一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法

摘要

本发明提供了一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法，涉及鲍曼不动杆菌技术领域，该鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗的制备方法采用了脱氧胆酸钠裂解细菌，低温离心，切向流超滤和酶处理等技术相结合鲍曼不动杆菌荚膜多糖的提纯方法，制备方法工艺简洁，操作步骤易控制，容易实现，适合大规模生产，且制备方法中所采用的试剂无污染，所制备的鲍曼不动杆菌荚膜多糖产率高，纯度高，所制备的鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗具有免疫保护率高和起效迅速的特点。

权利要求

1.一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：（1）培养鲍曼不动杆菌ATCC17978；

（2）收集鲍曼不动杆菌菌体；

（3）采用0.01M的pH为7.2‑7.4的PBS缓冲剂稀释菌液，用紫外‑可见光光度法测定OD600值，将鲍曼不动杆菌菌液浓度调整至OD600值为3.5‑4.5，取500 mL菌液，之后向鲍曼不动杆菌菌液中加入10% w/v脱氧胆酸钠至菌液终浓度为0.12%w/v，再置于摇床中25℃，120 rpm裂解18 h；

（4）裂解完成后进行离心处理，并在离心后取上清液过0.45 μm的过滤膜；

（5）将经过滤膜后的样品溶液用100 kDa膜切向流超滤，对液体进行浓缩后，再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到粗糖，保存备用；

（6）配制酶反应缓冲液，利用所述酶反应缓冲液将得到的粗糖配制为5 mg/mL的粗多糖反应缓冲溶液，向粗多糖反应缓冲溶液中加入3%v/v的双抗后在冰箱内冷藏放置以促进溶解；

（7）向步骤（6）中的粗多糖反应缓冲溶液中加入全能核酸酶，置于摇床中在37℃，120 rpm反应；

（8）利用酶反应缓冲液配制5% w/vSDS和10 mg/mL的蛋白酶K备用，再向粗多糖反应缓冲溶液中加入所配制的SDS至混合液中SDS终浓度为0.5% w/v，再加入所配制的蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，并于摇床中37℃，120 rpm反应；

（9）待反应结束后，将反应体系稀释10倍，室温静置后进行离心处理，取离心后的上清液过0.8μm过滤膜；

（10）向过滤后的滤液中加入超纯水，对滤液进行稀释后，用100 kDa膜切向流超滤浓缩，之后再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到鲍曼不动杆菌荚膜多糖精糖，备用；其中，所制备的荚膜多糖的数均分子量为2724 kDa，重均分子量为7411 kDa；

（11）用无菌PBS溶液溶解精糖配制为鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗。

2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（1）中，还包括：取鲍曼不动杆菌ATCC17978菌株，在胰酪大豆胨琼脂培养基平板上划板，于37℃恒温培养箱中培养过夜；

挑选单菌落接种于胰酪大豆胨液体培养基中，在摇床中于37℃，220rpm培养；

将上述培养所得菌液按照1：100比例接种于胰酪大豆胨液体培养基中，在摇床中37 ℃，220 rpm培养过夜。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中，还包括：将过夜培养的菌液于4℃，4000 g离心处理30 min，弃去上清液，收集鲍曼不动杆菌菌体。

4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中，还包括：所述酶反应缓冲液包括pH8.0的Tris‑HCl、MgCl2和CaCl2。

5.一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗，其特征在于，所述鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗是由前述权利要求1至4任一项的制备方法制备而成。

6.一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括如下步骤：（1）培养鲍曼不动杆菌ATCC17978；

（2）收集鲍曼不动杆菌菌体；

（3）采用0.01M的pH为7.2‑7.4的PBS缓冲剂稀释菌液，用紫外‑可见光光度法测定OD600值，将鲍曼不动杆菌菌液浓度调整至OD600值为3.5‑4.5，取500 mL菌液，之后向鲍曼不动杆菌菌液中加入10% w/v脱氧胆酸钠至菌液终浓度为0.12%w/v，再置于摇床中25℃，120 rpm裂解18 h；

（4）裂解完成后进行离心处理，并在离心后取上清液过0.45 μm的过滤膜；

（5）将经过滤膜后的样品溶液用100 kDa膜切向流超滤，对液体进行浓缩后，再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到粗糖，保存备用；

（6）配制酶反应缓冲液，利用所述酶反应缓冲液将得到的粗糖配制为5 mg/mL的粗多糖反应缓冲溶液，向粗多糖反应缓冲溶液中加入3%v/v的双抗后在冰箱内冷藏放置以促进溶解；

（7）向步骤（6）中的粗多糖反应缓冲溶液中加入全能核酸酶，置于摇床中在37℃，120 rpm反应；

（8）利用酶反应缓冲液配制5% w/vSDS和10 mg/mL的蛋白酶K备用，再向粗多糖反应缓冲溶液中加入所配制的SDS至混合液中SDS终浓度为0.5% w/v，再加入所配制的蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，并于摇床中37℃，120 rpm反应；

（9）待反应结束后，将反应体系稀释10倍，室温静置后进行离心处理，取离心后的上清液过0.8μm过滤膜；

（10）向过滤后的滤液中加入超纯水，对滤液进行稀释后，用100 kDa膜切向流超滤浓缩，之后再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到鲍曼不动杆菌荚膜多糖精糖，备用；其中，所制备的荚膜多糖的数均分子量为2724 kDa，重均分子量为7411 kDa。

说明书

一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及鲍曼不动杆菌技术领域，尤其是涉及一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法。

背景技术

[0002] 鲍曼不动杆菌（Acinetobacter baumannii）是一种革兰氏阴性条件致病菌，作为一种医院院内病原体，它可引起多种感染，包括肺炎、脓毒症、脑膜炎、创伤后感染和尿路感染。随着抗生素的广泛使用，现已出现多重耐药鲍曼不动杆菌。2017年世界卫生组织发布了全球抗生素耐药菌优先清单，并将鲍曼不动杆菌列为严重危险病原体。疫苗是防控鲍曼不动杆菌感染的有效手段，许多鲍曼不动杆菌疫苗仍处于临床前研究阶段。一些多组分候选抗原例如失活的整个细胞、外膜复合物（outer membrane complexes，OMCs）、外膜囊泡（outer membrane Vesicles，OMVs）和减毒活细胞已被广泛研究。然而上述多组分候选抗原疫苗的组份复杂性以及残留的脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）引起的相关安全问题仍需解决。虽然许多亚单位疫苗已经克服了安全性问题，但仍需进一步探索，例如：蛋白质抗原通常被表面多糖所阻挡，从而阻碍了抗体对其的识别。

[0003] 荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）是带荚膜细菌的主要毒力因子之一，在细菌逃避人体的非特异性防御中发挥重要作用。同时，荚膜多糖也是特异性免疫反应的保护性抗原，是细菌结构变化最少的表面抗原，具有较好的免疫原性，是最适宜做疫苗成份的靶抗原之一。荚膜多糖（capsular polysaccharide，CPS）是由紧密排列的重复寡糖亚单位组成，在细胞表面形成一个离散的层，为细菌在不同的环境条件下生存提供保护，协助细菌逃避宿主免疫防御，并增加对许多抗菌化合物的耐药性。鲍曼不动杆菌可产生高分子量荚膜多糖包裹在外膜周围。抗生素处理不当会增加荚膜多糖的合成，进一步增强鲍曼不动杆菌的毒力，增加临床治疗的难度。

[0004] 然而，目前从鲍曼不动杆菌中分离纯化荚膜多糖的困难在于其荚膜表达量较低，远不及流感嗜血杆菌、脑膜炎奈瑟菌、伤寒沙门菌和肺炎链球菌等。具体的提纯方法包括使用乙醇、苯酚有机溶剂抽提法或溴化十六烷基三甲基铵（Cetrimonium（bromide），CTAB）沉淀法，这些方法可去除部分细菌核酸和蛋白，若要进一步纯化荚膜多糖，还需要进行离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析。然而，乙醇和苯酚等有机溶剂的大量使用会造成环境污染，层析填料价格昂贵，操作过程费时费力，这种使用分步沉淀、离子交换层析、凝胶过滤和亲和层析的纯化方法，荚膜多糖的产量非常低，无法满足临床需求。因此，研发鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗最大障碍在于如何改良荚膜多糖的提纯技术，以便提高鲍曼不动杆菌荚膜多糖的纯化效果，缩短操作时间，降低费用，以满足临床预防鲍曼不动杆菌感染的需求。

发明内容

[0005] 本发明的目的在于提供一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法。本发明提供的诸多技术方案中的优选技术方案所能产生的诸多技术效果详见下文阐述。

[0006] 为实现上述目的，本发明提供了以下技术方案：

[0007] 第一方面，本发明提供了一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗的制备方法，包括如下步骤：

[0008] （1）培养鲍曼不动杆菌；

[0009] （2）收集鲍曼不动杆菌菌体；

[0010] （3）采用0.01M的pH为7.2‑7.4的PBS缓冲剂稀释菌液，用紫外‑可见光光度法测定OD600值，将鲍曼不动杆菌菌液浓度调整至OD600值为3.5‑4.5，取500 mL菌液，之后向鲍曼不动杆菌菌液中加入10% w/v脱氧胆酸钠至菌液终浓度为0.12%w/v，再置于摇床中25℃，120 rpm裂解18 h；

[0011] （4）裂解完成后进行离心处理，并在离心后取上清液过0.45 μm的过滤膜；

[0012] （5）将经过滤膜后的样品溶液用100 kDa膜切向流超滤，对液体进行浓缩后，再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到粗糖，保存备用；

[0013] （6）配制酶反应缓冲液，利用所述酶反应缓冲液将得到的粗糖配制为5 mg/mL的粗多糖反应缓冲溶液，向粗多糖反应缓冲溶液中加入3%v/v的双抗后在冰箱内冷藏放置以促进溶解；

[0014] （7）向步骤（6）中的粗多糖反应缓冲溶液中加入全能核酸酶，置于摇床中在37℃，120 rpm反应；

[0015] （8）利用酶反应缓冲液配制5% w/vSDS和10 mg/mL的蛋白酶K备用，再向粗多糖反应缓冲溶液中加入所配制的SDS至混合液中SDS终浓度为0.5% w/v，再加入所配制的蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，并于摇床中37℃，120 rpm反应；

[0016] （9）待反应结束后，将反应体系稀释10倍，室温静置后进行离心处理，取离心后的上清液过0.8μm过滤膜；

[0017] （10）向过滤后的滤液中加入超纯水，对滤液进行稀释后，用100 kDa膜切向流超滤浓缩，之后再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到鲍曼不动杆菌荚膜多糖精糖，备用；其中，所制备的荚膜多糖的数均分子量为2724 kDa，重均分子量为7411 kDa；

[0018] （11）用无菌PBS溶液溶解精糖配制为鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗。

[0019] 根据一种优选实施方式，步骤（1）中，还包括：

[0020] 取鲍曼不动杆菌菌株，在胰酪大豆胨琼脂培养基平板上划板，于37℃恒温培养箱中培养过夜；

[0021] 挑选单菌落接种于胰酪大豆胨液体培养基中，在摇床中于37℃，220rpm培养；

[0022] 将上述培养所得菌液按照1：100比例接种于胰酪大豆胨液体培养基中，在摇床中37 ℃，220 rpm培养过夜。

[0023] 根据一种优选实施方式，步骤（2）中，还包括：将过夜培养的菌液于4℃，4000 g离心处理30 min，弃去上清液，收集鲍曼不动杆菌菌体。

[0024] 根据一种优选实施方式，步骤（6）中，还包括：所述酶反应缓冲液包括pH8.0的Tris‑HCl、MgCl2和CaCl2。

[0025] 第二方面，本发明还提供了一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗，所述鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗是由前述的制备方法制备而成。

[0026] 第三方面，本发明还提供了一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

[0027] （1）培养鲍曼不动杆菌；

[0028] （2）收集鲍曼不动杆菌菌体；

[0029] （3）采用0.01M的pH为7.2‑7.4的PBS缓冲剂稀释菌液，用紫外‑可见光光度法测定OD600值，将鲍曼不动杆菌菌液浓度调整至OD600值为3.5‑4.5，取500 mL菌液，之后向鲍曼不动杆菌菌液中加入10% w/v脱氧胆酸钠至菌液终浓度为0.12%w/v，再置于摇床中25℃，120 rpm裂解18 h；

[0030] （4）裂解完成后进行离心处理，并在离心后取上清液过0.45 μm的过滤膜；

[0031] （5）将经过滤膜后的样品溶液用100 kDa膜切向流超滤，对液体进行浓缩后，再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到粗糖，保存备用；

[0032] （6）配制酶反应缓冲液，利用所述酶反应缓冲液将得到的粗糖配制为5 mg/mL的粗多糖反应缓冲溶液，向粗多糖反应缓冲溶液中加入3%v/v的双抗后在冰箱内冷藏放置以促进溶解；

[0033] （7）向步骤（6）中的粗多糖反应缓冲溶液中加入全能核酸酶，置于摇床中在37℃，120 rpm反应；

[0034] （8）利用酶反应缓冲液配制5% w/vSDS和10 mg/mL的蛋白酶K备用，再向粗多糖反应缓冲溶液中加入所配制的SDS至混合液中SDS终浓度为0.5% w/v，再加入所配制的蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，并于摇床中37℃，120 rpm反应；

[0035] （9）待反应结束后，将反应体系稀释10倍，室温静置后进行离心处理，取离心后的上清液过0.8μm过滤膜；

[0036] （10）向过滤后的滤液中加入超纯水，对滤液进行稀释后，用100 kDa膜切向流超滤浓缩，之后再用超纯水滤洗多次，浓缩，转入冻干杯中，之后冻干得到鲍曼不动杆菌荚膜多糖精糖，备用；其中，所制备的荚膜多糖的数均分子量为2724 kDa，重均分子量为7411 kDa。

[0037] 基于上述技术方案，本申请的一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗及其制备方法至少具有如下有益技术效果：

[0038] 本申请的鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗的制备方法工艺简洁，操作步骤易控制，容易实现，适合大规模生产，且制备方法中所采用的试剂无污染，用酶处理方法得到荚膜多糖的产量是乙醇沉淀法纯化的荚膜多糖的1.67倍。用酶处理方法所制备的鲍曼不动杆菌荚膜多糖产率高，纯度高。所制备的鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗具有免疫保护率高和起效迅速的特点。

附图说明

[0039] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0040] 图1是本发明实施例中阿利新蓝染色法检测鲍曼不动杆菌荚膜多糖的分子量图，其中M代表Marker，1和2分别是荚膜多糖重复组；

[0041] 图2是本发明实施例的鲍曼不动杆菌荚膜多糖的激光光散射信号曲线图；

[0042] 图3是本发明实施例的鲍曼不动杆菌荚膜多糖的粒径分布图；

[0043] 图4是本发明实施例的鲍曼不动杆菌荚膜多糖的FT‑IR光谱图；

[0044] 图5是本发明实施例的鲍曼不动杆菌荚膜多糖的400 MHz1H NMR检测图谱，其中溶剂为重水；

[0045] 图6是接种两次本发明的鲍曼不动杆菌多糖疫苗的小鼠在攻毒后的生存率图；

[0046] 图7是接种一次本发明的鲍曼不动杆菌多糖疫苗的小鼠在攻毒后的生存率图。

具体实施方式

[0047] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明的技术方案进行详细的描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所得到的所有其它实施方式，都属于本发明所保护的范围。

[0048] 实施例1

[0049] 本申请实施例1提供了一种鲍曼不动杆菌荚膜多糖的制备方法。

[0050] 一、鲍曼不动杆菌荚膜多糖的提取。

[0051] 菌株及试剂来源：鲍曼不动杆菌ATCC17978购买自美国典型培养物保藏中心（American Type Culture Collection，ATCC）。蛋白酶K和阿利新蓝染色液（pH2.5）购自于索莱宝公司，脱氧胆酸钠、PBS购自于麦克林试剂公司，BCA蛋白质定量试剂盒购自于碧云天生物公司，胰酪胨大豆琼脂固体培养基（Tryptic Soy Agar，TSA）和胰蛋白胨大豆肉汤培养基（tryptic soy broth，TSB）购自于北京奥博星生物技术有限责任公司。全能核酸酶购自于翌圣生物公司。100 kDa膜包购自于赛多利斯公司。

[0052] 步骤如下：

[0053] （1）培养鲍曼不动杆菌ATCC17978：

[0054] 取鲍曼不动杆菌ATCC17978，在TSA平板上划板，于37 ℃恒温培养箱中培养过夜。

[0055] 挑选单菌落接种于10mL TSB液体培养基中，在摇床中37 ℃，220 rpm培养5小时。

[0056] 将上述培养所得菌液按照1：100比例接种于1L TSB液体培养基中，在摇床中37 ℃，220 rpm培养过夜。

[0057] （2）于4℃，4000 g离心处理30 min，弃去上清液，收集鲍曼不动杆菌菌体。

[0058] （3）用0.01M的PBS（pH7.2‑7.4）缓冲剂稀释菌液，用紫外‑可见分光光度法测定OD600值，将菌液浓度调节至OD600值为3.5‑4.5，取500 mL菌液，之后向鲍曼不动杆菌菌液中加入10% w/v脱氧胆酸钠（DOC）至终浓度为0.12% w/v，再置于摇床中25 ℃，120 rpm裂解18 h。该裂解条件可以保证粗多糖在步骤（7）的酶解缓冲液中具有良好的溶解性。

[0059] （4）裂解完全后，于4℃，14000 g离心处理5 min，离心1次，取上清液过0.45μm过滤膜，除去不溶性颗粒。

[0060] （5）取500 mL的过滤膜后的样品溶液用100 kDa膜切向流超滤，将液体浓缩至100 mL后，再用超纯水滤洗三次，每次用100 mL的超纯水滤洗，最后浓缩至20 mL，倒出管路中残留的液体，并用超纯水涮洗，收集涮洗后的液体，转入冻干杯中，之后冻干得到160 mg粗糖，保存于‑80 ℃冰箱。用Nanodrop和BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白浓度测定方法测定粗糖中的核酸含量和蛋白质含量分别为10.52%和26.52%。

[0061] （6）配制酶反应缓冲液，所配制的酶反应缓冲液的组分为pH 8.0的100 mM Tris‑HCl、2 mM MgCl2和5 mM CaCl2。

[0062] （7）用酶反应缓冲液配制浓度为5 mg/mL的粗多糖溶液，加入3%v/v的双抗（青霉素和链霉素，Gibco）后在4 ℃冰箱放置3 h促进溶解。由于荚膜多糖的分子量较大，无法采用0.22μm过滤膜进行除菌，加入双抗可以在核酸酶处理和蛋白酶处理过程中有效避免细菌的污染。

[0063] （8）向20 mL的粗多糖反应缓冲液中加入0.8μL的全能核酸酶（UCF.ME ® UltraNuclease全能核酸酶（同Benzonase）），于摇床中37 ℃，120 rpm反应15 h。

[0064] （9）用酶反应缓冲液配制5% w/v的SDS和10 mg/mL的蛋白酶K（索莱宝）备用，再向粗多糖反应缓冲溶液中加入SDS至SDS的终浓度为0.5%w/v，再加入蛋白酶K至终浓度为0.5 mg/mL，并于摇床中37 ℃，120 rpm反应24 h。

[0065] （10）反应结束后，将反应体系稀释10倍，室温静置30 min，于4℃，4000g离心5 min，离心一次，取上清液过0.8μm滤膜。

[0066] （11）向过滤后的滤液200 mL加入超纯水200 mL（室温），将滤液稀释后，用100 kDa膜切向流超滤浓缩至80 mL，之后再用超纯水滤洗三次，每次用160 mL的超纯水滤洗，最后浓缩至10‑20 mL，倒出管路中残留的液体，并用超纯水涮洗，收集涮洗后的液体，转入冻干杯中，之后冻干得到15 mg精糖，保存于‑80 ℃冰箱。精糖中核酸和蛋白质的含量分别为2.4%和4.2%。与粗多糖相比较，经过全能核酸酶和蛋白酶K处理后核酸和蛋白质的去除率分别达到77.19%和84.16%，荚膜多糖流失量少，进而能够获得较高纯度和收率的精糖。

[0067] 二、硫酸‑苯酚法检测荚膜多糖精糖中的糖含量。

[0068] 称取少量精糖，用超纯水配制成浓度为1 mg/mL溶液，再用纯水稀释至0.2 mg/mL溶液，备用。称取少量葡萄糖，用超纯水配制成浓度为1 mg/mL溶液，再稀释至终浓度为0.2 mg/mL溶液，备用。分别取葡萄糖溶液0、75μL、150μL、225μL、300μL、375μL、450μL于EP管中，以超纯水补足至0.5 mL，加入浓硫酸5 mL，混匀后于80℃水浴中反应60 min，取出200μL，加入5%苯酚40μL，室温下反应20 min，再于490 nm处测定吸光度值，并绘制标准曲线。取精糖水溶液450 μL，以超纯水补足至0.5 mL，加入浓硫酸5 mL，混匀后于80℃水浴中分别反应140 min，取出200μL，加入5%苯酚40μL，室温下反应20 min，再于490 nm处测定吸光度值。将精糖的吸光度值代入以葡萄糖溶液制作的标准曲线中，得到精糖中的糖含量为48.73%。

[0069] 三、阿利新蓝染色法检测鲍曼不动杆菌荚膜多糖的分子量。

[0070] 将荚膜多糖与SDS‑PAGE蛋白上样缓冲液（5×）混合后煮沸10 min，荚膜多糖在每个泳道的上样量为30μg，SDS‑PAGE凝胶电泳结束后，将凝胶置于50 ℃的脱色液（脱色液成分25%v/v乙醇、10%v/v乙酸溶液）中分别孵育5、10、15 min。黑暗条件下，加热阿利新蓝染色液（阿利新蓝染色液（pH2.5），索莱宝）至50 ℃，对凝胶染色15 min。最后加入脱色液中置于水平摇床或侧摆摇床上缓慢摇动进行洗脱。脱色后，用蛋白质凝胶成像方法对凝胶拍照。如图1所示，通过上述方法得到的荚膜多糖分子量在72 kDa以上。因为阿利新蓝可以与酸性糖胺聚糖形成不溶性复合物，所以得到的荚膜多糖中含有酸性糖胺聚糖。

[0071] 四、鲍曼不动杆菌荚膜多糖的分子量检测。

[0072] 为了确定本申请分离的鲍曼不动杆菌荚膜多糖的分子量，用凝胶渗透色谱（Gel Permeation Chromatography，GPC）对鲍曼不动杆菌荚膜多糖的分子量进行了检测。如图2所示，荚膜多糖的数均分子量（Mn）为2724 kDa，重均分子量（Mw）为7411 kDa，多分散系数PDI为2.72，分子量分布较宽。

[0073] 五、鲍曼不动杆菌的粒径。

[0074] 用马尔文粒度电位仪（Zetasizer Pro Blue）测定了鲍曼不动杆菌荚膜多糖的粒径，将鲍曼不动杆菌荚膜多糖溶于纯水中，配制为浓度为1 mg/mL的溶液。如图3所示，鲍曼不动杆菌荚膜多糖的平均粒径为735.9 nm，PDI为0.33，平均表面电位为‑27.13 mV。由于鲍曼不动杆菌荚膜多糖粒径分布较宽，并且平均粒径大于220 nm，大部分的荚膜多糖无法通过0.22 μm的滤膜，所以荚膜多糖无法通过0.22 μm的滤膜进行过滤除菌。

[0075] 六、鲍曼不动杆菌荚膜多糖的结构分析。

[0076] 为了确定荚膜多糖的结构，研究了荚膜多糖的近红外光谱，如图4所示，在3298 cm−1 ‑1处有一个强而宽的吸收峰，这是OH的伸缩振动峰。在2926 cm 处观察到的是一个碳水化‑1 ‑1
合物特征峰，提示荚膜多糖中存在CH键的伸缩振动。1660 cm 和1558 cm 处的强吸收峰表‑1
明鲍曼不动杆菌荚膜多糖中存在N‑连接的乙酰基。在1200‑1000 cm 范围内的吸收峰（1132 ‑1 ‑1 −1 −1
cm ，1060 cm ）证明吡喃环的存在。832 cm 和892 cm 处的弱吸收峰表明多糖中存在α构型和β构型的单糖。

[0077] 对荚膜多糖进行了1H‑NMR测试，用以分析荚膜多糖中可能存在的单糖类别。如图5所示，δ5.01可能为α‑‑N‑乙酰氨基（NAc）岩藻糖（FucNAc）端基质子的化学位移，δ4.87 ppm可能为β‑N‑乙酰氨基（NAc）葡萄糖（GlcNAc）端基质子化学位移，化学位移1.96‑2.04 ppm为NAc信号，δ3.3‑4.5为环质子区，δ1.2 ‑δ1.3 ppm可能为岩藻糖上的甲基信号。

[0078] 七、鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗的免疫保护效果。

[0079] 为了研究鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗的保护效果，我们选用雌性C57bl/6小鼠，周龄7‑9周，体重17‑19克，将小鼠随机分为PBS组（对照组）与CPS组（疫苗组），每组5只小鼠。用0.01M无菌PBS（pH7.2‑7.4）溶解荚膜多糖精糖，配制浓度为1.5 mg/mL的疫苗制剂，在第0天和21天对C57BL/6小鼠进行滴鼻免疫，滴鼻的疫苗制剂体积为每只小鼠20 μL，每只小鼠的剂量为30 μg荚膜多糖疫苗。在第28天，用活鲍曼不动杆菌细菌进行气管插管攻毒，观察一周以内小鼠生存率。如表1和图6所示，免疫荚膜多糖组的小鼠生存率为100%，而PBS组的小鼠生存率为0%。这一结果说明荚膜多糖的免疫保护率高，在动物体内免疫后，可有效预防鲍曼不动杆菌的感染。

[0080] 表1. 小鼠接种两次疫苗，活鲍曼不动杆菌攻毒后一周内小鼠的存活情况

[0081]

[0082] 在另外一组平行实验中，我们在第0天对C57BL/6小鼠进行滴鼻免疫，每只小鼠的剂量为30 μg荚膜多糖。免疫7天后，用活鲍曼不动杆菌进行气管插管攻毒，观察一周以内小鼠生存率。如表2和图7所示，免疫荚膜多糖组的小鼠生存率为100%，而PBS组的小鼠生存率为0%。现有技术的免疫程序为在第0天，第14天和28天进行免疫，第70天进行活细菌攻毒。与现有的免疫程序相比，本申请实验在免疫后第七天便进行活细菌攻毒，对小鼠的保护率达到100%，这说明提纯的鲍曼不动杆菌荚膜多糖的免疫保护能力具有起效迅速的特点，这可能是因为制备得到的荚膜多糖具有较大的分子量，能够快速被免疫细胞识别。

[0083] 表2. 小鼠接种一次疫苗，活鲍曼不动杆菌攻毒后一周内小鼠的存活情况

[0084]

[0085] 本申请的鲍曼不动杆菌荚膜多糖采用了脱氧胆酸钠裂解细菌，低温离心，切向流超滤和酶处理等技术相结合的提纯方法，该提纯方法无需有机溶剂及昂贵的层析介质，减少了环境污染，缩短了生产周期，且成本低廉，适合大规模生产，所制备的鲍曼不动杆菌荚膜多糖疫苗具有高效的免疫保护效果。

[0086] 实施例2

[0087] 本实施例2还提供了一种采用乙醇沉淀法制备鲍曼不动杆菌荚膜多糖的制备方法，包括如下步骤：

[0088] 2.1、取ATCC17978鲍曼不动杆菌，在TSA平板上划板，于37°C恒温培养箱中培养过夜。

[0089] 2.2、挑选单菌落接种于10mL TSB液体培养基中，在摇床中37℃，220rpm培养5小时。

[0090] 2.3、将上述培养所得菌液按照1：100比例接种于1L TSB液体培养基中，在摇床中37°C，220 rpm培养过夜。

[0091] 2.4、于4℃，4000g离心处理30min，弃去上清液，收集LAC‑4菌体。

[0092] 2.5、用0.01M的PBS（pH7.2‑7.4）稀释菌液，测定OD600值，将菌液浓度调节至OD600值为3.5‑4.5，取500 mL菌液，之后向LAC‑4菌体中加入10%w/v脱氧胆酸钠（DOC）至终浓度为0.12%，再置于摇床中25°C，120 rpm裂解18 h.

[0093] 2.6、裂解完全后，于4℃，14000g离心处理5min，离心1次，取上清液过0.45μm滤膜。

[0094] 2.7、取500 mL的过滤膜后的样品溶液用100 kDa膜切向流超滤，将液体浓缩至100 mL后，再用超纯水滤洗三次，每次用100 mL的超纯水滤洗，最后浓缩至20 mL，倒出管路中残留的液体，并用超纯水涮洗，收集涮洗后的液体合并后得到50 mL的液体。

[0095] 2.8、取超滤浓缩样品，加入CaCl2溶液至终浓度为0.5mol/L，混合均匀后，再加入无水乙醇至终浓度为25%，放置4°C冰箱，过夜。

[0096] 2.9、将第2.8步的样品于4℃，14000g离心15min，弃去沉淀，取上清液加入无水乙醇至终浓度为80%，放置冰箱，沉淀。

[0097] 2.10、将第2.9步的样品于4℃，14000g离心15min，弃去上清液，沉淀用少量超纯水溶解，置于‑80℃冰箱保存，冻干后得到9 mg荚膜多糖。相比于本申请实施例1中制备方法，采用乙醇沉淀法得到的荚膜多糖的含量相对较少。

[0098] 用BCA（Bicinchoninic Acid）蛋白浓度测定方法和Nanodrop测定用乙醇沉淀法得到的荚膜多糖中核酸含量和蛋白质含量分别为16.6%和17.1%。

[0099] 称取少量乙醇沉淀法得到的荚膜多糖，用超纯水配制成浓度为1 mg/mL溶液，再稀释至0.2 mg/mL溶液，备用。称取少量葡萄糖，用超纯水配制成浓度为1 mg/mL溶液，再稀释至终浓度为0.2 mg/mL溶液，备用。分别取葡萄糖溶液0、75、150、225、300、375、450 μL于EP管中，以超纯水补足至0.5 mL，加入浓硫酸5 mL，混匀后于80℃水浴中反应60 min，取出200μL，加入5%苯酚40 μL，室温下反应20 min，再于490 nm处测定吸光度值，并绘制标准曲线。取精糖水溶液450 μL，以超纯水补足至0.5 mL，加入浓硫酸5 mL，混匀后于80℃水 浴中分别反应140 min，取出200 μL，加入5%苯酚40 μL，室温下反应20 min，再于490 nm处测定吸光度值。将精糖的吸光度值代入以葡萄糖溶液制作的标准曲线中，得到乙醇沉淀法得到的荚膜多糖中的糖含量为20.52%。

[0100] 由此可见，本申请实施例1的制备方法相比乙醇沉淀法，用酶处理方法得到荚膜多糖的产量是乙醇沉淀法纯化的荚膜多糖的1.67倍，用酶处理方法的得到的荚膜多糖相对乙醇沉淀法得到的荚膜多糖的核酸含量和蛋白质含量较低，测得的糖含量较高，纯度较高，本申请的制备方法可以显著提高鲍曼不动杆菌荚膜多糖的产量和纯度。

[0101] 以上所述，仅为本发明的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，可轻易想到变化或替换，都应涵盖在本发明的保护范围之内。因此，本发明的保护范围应以所述权利要求的保护范围为准。