：T为实验组样品荧光强度；C为对照组（+H2O2刺激）的荧光强度；C0为空白组的荧光强度。
[0146] 结果如图3和表2所示。
[0147] 表2各实验组、空白组和对照组的荧光强度和ROS清除率
[0148] 。
[0149] 结果如图3和表2所示，通过H2O2刺激HaCaT细胞建立ROS高表达细胞模型，与空白组相比，对照组因加入H2O2刺激荧光强度显著增强。以实验组与加入H2O2刺激的对照组的差异作为样本下调ROS能力的指标，差异越大，样本清除ROS的能力越好。加入紫雪莲类囊泡和紫雪莲细胞提取物后荧光强度均有不同程度的降低，说明紫雪莲类囊泡和紫雪莲细胞提取物9
均具有不同程度的ROS抑制作用，与不同浓度的紫雪莲细胞提取物相比，10Particles/mL的紫雪莲类囊泡的ROS清除率达35.07%，具有更佳的抑制效果。
均具有不同程度的ROS抑制作用，与不同浓度的紫雪莲细胞提取物相比，10Particles/mL的紫雪莲类囊泡的ROS清除率达35.07%，具有更佳的抑制效果。
[0150] 试验例2、紫雪莲类囊泡及细胞提取物的DPPH自由基清除率的测定
[0151] 首先将DPPH试剂盒中的DPPH试剂，配置成0.1mM的乙醇溶液。然后配制10%的TritonX‑100裂解液。
[0152] 将实施例2中得到的紫雪莲类囊泡用PBS依次稀释成108、109、1010Particles/mL的溶液。将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用PBS依次配制成0.03、0.3、3g/mL的溶液。在上述6种溶液中加入10%的TritonX‑100裂解液，使TritonX‑100终浓度为1%。混匀后，室温孵育60min，每种溶液均分为实验组和空白对照组：实验组中每组分别取溶液200μL并分别加入200μLDPPH乙醇溶液，空白对照组中每组分别取溶液200μL并加入200μL乙醇。对照组为200μLPBS加入200μlDPPH乙醇溶液，每组做3次平行实验，避光，室温孵育30min，使用酶标仪测517nm处吸光度值。
[0153] 。
[0154] 式中：A为实验组的吸光度值；B为空白对照组的吸光度值；C为对照组的吸光度值；
[0155] 实验结果如图4和表3所示，紫雪莲类囊泡和紫雪莲细胞提取物均具有促进DPPH自10
由基清除的作用，随着浓度的增加清除效果越显著。10 Particles/mL的紫雪莲类囊泡与
3g/mL的紫雪莲细胞提取物相比具有相当的自由基清除率，均达到50%以上，即，紫雪莲细胞提取物要达到较好的自由基清除率时浓度需到3g/mL，这将会导致紫雪莲细胞提取物在化妆品的添加剂量过高，极大影响化妆品的配制，而本发明提供的紫雪莲类囊泡浓度
10
10 Particles/mL（约30μg/mL）就能很好地促进DPPH自由基的清除，具有很好的抗氧化作用。
由基清除的作用，随着浓度的增加清除效果越显著。10 Particles/mL的紫雪莲类囊泡与
3g/mL的紫雪莲细胞提取物相比具有相当的自由基清除率，均达到50%以上，即，紫雪莲细胞提取物要达到较好的自由基清除率时浓度需到3g/mL，这将会导致紫雪莲细胞提取物在化妆品的添加剂量过高，极大影响化妆品的配制，而本发明提供的紫雪莲类囊泡浓度
10
10 Particles/mL（约30μg/mL）就能很好地促进DPPH自由基的清除，具有很好的抗氧化作用。
[0156] 表3紫雪莲类囊泡和紫雪莲细胞提取物的DPPH自由基清除率
[0157] 。
[0158] 试验例3、紫雪莲类囊泡及细胞提取物的相对酪氨酸酶活性测定
[0159] 取对数生长期的B16细胞，接种到6孔细胞培养板中，每孔接种2×105个细胞，培养24h，使细胞贴壁。
[0160] 用1640完全培养基将熊果苷配制成3g/mL的溶液。
[0161] 将实施例2中得到的紫雪莲类囊泡用1640完全培养基依次稀释成108、9
10Particles/mL的溶液。将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用1640完全培养基依次稀释成0.003、0.03、0.3g/mL的溶液。将6孔细胞培养板中的培养液吸出，用PBS洗一遍细胞，分别加入2mL1640完全培养基（作为对照组）、熊果苷溶液（作为阳性对照组）、不同浓度的紫雪莲类囊泡溶液或紫雪莲细胞提取物溶液（作为实验组），每组做3次平行实验，换液后放回培养箱继续培养48h，然后吸出培养液，将细胞用PBS洗一次，每孔加入500μL胰酶将细胞消化下来，加入1000μL培养基终止消化，将细胞悬液转移至1.5mL离心管中用细胞计数仪计数，然后13000rpm离心5min，弃掉上清液。
10Particles/mL的溶液。将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用1640完全培养基依次稀释成0.003、0.03、0.3g/mL的溶液。将6孔细胞培养板中的培养液吸出，用PBS洗一遍细胞，分别加入2mL1640完全培养基（作为对照组）、熊果苷溶液（作为阳性对照组）、不同浓度的紫雪莲类囊泡溶液或紫雪莲细胞提取物溶液（作为实验组），每组做3次平行实验，换液后放回培养箱继续培养48h，然后吸出培养液，将细胞用PBS洗一次，每孔加入500μL胰酶将细胞消化下来，加入1000μL培养基终止消化，将细胞悬液转移至1.5mL离心管中用细胞计数仪计数，然后13000rpm离心5min，弃掉上清液。
[0162] 根据酪氨酸酶活性检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）的说明书，检测各样本的吸光度值：
[0163] 1）按照500万个细胞/1mL的比例在各组中加入酪氨酸酶活性检测试剂盒（购自北京索莱宝科技有限公司）中的提取液，超声波破碎细胞（功率200w，超声3s，间隔10s，重复30次），‑80℃冻融一次，12000g，4℃离心20min，取上清液，置冰上待测。
[0164] 2）取96孔板，每孔加入20μL样本，180μL酪氨酸酶活性检测试剂盒中的试剂一，迅速吹打混匀，用酶标仪测475nm处的吸光度值A1，迅速置于37℃培养箱中60min，拿出后迅速测定60min时的吸光值A2，计算ΔA=A2‑A1。
[0165] 。
[0166] 式中：ΔA1为实验组或阳性对照组的吸光度差值；ΔA2为对照组的吸光度差值；
[0167] 实验结果如图5和表4所示，与对照组相比加入不同浓度紫雪莲类囊泡后相对酪氨9
酸酶活性均有所降低，且10Particles/mL的紫雪莲类囊泡相对酪氨酸酶活性低至50.36%，比阳性对照（79.36%）具有更好的抑制酪氨酸酶活性的效果。而紫雪莲细胞提取物没有显示出明显的抑制酪氨酸酶活性的功能。这表明本申请提供的紫雪莲类囊泡具有比紫雪莲细胞提取物更好的抑制酪氨酸酶活性的作用，具有很好的美白功效。
酸酶活性均有所降低，且10Particles/mL的紫雪莲类囊泡相对酪氨酸酶活性低至50.36%，比阳性对照（79.36%）具有更好的抑制酪氨酸酶活性的效果。而紫雪莲细胞提取物没有显示出明显的抑制酪氨酸酶活性的功能。这表明本申请提供的紫雪莲类囊泡具有比紫雪莲细胞提取物更好的抑制酪氨酸酶活性的作用，具有很好的美白功效。
[0168] 表4紫雪莲类囊泡、紫雪莲提取物的相对酪氨酸酶活性
[0169] 。
[0170] 试验例4、紫雪莲类囊泡及细胞提取物的相对黑色素含量测定
[0171] 取对数生长期的B16细胞，接种到12孔细胞培养板中，每孔接种2×104个细胞，培养24h，使细胞贴壁。将实施例2中得到的紫雪莲类囊泡用DMEM完全培养基稀释成9
10Particles/mL的溶液，将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用DMEM完全培养基依次稀释成0.003、0.03、0.3g/mL的溶液，将稀释的紫雪莲类囊泡及细胞提取物用于作为实验组。
称取一定量曲酸用DMEM完全培养基配制成200μg/mL的溶液作为阳性对照组。将12孔细胞培养板中的培养液吸出，用PBS洗一遍细胞，分别加入1mLDMEM完全培养基（作为对照组）、200μg/mL曲酸溶液（作为阳性对照组）、不同浓度的紫雪莲类囊泡溶液或紫雪莲细胞提取物溶液（作为实验组）。换液后继续放回培养箱培养48h。然后每孔加入200μL胰酶将细胞消化下来，
15000g离心10min后，用移液枪吸出上清弃掉。加入500μLPBS清洗细胞一次后，再次离心。之后加入200μL1mol/LNaOH，放入水浴锅80℃加热60min溶解细胞。结束后吸取100μL液体到96孔板中，另取100μL1mol/LNaOH作为空白对照组。通过酶标仪于测量405nm处吸光值。
10Particles/mL的溶液，将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用DMEM完全培养基依次稀释成0.003、0.03、0.3g/mL的溶液，将稀释的紫雪莲类囊泡及细胞提取物用于作为实验组。
称取一定量曲酸用DMEM完全培养基配制成200μg/mL的溶液作为阳性对照组。将12孔细胞培养板中的培养液吸出，用PBS洗一遍细胞，分别加入1mLDMEM完全培养基（作为对照组）、200μg/mL曲酸溶液（作为阳性对照组）、不同浓度的紫雪莲类囊泡溶液或紫雪莲细胞提取物溶液（作为实验组）。换液后继续放回培养箱培养48h。然后每孔加入200μL胰酶将细胞消化下来，
15000g离心10min后，用移液枪吸出上清弃掉。加入500μLPBS清洗细胞一次后，再次离心。之后加入200μL1mol/LNaOH，放入水浴锅80℃加热60min溶解细胞。结束后吸取100μL液体到96孔板中，另取100μL1mol/LNaOH作为空白对照组。通过酶标仪于测量405nm处吸光值。
[0172] 。
[0173] 式中：A为实验组的吸光度值；B为对照组的吸光度值；C为空白对照组的吸光度值；
[0174] 实验结果如图6和表5所示，与阳性对照相比，紫雪莲类囊泡和紫雪莲细胞提取物均具有抑制黑色素分泌的作用且均比阳性对照效果更好。紫雪莲类囊泡和紫雪莲细胞提取9
物相比，10Particles/mL的紫雪莲类囊泡的相对黑色素含量仅有79.85%，比0.3g/mL的紫雪莲细胞提取物还要低，表明本申请提供的紫雪莲类囊泡具有良好的抑制黑色素分泌的作用，可使皮肤更加美白焕亮。
物相比，10Particles/mL的紫雪莲类囊泡的相对黑色素含量仅有79.85%，比0.3g/mL的紫雪莲细胞提取物还要低，表明本申请提供的紫雪莲类囊泡具有良好的抑制黑色素分泌的作用，可使皮肤更加美白焕亮。
[0175] 表5紫雪莲类囊泡、紫雪莲提取物的相对黑色素含量
[0176] 。
[0177] 试验例5、紫雪莲类囊泡及细胞提取物的促细胞迁移测定
[0178] 人皮肤成纤维细胞是皮肤真皮层中最主要的细胞，对于维持皮肤的弹性和张力具有重要作用。人皮肤成纤维细胞具有很强的蛋白质合成能力，可以合成并分泌大量弹性蛋白、胶原蛋白、糖胺多糖和糖蛋白等基质成分，进而生成弹性纤维、胶原纤维和网状纤维，分泌多种细胞修复因子，使皮肤具有强大的更新与自我修复能力。
[0179] 将人皮肤成纤维细胞按2×105/孔接种至6孔板中。细胞在37℃、5%CO2培养箱中培养24h。当细胞融合率达到90%时，用200μL移液管枪头，垂直于孔板划线，划伤人皮肤成纤维细胞，用PBS洗涤除去因划痕分离的细胞碎片，使划痕范围内没有细胞，用于观察细胞是否增殖迁移。
[0180] 对试验进行分组，分别设为对照组、紫雪莲类囊泡组和紫雪莲细胞提取物组，每组设3个复孔。将实施例2中提取的紫雪莲类囊泡溶液用DMEM完全培养基稀释成9
10Particles/mL的紫雪莲类囊泡溶液。将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用DMEM完全培养基依次稀释为3g/mL和0.3g/mL。对照组每孔加入200μLDMEM完全培养基，紫雪莲类囊泡
9
组加入上述10 Particles/mL的紫雪莲类囊泡溶液，紫雪莲细胞提取物组加入上述3g/mL和
0.3g/mL的紫雪莲细胞提取物溶液。在划痕形成后0h、36h对划痕区域进行拍照，观察细胞的迁移情况。
10Particles/mL的紫雪莲类囊泡溶液。将对比例5中得到的紫雪莲细胞提取物用DMEM完全培养基依次稀释为3g/mL和0.3g/mL。对照组每孔加入200μLDMEM完全培养基，紫雪莲类囊泡
9
组加入上述10 Particles/mL的紫雪莲类囊泡溶液，紫雪莲细胞提取物组加入上述3g/mL和
0.3g/mL的紫雪莲细胞提取物溶液。在划痕形成后0h、36h对划痕区域进行拍照，观察细胞的迁移情况。
[0181] 实验结果如图7所示，与对照组相比，36h后，加入109Particles/mL的紫雪莲类囊泡的人皮肤纤维细胞增殖迁移更快，而加入3g/mL的紫雪莲细胞提取物溶液的细胞几乎没有增殖迁移，细胞活性明显降低，加入0.3g/mL的紫雪莲细胞提取物溶液的细胞迁移效果和对照组相当，表明本申请提供的紫雪莲类囊泡能够明显促进人皮肤纤维细胞增殖迁移，可以增强细胞活力使受损肌肤快速修复，使皮肤状态更加健康稳定。
[0182] 上述说明示出并描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施案例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。