一株植物乳杆菌ZF624及其应用

摘要

本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一株植物乳杆菌ZF624及其应用。本发明提供一株植物乳杆菌ZF624，该菌株果胶酯酶活力高，用于制备剁椒，可以使辣椒中的果胶去甲酯化，将高甲氧基果胶转化成低甲氧基果胶，进而与Ca2+等金属离子生成果胶酸盐，明显改善剁椒脆度；此外植物乳杆菌ZF624发酵剁椒还能生成香气物质3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸，增加剁椒香气，使剁椒香气浓厚，远高于自然发酵的剁椒产品，提高剁椒的风味和品质。

权利要求

1.一株植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）ZF624，其特征在于，所述植物乳杆菌ZF624的保藏编号为GDMCC No: 63685。

2.一种发酵菌剂，其特征在于，所述发酵菌剂包含如权利要求1所述的植物乳杆菌ZF624。

3.如权利要求1所述的植物乳杆菌ZF624或权利要求2所述的发酵菌剂在制备剁椒中的应用。

4.如权利要求3所述的应用，其特征在于，所述应用为提高剁椒中3‑甲基噻吩和/或3‑甲基丁酸含量。

5.一种剁椒的制备方法，其特征在于，所述方法为在辣椒中添加权利要求1所述的植物乳杆菌ZF624或权利要求2所述的发酵菌剂进行发酵的方法，所述植物乳杆菌ZF624的添加

5 7 

量为10 10 CFU/mL，所述发酵温度为28‑32℃，发酵时间为20‑28 h。

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6.如权利要求5所述的制备方法，其特征在于，所述植物乳杆菌ZF624的添加量为10 CFU/mL。

说明书

一株植物乳杆菌ZF624及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株植物乳杆菌ZF624及其应用。

背景技术

[0002] 剁椒是一种以切碎的新鲜辣椒为原料，加入食盐等辅料在密闭的坛中通过腌渍或发酵制成的辣椒食品，由于风味独特、口感鲜辣脆爽，不仅可直接佐餐食用，也可用于烹调菜式而广受大众喜爱。在目前的剁椒的工业化生产中，其生产方式主要是自然发酵和盐胚脱盐发酵。自然发酵周期长、生产不稳定；盐胚脱盐发酵成本较低，加工工艺简单，但风味、滋味和营养物质在较长的贮存期和水洗脱盐过程中损失严重。

[0003] 此外，剁椒在货架期内脆度下降，极易发生软化，导致商品价值降低也是限制剁椒工业化发展的普遍存在的重要问题。针对发酵果蔬的软化，目前主要采用增加泡菜组织中果胶酸盐含量和人工接种乳酸菌缩短发酵周期两种方法提高泡菜脆度。添加外源性果胶甲酯酶或金属离子可以增加果胶酸盐含量，但是会带来不良风味,同时不符合现代消费者对于清洁标签的需求。人工接种乳酸菌发酵剁椒，虽然产品质量相对稳定，但是由于发酵菌系单一，发酵产品的风味一般。有研究表明适当的高盐预腌及加热前处理也会增加腌制蔬菜的脆度，但容易削弱蔬菜的风味以及口感。专利CN201510326039.7，将乳酸菌、醋酸杆菌、解烃棒杆菌和酵母菌制得的发酵液倒入漂烫后的鲜红辣椒中，所得剁椒风味独特，鲜红清脆。但经漂烫后的辣椒风味通常不如新鲜辣椒，且该发酵方式涉及菌株较多，工艺较复杂，不利于扩大生产。

发明内容

[0004] 基于以上技术问题，本发明的主要目的在于克服上述背景技术的不足之处，提供一株植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)ZF624，该菌株果胶酯酶活力高，用于制备剁椒，能缩短剁椒发酵周期，明显改善剁椒货架期的脆度，同时还能生成香气物质3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸，增加剁椒香气，提高剁椒的风味和品质。

[0005] 为实现上述目的，发明人进行了深入研究，并经重复多次研究论证而完成获得本发明方案，具体如下：

[0006] 第一方面，本发明提供了一株植物乳杆菌ZF624，所述植物乳杆菌ZF624的保藏编号为GDMCC No:63685。

[0007] 本发明提供的植物乳杆菌ZF624从豆瓣酱中筛选获得，其在固MRS平板培养基上形态为菌落直径3mm‑5mm，菌落呈现乳白色，菌落凸起、呈圆形，表面光滑，菌落边缘整齐。该菌株于2023年7月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心。

[0008] 第二方面，本发明还提供了一种发酵菌剂，所述发酵菌剂包含上述植物乳杆菌ZF624。

[0009] 第三方面，本发明还提供了上述植物乳杆菌ZF624或发酵菌剂在制备剁椒中的应用，尤其是提高剁椒中3‑甲基噻吩和/或3‑甲基丁酸含量的应用。

[0010] 第四方面，本发明还提供了一种剁椒的制备方法，所述方法为在辣椒中添加上述植物乳杆菌ZF624或发酵菌剂进行发酵的方法。

[0011] 进一步地，所述植物乳杆菌ZF624的添加量为105～106CFU/mL，优选106CFU/mL。

[0012] 进一步地，所述方法的发酵温度为28‑32℃。

[0013] 进一步地，所述方法的发酵时间为20‑28h。

[0014] 第五方面，本发明还提供了一种剁椒，所述剁椒由本发明所述的制备方法制得。

[0015] 本申请实施例中提供的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：

[0016] 1、本发明提供的植物乳杆菌ZF624，果胶酯酶活力高，用于制备剁椒，可以使辣椒2+
中的果胶去甲酯化，将高甲氧基果胶转化成低甲氧基果胶，进而与Ca 等金属离子生成果胶酸盐，明显改善剁椒脆度。

[0017] 2、本发明提供的植物乳杆菌ZF624发酵剁椒可以产生高浓度的3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸；3‑甲基噻吩主要具有橘子、柠檬、水果等香味，并带有一种类似煎炸食物的气息，被广泛用作食品香精和香料添加剂；3‑甲基丁酸主要具有乳脂、奶油、果香以及酸味，常被用作食品添加剂和香精的成分，用于增强食品的果香感；植物乳杆菌ZF624发酵剁椒可以使剁椒中3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸含量的增加，无需使用添加剂即可使发酵剁椒香气浓厚，远高于自然发酵的剁椒产品。

[0018] 3、本发明提供的植物乳杆菌ZF624发酵的剁椒储藏过程脆度下降趋势变缓，挥发性风味物质含量3‑甲基噻吩，3‑甲基噻吩在货架期内变化幅度较小，在货架期内均能保持较好的脆度和香气，提高剁椒的风味和品质。

附图说明

[0019] 图1为植物乳杆菌ZF624在MRS平板上菌落形态图；

[0020] 图2为植物乳杆菌ZF624革兰氏染色后显微镜观察形态图；

[0021] 本发明提供的植物乳杆菌(Lactiplantibacillus plantarum)ZF624，已于2023年7月25日保藏于广东微生物菌种保藏中心，地址：广东省广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为GDMCC No:63685；该菌株于2023年7月25日由保藏中心收到并登记入册，经保藏中心于2023年7月25日检测为存活菌株。

具体实施方式

[0022] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。但是，本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明的公开内容的理解更加透彻全面。

[0023] 除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。

[0024] 除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本领域常规食品级试剂、方法和设备。

[0025] 本文中在本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本发明。本文所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0026] 实施例1目的菌株的筛选

[0027] 1.原材料处理

[0028] 取1g豆瓣酱到9mL无菌生理盐水中，均质处理为均一的悬浊液，使用无菌水10倍梯‑8度稀释至10 ，每个浓度取100μL分别涂布于含0.012‰溴甲酚紫溶液的MRS固体培养基上，
37℃恒温培养48‑72h。培养结束后在固体MRS平板上挑选菌落周围变黄的单菌落，接种MRS固体培养基，进行平板划线分离，如此重复2至3次，直至获得纯的单菌落。

[0029] 2.菌株初筛

[0030] 将挑选的菌落使用通用引物扩增16S rDNA序列，进行测序分析，获得序列后在NCBI进行BLAST分析，确定菌落种属，从中挑选可食用的代表菌株进行后续试验。共筛选8株菌，编号FJ041‑FJ048。

[0031] 3.菌株复筛

[0032] (1)菌株活化：用无菌移液枪吸取0.1mL保存菌液接入100mLMRS液体培养基中活化，控制温度37℃，静置培养24h；取1mL活化菌液接种到100mLMRS液体培养基进行活化，控制温度37℃，静置培养24h；再取1mL二次活化菌液接种到100mLMRS液体培养基进行扩培，控制温度37℃，静置培养24h，培养结束后离心除去上层发酵液，往下层沉淀中加入100mL蒸馏水即可制得发酵种子液，备用。

[0033] (2)剁椒发酵：将大红尖椒和指天椒用自来水清洗干净，去蒂后切成0.5cm*0.5cm块状，备用；脱皮大蒜切成蒜末，备用；将玻璃坛置于沸水中煮10min，捞出冷却备用；往消毒后的玻璃坛中依次加入17％自来水、3％食盐、2％白糖，搅拌使食盐、白糖溶解，待食盐、白糖全部溶解后再依次加入48％大红尖椒、12％指天椒、2％大蒜，搅拌均匀后接入12％种子液发酵，控制发酵温度30℃，静置发酵24h，发酵结束后加入2％食盐，2％白酒。

[0034] (3)理化指标的检测：发酵结束，从各坛中取样进行剁椒脆度和果胶酯酶活性、果胶酸钙含量检测，检测结果记录于表1中。

[0035] 表1初筛菌株发酵剁椒理化指标检测结果

[0036]编号 脆度Fmax(g) 果胶酯酶活力(U/g) 果胶酸钙含量(ug/g)
FJ041 3942 14.05 159.18
FJ042 2523 8.77 132.18
FJ043 3324 13.25 155.72
FJ044 3125 9.60 140.72
FJ045 3721 13.72 158.86
FJ046 3256 9.21 135.13
FJ047 2689 8.95 133.25
FJ048 2601 8.83 132.79
自然发酵组 2975 10.71 147.27

[0037] 如表1所示，经FJ041、FJ045、FJ043发酵后的剁椒脆度最高，分别达到3942g、3721g、3324g，果胶酯酶活力分别为14.05U/g、13.72U/g、13.25U/g，果胶酸钙含量分别为
159.18ug/g、158.86ug/g，155.72ug/g。

[0038] (4)挥发性风味物质含量检测：通过GC‑MS检测剁椒样品中香气物质3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸的含量，筛选香气物质含量最高的菌种。剁椒挥发性风味物质含量结果如表2所示。

[0039] 表2不同菌株发酵剁椒挥发性风味物质含量结果

[0040]菌株名称 3‑甲基噻吩(μg/kg) 3‑甲基丁酸(μg/kg)
FJ041 197.85 134.21
FJ042 160.42 101.25
FJ043 101.76 82.39
FJ044 154.47 125.78
FJ045 146.53 109.98
FJ046 85.64 98.23
FJ047 96.54 95.12
FJ048 77.56 67.12
不接种对照组 46.24 37.34

[0041] 由表2结果可知，FJ041样品挥发性风味物质含量最高，3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸含量分别为197.85μg/kg、134.21μg/kg。

[0042] (5)感官鉴评：选择辣椒发酵研究领域的研究人员20人对剁椒进行感官鉴评，将所有的样品进行随机摆放，评价员评价每种剁椒的色泽、香气、口感和形态4个指标并且打分，打分区间为1至100分，并计算样品得分平均值。评价标准详见表3，感官评分结果如表4所示。

[0043] 表3剁椒的感官评价标准

[0044] 项目 色泽 脆度 酸感 发酵风味20～25分 色泽明艳 很脆 适当 浓郁
13～19分 略带褐色 有脆度 稍强或稍淡 较浓郁
6～12分 淡黄褐色 稍有脆度 较强或较淡 较淡
0～5分 暗棕褐色 软烂 很强或很淡 没有

[0045] 表4不同菌株发酵剁椒感官评分结果

[0046]菌株名称 色泽评分 脆度评分 酸感评分 风味评分 综合得分
FJ041 19.0 19.4 17.7 18.1 18.55
FJ042 16.1 17.1 16.5 16.9 16.65
FJ043 17.9 18.1 16.8 17.5 17.58
FJ044 19.7 18.0 17.6 17.8 18.28
FJ045 18 18.8 18.7 17.2 18.18
FJ046 18.1 18.6 17.7 16.5 17.73
FJ047 17.3 17.2 18.0 17.9 17.60
FJ048 18.1 17.3 17.9 18.6 17.98

[0047] 由表4结果可知，经FJ041发酵后的剁椒得分最高为18.55，该菌株挥发性风味物质3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸含量也是最高，因此FJ041为最佳选择。

[0048] 该菌株为植物乳杆菌，在固体MRS平板培养基上的形态观察如图1所示，菌落直径3mm‑5mm，菌落呈现乳白色，菌落凸起、呈圆形，表面光滑，菌落边缘整齐。显微镜观察如图2所示，将其命名为植物乳杆菌ZF624，于2023年7月25日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No:63685。

[0049] 实施例2植物乳杆菌ZF624传代稳定性检测

[0050] 将0.2mL植物乳杆菌ZF624甘油冻存液接种到100mL的MRS肉汤培养基中，在37℃下静置培养24h，按1％的接种量到100mL MRS肉汤培养基中，在37℃下静置培养培养24h，获得第一代发酵液，同样培养条件，培养10代，分别在1代、5代、10代取样备用。

[0051] 分别取1代、5代、10代发酵液1mL，12000rpm/min下离心2分钟，无菌生理盐水洗涤2‑3次，重悬，稀释适宜倍数，制成种子液。按实施例1所述的方法接种种子液进行剁椒发酵，
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植物乳杆菌ZF624接种比例为12％，终浓度为1×10 CFU/g，控制发酵温度30℃，静置发酵
24h。发酵结束后，以脆度、果胶甲酯酶活力、3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸含量为指标，确定植物乳杆菌ZF624传代发酵性能的稳定性。结果分别记录于表5中。

[0052] 表5不同传代次数菌种发酵对剁椒的影响结果

[0053]

[0054]

[0055] 由表5可知，经第1代、5代、10代植物乳杆菌ZF624发酵后的剁椒，脆度、果胶甲酯酶活力、果胶酸钙含量、3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸含量等指标均无显著性差异，可见植物乳杆菌ZF624在连续培养10代期间，其发酵特性没有发生改变且相对稳定，是一种可长期使用的安全菌种。

[0056] 实施例3植物乳杆菌ZF624接种浓度对剁椒发酵的影响

[0057] 将0.2mL植物乳杆菌ZF624甘油冻存液接种到100mL的MRS肉汤培养基中，在37℃下静置培养24h，按1％的接种量接种到100mL MRS肉汤培养基中，在37℃下静置培养培养24h，取发酵液1mL，12000rpm下离心2分钟，无菌生理盐水洗涤2‑3次，重悬，稀释适宜倍数，制成种子液。

[0058] 按实施例1所述的方法接种种子液进行剁椒发酵，种子液添加比例保持为12％不4 5 6
变，植物乳杆菌ZF624接种终浓度分别为1×10 CFU/g、1×10 CFU/g、1×10 CFU/g、1×
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10CFU/g，控制发酵温度30℃，静置发酵24h。以脆度、果胶甲酯酶活力、3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸含量为指标，确定不同接种浓度对剁椒发酵的影响，结果记录于表6中。

[0059] 表6不同浓度菌种发酵对剁椒的影响结果

[0060]

[0061] 由表6可知，接种一定浓度植物乳杆菌ZF624发酵剁椒，可以明显增加剁椒的脆度，且在一定范围内，接种浓度越高，剁椒脆度越高，其果胶酯酶活性、果胶酸钙、3‑甲基噻吩、6
3‑甲基丁酸含量也随之增加，当植物乳杆菌ZF624接种浓度在1×10CFU/g时，剁椒脆度达到最大为3942g，同时果胶甲酯酶活力，果胶酸钙含量，挥发性风味物质3‑甲基噻吩、3‑甲基
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丁酸的含量也达到最高；但是当植物乳杆菌ZF624接种量为1×10CFU/g时，剁椒脆度、果胶甲酯酶活力、果胶酸钙含量、挥发性风味物质3‑甲基噻吩、3‑甲基丁酸的含量反而均有所下降。

[0062] 实施例4植物乳杆菌ZF624发酵剁椒货架期实验

[0063] 将大红尖椒和指天椒用自来水清洗干净，去蒂后备用；脱皮大蒜切成蒜末，备用；将玻璃坛置于沸水中煮10min，捞出冷却备用；往消毒后的玻璃坛中依次加入17％自来水、
3％食盐、2％白糖，搅拌使食盐、白糖溶解，待食盐、白糖全部溶解后再依次加入48％大红尖椒、12％指天椒、2％大蒜，搅拌均匀后接入12％植物乳杆菌ZF624种子液(终浓度为1×
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10 CFU/g)发酵，控制发酵温度30℃，静置发酵24h，发酵结束后加入2％食盐，2％白酒。同时，以自然发酵的样品为货架期对照组。

[0064] 发酵结束后用灭菌纱布进行固液分离，分别称量发酵液和固形物的质量。发酵液置于密闭容器内，70℃加热20min。待发酵液温度降至60℃后，将发酵液加入固形物中，60℃加热10min。待冷却至室温后，称量发酵液和固形物的总质量，损失的水分用无菌水补足。

[0065] 按比例将发酵液和固形物装入250mL酱瓶中，每瓶装入“发酵液”与“固形物”合计150g，分别置于常温、40℃烘箱、50℃烘箱。按照表7的取样安排取样检测脆度、3‑甲基噻吩、
3‑甲基丁酸含量等理化指标，结果记录于表8中。

[0066] 表7货架期取样时间和数量

[0067]温度 第二周 第四周 第八周 第十二周 第十六周
常温 各1瓶 各1瓶 各1瓶 各1瓶 各1瓶
40℃ 各1瓶 各1瓶 各1瓶 各1瓶 各1瓶
50℃ 各1瓶 各1瓶 / / /

[0068] 表8剁椒货架期理化指标检测结果

[0069]

[0070]

[0071] 由表8可知，在货架期内，剁椒脆度整体呈下降的趋势，接种ZF624发酵的样品整体脆度下降的趋势小于自然发酵的样品。40℃储存第十六周，接种ZF624发酵的样品脆度为2978，相比初始样下降24.5％；自然发酵的样品脆度为1411，相比初始样下降52.6％。50℃储存第四周时，接种ZF624发酵的样品脆度为2864，相比初始样下降27.3％；自然发酵的样品脆度为1396，相比初始样下降53.1％。因此，接种ZF624，在货架期内对剁椒产品具有较好的保脆效果，脆度变化较小。挥发性风味物质含量3‑甲基噻吩，3‑甲基噻吩在货架期内变化幅度较小，货架期内接种ZF624发酵的剁椒产品的香气远高于自然发酵的剁椒产品。

[0072] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。