一种多糖在口腔粘膜修复中的应用及其所制备的促进剂

摘要

本发明提供了一种多糖在口腔粘膜修复中的应用及其所制备的促进剂，属于口腔医学技术领域。本发明所提供的多糖为从颠茄草中提取分离的分子量为10‑30kDa的多糖，实验研究表明该颠茄草多糖具有促进人口腔粘膜上皮细胞增殖、迁移的作用，并能显著抑制口腔致病菌白色念珠菌的黏附。同时，本发明利用该多糖制备出了口腔粘膜修复促进剂，从而有效促进口腔粘膜修复，治疗口腔溃疡等多种口腔粘膜损伤。

权利要求

1.一种多糖在制备口腔粘膜修复促进剂中的应用，其特征在于，所述多糖为颠茄草多糖，所述颠茄草多糖的制备方法包括如下步骤：（1）将颠茄草清洗干净后，烘箱中烘干至重量不变；

（2）将干燥的颠茄草粉碎后，过筛得到颠茄草粉末；

（3）取颠茄草粉末，加入15倍量的蒸馏水， 80℃浸提2h，得到提取液；

（4）取出提取液，使用纱布过滤去除不溶物，置于离心机中离心，收集上清，得到多糖粗提取液；

（5）在60℃水浴条件下，使用旋转蒸发仪将多糖粗提取液浓缩至原体积的1/5，得到粗多糖液；

（6）加入4倍量的无水乙醇，静置24h析出沉淀；

（7）置于离心机中离心，收集沉淀，得到颠茄草粗多糖；

（8）将颠茄草粗多糖溶解后，使用Sevage法去除蛋白，得到颠茄草多糖溶液；

（9）将颠茄草多糖溶液使用30kDa和10kDa的超滤膜过滤，得到10‑30kDa的颠茄草多糖组分；

（10）将颠茄草多糖组分冷冻干燥，得到颠茄草多糖。

说明书

一种多糖在口腔粘膜修复中的应用及其所制备的促进剂

技术领域

[0001] 本发明属于口腔医学技术领域，尤其涉及一种多糖在口腔粘膜修复中的应用及其所制备的促进剂。

背景技术

[0002] 口腔溃疡是一种非常常见的口腔粘膜疾病，它的主要表现是口腔粘膜上出现限局性的痛处或破溃性损伤，即溃疡。口腔溃疡可发生在口腔的任何部位，如颊粘膜、舌头、龈沟等，也可根据不同的病因分型，如外伤性溃疡、复发性阿弗他溃疡等。

[0003] 口腔溃疡会给患者带来明显的疼痛感或烧灼感，通常在饮食及说话时更加明显，严重影响患者的食欲和生活质量。部分溃疡病程较长，反复发作，增加了患者的痛苦。并且，口腔溃疡也增加了患者咀嚼吞咽困难、言语不清的可能。严重时还可能引起出血、感染等并发症。

[0004] 口腔溃疡的发生与口腔粘膜组织的完整性破坏密切相关。当口腔粘膜上皮及基底层受到各种因素的损害时，可能导致粘膜失去正常的完整性和保护作用，继而出现破溃性的溃疡损伤。导致口腔粘膜完整性破坏的因素非常多样。其中，最常见的原因是口腔的机械性创伤，如残留食糜、异物刮擦、不当的牙齿清洁等导致粘膜表层损伤。其次，化学刺激如烟草、酒精、口香糖、辛辣食物等也可引起口腔粘膜损害。

[0005] 因此，尽管口腔溃疡的发生机制复杂多样，但大多和口腔粘膜组织完整性受损有关，因此如何有效的提高口腔粘膜修复能力对口腔溃疡的治愈和预后至关重要。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供一种多糖在口腔粘膜修复中的应用及其所制备的促进剂，从而促进口腔粘膜的快速修复。

[0007] 为实现上述目的，本发明提供了如下的技术方案：

[0008] 首先，本发明提供了一种多糖在制备口腔粘膜修复促进剂中的应用，所述多糖为颠茄草多糖。

[0009] 优选地，所述颠茄草多糖制备方法包括如下步骤：

[0010] （1）将颠茄草清洗干净后，烘箱中烘干至重量不变；

[0011] （2）将干燥的颠茄草粉碎后，过筛得到颠茄草粉末；

[0012] （3）取颠茄草粉末，加入15倍量的蒸馏水，80℃浸提2h，得到提取液；

[0013] （4）取出提取液，使用纱布过滤去除不溶物，置于离心机中离心，收集上清，得到多糖粗提取液；

[0014] （5）在60℃水浴条件下，使用旋转蒸发仪将多糖粗提取液浓缩至原体积的1/5，得到粗多糖液；

[0015] （6）加入4倍量的无水乙醇，静置24h析出沉淀；

[0016] （7）置于离心机中离心，收集沉淀，得到颠茄草粗多糖；

[0017] （8）将颠茄草粗多糖溶解后，使用Sevage法去除蛋白，得到颠茄草多糖溶液；

[0018] （9）将颠茄草多糖溶液使用30kDa和10kDa的超滤膜过滤，得到10‑30kDa的颠茄草多糖组分；

[0019] （10）将颠茄草多糖组分冷冻干燥，得到颠茄草多糖。

[0020] 优选地，所述口腔粘膜修复促进剂通过促进口腔粘膜上皮的增殖和迁移能力来发挥口腔粘膜修复促进作用。

[0021] 优选地，所述口腔粘膜促进剂通过降低白色念珠菌对于口腔粘膜上皮细胞的黏附能力来降低口腔损伤，从而发挥口腔粘膜修复促进作用。

[0022] 优选地，所述促进剂中颠茄草多糖的浓度大于0.1mg/ml。

[0023] 其次，本发明提供了一种多糖在制备促进口腔粘膜上皮细胞增殖能力的促进剂中的应用，所述多糖为颠茄草多糖，所述颠茄草多糖由上述的颠茄草多糖制备方法制备得到。

[0024] 其次，本发明提供了一种多糖在制备促进口腔粘膜上皮细胞迁移能力的促进剂中的应用，所述多糖为颠茄草多糖，所述颠茄草多糖由上述的颠茄草多糖制备方法制备得到。

[0025] 其次，本发明提供了一种多糖在制备抑制白色念球菌黏附能力的抑制剂中的应用，所述多糖为颠茄草多糖，所述颠茄草多糖由上述的颠茄草多糖制备方法制备得到。

[0026] 其次，本发明提供了一种用于通过提高口腔粘膜上皮细胞增殖和迁移能力来促进口腔粘膜修复的促进剂，所述促进剂的制备方法包括如下步骤：

[0027] （1）按照如下配方配置原料：2％ 维生素C，10%透明质酸钠，5% 甘油，10%颠茄草多糖，2% 薄荷油，71% 无菌水；

[0028] （2）将原料搅拌均匀后，灭菌分装至喷雾瓶中，得到口腔粘膜修复的促进剂。

[0029] 优选地，所述颠茄草多糖由上述的颠茄草多糖制备方法制备得到。

[0030] 本发明的有益效果如下：

[0031] 本发明从颠茄草中提取分离得到的分子量在10‑30kDa之间的颠茄草多糖，实验结果显示，在一定浓度范围内，颠茄草多糖能够以剂量依赖的方式促进口腔上皮细胞的增殖；Transwell迁移实验也证实了颠茄草多糖可以促进口腔上皮细胞的迁移能力。此外，我们还发现颠茄草多糖能够抑制致病菌白色念珠菌对口腔粘膜细胞的黏附。

[0032] 综合上述研究结果，我们本发明发现颠茄草提取物中的特定多糖组分对修复口腔粘膜损伤具有促进作用。

附图说明

[0033] 图1为不同颠茄草多糖处理后人口腔粘膜上皮细胞的迁移细胞数的结果图；

[0034] 图2为不同颠茄草多糖处理后人口腔粘膜上皮细胞的迁移细胞数的统计图；

[0035] 图2中***表示P＜0.001。

具体实施方式

[0036] 实施例1 ：1.将从志愿者获取的口腔粘膜在超净工作台中使用生理盐水反复冲洗5次；

[0037] 2.使用含有双抗的漂洗液冲洗5次，去除表面残存的血渍；

[0038] 3.使用眼科剪刀将粘膜下较厚的组织剪去，加入0.25%中性蛋白酶 II，4℃消化16‑18h后，使用眼科镊子将表层上皮与下层分开；

[0039] 4.将表层上皮裁剪成1mm×1mm的小块，加入0.25%胰蛋白酶，37℃消化10min后，加入胎牛血清终止消化，并吹打成单细胞悬液；

[0040] 5.将细胞收集至离心管中，置于离心机中1000rpm离心5min，去除上清后，加入Defined Keratinocyte‑SFM培养基并吹打成单细胞悬液；

[0041] 6.对细胞计数后，按照1×104/ml的密度将细胞接种于培养皿中，置于37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱中进行培养，得到人口腔粘膜上皮细胞；

[0042] 7.培养第三天进行首次换液，之后每2天进行1次换液并用于后续实验。

[0043] 实施例2：1.将颠茄草清洗干净后，60℃烘箱中烘干至重量不变；

[0044] 2.将干燥的颠茄草粉碎后，过40目筛，得到颠茄草粉末；

[0045] 3.取100g颠茄草粉末，加入1500ml蒸馏水，置于电热水浴锅中，80℃浸提2h；

[0046] 4.取出提取液，使用4层纱布过滤去除不溶物，置于离心机中8000rpm离心20min，收集上清，得到多糖粗提取液；

[0047] 5.在60℃水浴条件下，使用旋转蒸发仪将多糖粗提取液浓缩至300ml，得到粗多糖液；

[0048] 6.加入1200ml的无水乙醇，静置24h析出沉淀；

[0049] 7.置于离心机中8000rpm离心20min，收集沉淀，得到颠茄草粗多糖；

[0050] 8.将颠茄草粗多糖溶解后，使用Sevage法重复7次去除蛋白，得到颠茄草多糖溶液；

[0051] 9.将颠茄草多糖溶液依次使用50kDa，30kDa和10kDa的超滤膜过滤，得到小于10kDa的颠茄草多糖组分1，10‑30kDa的颠茄草多糖组分2和30‑50kDa的颠茄草多糖组分3；

[0052] 10.将颠茄草多糖组分1，2和3冷冻干燥，得到颠茄草多糖1，2和3。

[0053] 实施例3：1.将处于生长期的人口腔粘膜上皮细胞接种于96板中，每孔100μL；

[0054] 2.待细胞过夜培养完全贴壁后，按照如下分组对细胞进行处理：

[0055] 对照组：添加的Defined Keratinocyte‑SFM培养基；

[0056] 颠茄草多糖1处理组（以下简称多糖1处理组）：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22μm膜过滤除菌的1mg/ml颠茄草多糖1的培养基溶液；

[0057] 颠茄草多糖2处理组（以下简称多糖2处理组）：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22μm膜过滤除菌的1mg/ml颠茄草多糖2的培养基溶液；

[0058] 颠茄草多糖3处理组（以下简称多糖3处理组）：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22μm膜过滤除菌的1mg/ml颠茄草多糖3的培养基溶液；

[0059] 3.将处理后的细胞置于37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱中进行培养；

[0060] 4.培养5天后，将96孔板取出，每孔加入10μL CCK‑8溶液后，再次将96孔板置于细胞培养箱中孵育3h；

[0061] 5.使用酶标仪测定各组的OD450nm值及纯培养基的OD450nm值，绘制表格。

[0062] 表1 不同颠茄草多糖处理后人口腔粘膜上皮细胞的OD值

[0063]

[0064] 从表1中，我们可以看出，本发明所制备的三种颠茄草多糖对于人口腔粘膜上皮的增殖均具有一定测定的促进作用，其中与对照组相比，颠茄草多糖1处理组的细胞增殖率提高到0.707±0.051，增殖率提高了22.5%，两组比较p=0.0437，差异有统计学意义；

[0065] 颠茄草多糖2处理组的细胞增殖率最高，达到0.971±0.058，比对照组提高了68.3%，两组比较p=0.0012，差异非常显著。

[0066] 颠茄草多糖3处理组的细胞增殖率为0.792±0.052，比对照组提高了37.3%，两组比较p=0.0089，差异有统计学意义。

[0067] 综合来看，颠茄草多糖2的促进效果相较于颠茄草多糖1和颠茄草多糖3的提升十分显著，这可能是由于不同分子量的多糖结构不同所导致。本实施例初步验证了颠茄草多糖对于对口腔粘膜的增殖具有促进作用，可以将其用于口腔粘膜的促进。

[0068] 实施例4 ：1.将处于生长期的人口腔粘膜上皮细胞接种于96板中，每孔100μL；

[0069] 2.待细胞过夜培养完全贴壁后，按照如下分组对细胞进行处理：

[0070] 对照组：添加的Defined Keratinocyte‑SFM培养基；

[0071] 0.1mg/ml多糖2处理组：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的0. 1mg/ml颠茄草多糖2的培养基溶液；

[0072] 0.5 mg/ml多糖2处理组：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的0. 5mg/ml颠茄草多糖2的培养基溶液；

[0073] 1 mg/ml多糖2处理组：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的1mg/ml颠茄草多糖2的培养基溶液；

[0074] 5 mg/ml多糖2处理组：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的5mg/ml颠茄草多糖2的培养基溶液；

[0075] 10 mg/ml多糖2处理组：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的5mg/ml颠茄草多糖2的培养基溶液；

[0076] 3.将处理后的细胞置于37℃、5% CO2饱和湿度细胞培养箱中进行培养；

[0077] 4.培养5天后，将96孔板取出，每孔加入10μL CCK‑8溶液后，再次将96孔板置于细胞培养箱中孵育3h；

[0078] 5.使用酶标仪测定各组的OD450nm值及纯培养基的OD450nm值，绘制表格。

[0079] 表2不同浓度的颠茄草多糖2处理后人口腔粘膜上皮细胞的OD值

[0080]

[0081] 从表2可以看出，当颠茄草多糖2的浓度为0.1mg/ml时便可以对于人口腔粘膜上皮细胞产生促进作用，说明颠茄草多糖2的最低有效浓度为0.1mg/ml，当颠茄草多糖2的浓度达到5mg/ml时，OD 值最高，继续增加浓度促进作用没有明显的增加，说明5mg/ml是颠茄草多糖2的最适浓度。

[0082] 实施例5：1.将人口腔粘膜上皮细胞借助于6孔培养板中，待细胞贴壁后，按照如下分组处理细胞：

[0083] 对照组：添加的Defined Keratinocyte‑SFM培养基；

[0084] 颠茄草多糖1处理组（以下简称多糖1处理组）：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的5mg/ml颠茄草多糖1的培养基溶液；

[0085] 颠茄草多糖2处理组（以下简称多糖2处理组）：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的5mg/ml颠茄草多糖2的培养基溶液；

[0086] 颠茄草多糖3处理组（以下简称多糖3处理组）：添加使用Defined Keratinocyte‑SFM培养基配置的并使用0.22um膜过滤除菌的5mg/ml颠茄草多糖3的培养基溶液；

[0087] 2.培养24h后，将不同处理组的细胞消化，使用无血清的Defined Keratinocyte‑SFM培养基重悬细胞，制备成细胞悬液；

[0088] 3.将Transwell小室放入到24孔板中，在24孔板中加入500μL含10%胎牛血清的Defined Keratinocyte‑SFM培养基；

[0089] 4.按照每孔20000个细胞的量将不同处理组的细胞接种于Transwel小室的上室中，将24孔板放入37°C、5%CO2细胞培养箱，孵育24小时，以使细胞从上室向下室迁移；

[0090] 5. 孵育结束后，用无菌镊子小心将Transwell小室取出，在上、下两室分别加入PBS，轻轻洗涤2遍，然后在上室加入足量4%多聚甲醛固定液，室温固定30分钟，以固定迁移至下层的细胞；

[0091] 6. PBS清洗上、下两室2遍，去除多聚甲醛，之后用无菌棉签小心擦去上室多余未迁移的细胞；

[0092] 7.在下室加入适量结晶紫工作液染色20分钟后，用水清洗去除未结合的染料；

[0093] 8.将Transwel小室置于显微镜下进行拍照，并选择多个视野统计迁移细胞数目。

[0094] 从图1和图2可以看出，相较于对照组，3种多糖处理组的平均迁移细胞数均有不同程度升高，说明本发明所制备的颠茄草多糖1，2和3对于人口腔粘膜上皮细胞的迁移能力都有明显的提升，与促进增殖的效果类似，同样是颠茄草多糖2具有最佳的促进效果。

[0095] 同时，可以看出，相较于促进人口腔上皮细胞增殖的效果，颠茄草多糖促进迁移的效果更加的显著。

[0096] 实施例6：1.将白色念珠菌标准菌株ATCC 10231接种于沙氏液体培养基中，37℃ 120rpm培养24h；

[0097] 2.收集白色念珠菌，调整为菌液浓度为1×106 CFU/mL；

[0098] 3.将人口腔粘膜上皮细胞制成细胞悬液，调整浓度为1×105个/ml；

[0099] 4. 取预清洁的玻片，加入粘膜细胞悬液100μL，室温静置30分钟，使细胞贴附玻片；

[0100] 5. 小心洗涤2次，除去未黏附细胞；

[0101] 6.对照组加入400μL Defined Keratinocyte‑SFM培养基，多糖1处理组加入400μL 5mg/ml颠茄草多糖1培养基，多糖2处理组加入400μL 5mg/ml颠茄草多糖2培养基，多糖3处理组加入400μL 5mg/ml颠茄草多糖3培养基；

[0102] 7.将400μL白色念珠菌的菌液加入到各组中，置于37℃孵育2h后，PBS洗涤2次去除未黏附的白色念珠菌；

[0103] 8.加入乙醇固定后，进行革兰氏染色，统计视野中黏附念珠菌数，黏附率=黏附念珠菌的细胞数/观察视野细胞数。

[0104] 表3 不同颠茄草多糖对于白色念珠菌对于人口腔粘膜上皮细胞黏附的影响[0105]

[0106] 从表3可以看出，白色念珠菌对人口腔粘膜上皮细胞具有较强的黏附能力，其黏附率可达55.49%。使用三种不同的颠茄草多糖处理后，念珠菌对上皮细胞的黏附率均有不同程度的下降，但是颠茄草多糖1对于白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附率影响的差异无统计学意义；

[0107] 颠茄草多糖2和颠茄草多糖3可以明显抑制白色念珠菌对口腔细胞的黏附。其中，颠茄草多糖2抑制黏附的效果最优。上述结果表明，本发明所制备颠茄草多糖2可以显著抑制白色念珠菌对口腔上皮细胞的黏附，减轻对于口腔粘膜的损伤，从而可以将其用于开发用于口腔粘膜修复的促进剂。

[0108] 实施例7 ：1.按照如下配方配置原料：2％ 维生素C，10%透明质酸钠，5% 甘油，10%颠茄草多糖2，2% 薄荷油，71% 无菌水；

[0109] 2.将原料搅拌搅拌均匀后，灭菌分装至喷雾瓶中，得到口腔粘膜修复的促进剂。