外囊泡负载化妆品原料和/或药物的方法及复合物和应用

摘要

本发明涉及一种外囊泡负载化妆品原料和/或药物的方法及复合物和应用，采用ABC Melt微流控负载技术。此方法包括：将外囊泡工作液与化妆品和/或药物原料工作液分别吸到微流控仪器的两个进样器中，采用微流控技术控制两种工作液的流量、流向和温度，形成流体压力差，使化妆品和/或药物原料负载到外囊泡中。本发明的微流控负载方法无需额外耗材，成本低，且具有操作简单快速（0.5min‑10min），负载阳性率高可达89.1%）的特点。

权利要求

1.一种外囊泡负载化妆品原料的方法，其特征在于，包括：将外囊泡工作液与化妆品原料工作液分别吸到微流控仪器的两个进样器中，采用微流控技术控制两种工作液的流量、流向和温度，形成流体压力差，使化妆品原料负载到外囊泡中；

其中，微流控中，

总流率1‑120mL/min；

两种工作液之间的流向角度为90‑180°；

流率比为1:（3‑6）；

温度范围为4‑45℃；

外囊泡选自植物类囊泡和哺乳动物来源外囊泡中的一种或几种；植物类囊泡选自高山火绒草类囊泡、天山雪莲类囊泡、滨海刺芹类囊泡、海茴香类囊泡、人参类囊泡和生姜类囊泡中的一种或几种；哺乳动物来源外囊泡为乳源外囊泡；

化妆品原料选自玻色因和依克多因中的一种或两种。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微流控中，两种工作液之间的流向角度为

120‑180°。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微流控中，温度范围为20‑45℃。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微流控中，总流率10‑60mL/min。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，微流控中，总流率45‑50mL/min。

8

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，外囊泡工作液中的外囊泡的含量为1×10‑

14

1×10 个/mL。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，外囊泡工作液中的外囊泡的含量为1×

10 13

10 ‑1×10 个/mL。

8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，化妆品原料工作液的浓度为0.000001‑

10g/mL。

9.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，化妆品原料工作液的浓度为0.00001‑5g/mL。

10.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，外囊泡工作液与化妆品原料工作液按上样体积比为1:1‑1:5。

11.根权利要求9所述的方法，其特征在于，外囊泡工作液与化妆品原料工作液按上样体积比为1:1‑1:3。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少60%的外囊泡中负载有化妆品原料。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少65%的外囊泡中负载有化妆品原料。

14.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少70%的外囊泡中负载有化妆品原料。

15.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少74%的外囊泡中负载有化妆品原料。

16.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，至少80%的外囊泡中负载有化妆品原料。

17.一种权利要求1至16任一所述的方法制得的外囊泡负载化妆品原料的复合物，其特征在于，至少60%的外囊泡中负载有化妆品原料。

18.一种权利要求1至16任一所述的方法制得的外囊泡负载化妆品原料的复合物在制备护肤产品中的应用。

说明书

外囊泡负载化妆品原料和/或药物的方法及复合物和应用

技术领域

[0001] 本发明属于护肤品或药品技术领域，涉及一种外囊泡负载化妆品原料和/或药物的方法及复合物和应用。

背景技术

[0002] 颜值经济有很大的刚性需求和市场。皮肤是人体最大的器官，对于分子量较大或化学性质不稳定的美容原料，其活性的发挥也会受到皮肤屏障渗透率问题的限制。在化妆品领域，应用较广的递送系统包括环糊精包合物技术和多种微粒递送系统：微囊和微球、脂质体和新型脂质体、纳米乳和亚微乳、脂质纳米粒等，这些载体是化学合成的物质，容易引发过敏反应，存在较大的安全性风险。因此，开发更安全的天然递送载体技术迫在眉睫。

[0003] 近些年迅速发展起来的天然纳米囊泡也能作为递送系统，天然纳米囊泡属于纳米尺寸的细胞外囊泡或植物类囊泡。天然纳米囊泡的双层膜的脂质结构和纳米级尺寸，使其具备良好的细胞膜穿透能力，目前多被开发应用于静脉给药的器官靶向递送或破损皮患处的外用给药，而健康完整皮肤表面的化妆品原料递送应用的报道较少。

[0004] 天然纳米囊泡可以产生自哺乳动物、植物和微生物的所有物种。

[0005] 目前哺乳动物细胞培养来源的纳米囊泡应用最广，如脂肪间充质干细胞外囊泡，脐带间充质干细胞外囊泡，293T细胞外囊泡等。但是，通过细胞培养体系从培养基上清中获得外囊泡进行产业化开发受到了外囊泡产量、成本和可及性的挑战。有研究显示在哺乳动物乳汁中外囊泡含量丰富且经济，如牛奶、羊奶、驼奶等，因此乳汁可以成为天然纳米囊泡的一个重要的来源，如天然牛奶来源的细胞外囊泡具有免疫调节、抗细菌感染、抗氧化等重要功能。

[0006] 植物外泌体样纳米囊泡（plant exosome‑like nanovesicles）是源于植物真核细胞的多泡体，通过后者与质膜融合释放到细胞外的一种膜性类囊泡，由于来源于植物，资源广泛，因此具有大规模生产的可行性。植物类囊泡在不同的酸碱度和温度下都能维持较好的理化稳定性，所有这些特征都使得植物类囊泡成为药物递送的理想的载体选择，具有广阔的应用前景。例如高山火绒草愈伤组织类囊泡提取自植物愈伤组织培养过程，其本身具有一定的美容活性，因而将其作为化妆品原料的载体，有增进化妆品原料功效的可能。

[0007] 在外囊泡的负载活性物质的技术中，静置孵育、超声负载、推阻融合技术、电穿孔法是常见的负载方法。静置孵育仅适用于分子量小的分子，负载效率低，耗时长（2h‑24h）；超声负载由于超声强度和时间的难以精确控制，重复性差，不当超声会造成对外囊泡结构的损伤；推阻融合技术目前以手动挤压或氮气助力的方式进行，自动化程度低，中间膜层因堵塞或破损需要经常更换，有耗材成本高，操作繁琐复杂的缺点。电穿孔法设备和试剂都很昂贵，且反应体系很小，通常为0.1‑1mL，常作科研探索用，不适合工业生产。微流控负载通过控制流体的流向和流量,从而形成被负载相（化妆品原料）和负载相（天然纳米囊泡）流体压力差，促进活性原料分子进入外囊泡内部的结构中。

[0008] 在化妆品领域，应用较广的递送系统包括环糊精包合物技术和多种微粒递送系统——微囊和微球、脂质体和新型脂质体、纳米乳和亚微乳、脂质纳米粒等，这些方法形成的载体多为人工化学合成技术，存在一定的致敏性和安全性风险。

[0009] 因此，有必要研发一种操作简便、负载阳性率高、安全性高的外囊泡负载方法。

发明内容

[0010] 针对现有技术的不足，本发明提供了一种外囊泡负载化妆品原料和/或药物的方法及复合物和应用。

[0011] 本发明用微流控方法实现外囊泡负载化妆品原料和/或药物的技术无需额外耗材，成本低，且具有操作简单快速（0.5min‑10min），负载阳性率高（可达89.1%）的特点。后续再经分离纯化技术将负载了活性分子的原料‑载体复合物提取出来。微流控作为新兴的精密制造技术，在天然纳米囊泡负载化妆品原料方面的研究和应用还未见报道。

[0012] 本发明所涉及的外囊泡包括哺乳动物外囊泡，植物外囊泡及微生物外囊泡。被负载物活性分子包括分子、蛋白、多肽、核酸等形式。本发明中创新性的采用微流控的方法实现天然纳米囊泡负载美容原料，具有负载阳性率高，操作简便，适合工业生产的特点。

[0013] 解决方案

[0014] 为实现上述目的，本发明提供了如下技术方案：

[0015] 第一方面，本发明提供一种外囊泡负载化妆品原料和/或药物的方法，包括：将外囊泡工作液与化妆品和/或药物原料工作液分别吸到微流控仪器的两个进样器中，采用微流控技术控制两种工作液的流量、流向和温度，形成流体压力差，使化妆品和/或药物原料负载到外囊泡中。

[0016] 进一步地，微流控中，总流率1‑120mL/min；流率比1:（1‑9）。

[0017] 进一步地，两种工作液之间的流向角度（即分别传输两种工作液的微流控通道1和微流控通道2之间的角度）之间的流向范围30‑180°，可选地为90‑180°。

[0018] 进一步地，微流控中，温度范围4‑45℃，可选地为20‑45℃。

[0019] 可选地，总流率10‑60mL/min，优选地为45‑50mL/min，优选为50mL/min。

[0020] 可选地，流率比为1:（2‑6），可选地为1:（3‑6），可选地为1：2、1：3、1：4、1：5或1：6。

[0021] 进一步地，外囊泡工作液中的外囊泡的含量为1×108‑1×1014个/mL个/mL，可选地10 13 10 12 11
为1×10 ‑1×10 个/mL，可选地为1×10 ‑1×10 个/mL，可选地为2×10 个/mL。

[0022] 和/或，化妆品原料或药物工作液的浓度为0.000001‑10g/mL，可选地为0.00001‑5g/mL。

[0023] 和/或，步骤1）中的外囊泡工作液与化妆品原料和/或药物工作液的体积比为1:1‑1:5，优选为1:1‑1:3。

[0024] 进一步地，至少60%的外囊泡中负载有化妆品原料和/或药物，可选地至少65%、至少70%、至少74%或至少80%的外囊泡中负载有化妆品原料和/或药物。

[0025] 进一步地，外囊泡选自植物类囊泡、哺乳动物来源外囊泡和微生物来源外囊泡中的一种或几种。

[0026] 进一步地，化妆品原料包括胜肽、胶原蛋白、玻色因、依克多因、麦角硫因中的一种或几种。

[0027] 进一步地，植物类囊泡选自高山火绒草类囊泡、天山雪莲类囊泡、滨海刺芹类囊泡、海茴香类囊泡、人参类囊泡和生姜类囊泡中的一种或几种。

[0028] 进一步地，哺乳动物来源外囊泡包括脂肪间充质干细胞外囊泡、脐带间充质干细胞外囊泡、293T细胞外囊泡和乳源外囊泡。

[0029] 第二方面，提供一种外囊泡负载化妆品原料和/或药物的复合物，至少60%的外囊泡中负载有化妆品原料和/或药物。

[0030] 进一步地，至少65%、至少70%、至少74%或至少80%的外囊泡中负载有化妆品原料和/或药物。

[0031] 可选地，外囊泡选自植物类囊泡、哺乳动物来源外囊泡和微生物来源外囊泡中的一种或几种。

[0032] 可选地，化妆品原料包括胜肽、胶原蛋白、玻色因、依克多因、麦角硫因中的一种或几种。

[0033] 可选地，植物类囊泡选自高山火绒草类囊泡、天山雪莲类囊泡、滨海刺芹类囊泡、海茴香类囊泡、人参类囊泡和生姜类囊泡中的一种或几种。

[0034] 可选地，哺乳动物来源外囊泡包括脂肪间充质干细胞外囊泡、脐带间充质干细胞外囊泡、293T细胞外囊泡和乳源外囊泡。

[0035] 可选地，所述复合物采用第一方面所述的方法制得。

[0036] 第三方面，提供一种第一方面所述的方法制得的外囊泡负载化妆品原料和/或药物、或第二方面所述的外囊泡负载化妆品原料和/或药物的复合物在制备护肤产品中的应用。

[0037] 本发明采用微流控的方式进行外囊泡负载化妆品原料（例如，高山火绒草负载玻色因），通过控制流体的流向和流量,从而形成被负载相（化妆品原料）和负载相（外囊泡）流体压力差，促进活性原料分子进入外囊泡内部的结构中。微流控负载无需额外耗材，成本低，且具有操作简单快速（0.5min‑10min），负载阳性率高，可达到89.1%的特点。与常规室温孵育法、超声负载法、推阻法相比，对其低负载率、低重复性、低自动化以及高成本等方面进行改进。高山火绒草外囊泡负载玻色因可以帮助玻色因更好地穿透皮肤，提高玻色因的生物利用度，有助于增强玻色因的作用功效。

[0038] 有益效果

[0039] 1）本发明提出采用微流控的方式进行天然纳米囊泡负载化妆品原料，该技术未在纳米囊泡的负载中应用过，本身具有方法学的创新性，且操作简单快速，比常规室温孵育法、超声负载法、推阻法、电穿孔法有更短的操作时间，更高的负载阳性率和负载量。并且其负载原理为利用流体的压力差进行负载，不需要额外的耗材，成本更低，更易于自动化控制和工业化生产。

[0040] 2）本发明所涉及的外囊泡包括哺乳动物外囊泡，植物外囊泡及微生物外囊泡。被负载物活性分子包括分子、蛋白、多肽、核酸等形式。本发明中创新性的采用微流控的方法实现天然纳米囊泡负载美容原料，具有负载阳性率高，操作简便，适合工业生产的特点。

[0041] 3）本发明的微流控法负载通过控制流体的流向和流量，从而形成被负载相（化妆品和/或药物原料）和负载相（天然纳米囊泡）流体压力差，促进活性原料分子进入外囊泡内部的结构中。微流控负载无需额外耗材，成本低，且具有操作简单快速（0.5min‑10min），负载阳性率高（可达89.1%）的特点。后续再经分离纯化技术将负载了活性分子的原料‑载体复合物提取出来。微流控作为新兴的精密制造技术，在天然纳米囊泡负载化妆品原料方面的研究和应用还未见报道。

附图说明

[0042] 一个或多个实施例通过与之对应的附图中的图片进行示例性说明，这些示例性说明并不构成对实施例的限定。在这里专用的词“示例性”意为“用作例子、实施例或说明性”。这里作为“示例性”所说明的任何实施例不必解释为优于或好于其它实施例。

[0043] 图1：本发明实施例1‑9微流控法合成负载玻色因的植物愈伤组织类囊泡纳米载体的技术路线图。

[0044] 图2：本发明的实施例9的阳性率。

[0045] 图3：本发明的实施例1‑9使用的高山火绒草类囊泡的电镜图。

[0046] 图4：本发明的实施例9的高山火绒草愈伤组织类囊泡负载玻色因的电镜图。

[0047] 图5：本发明的实施例10‑18微流控法合成负载依克多因的乳源外囊泡复合物的技术路线图。

[0048] 图6：本发明的实施例18的阳性率。

[0049] 图7：本发明的实施例10‑18使用的牛奶外囊泡的电镜图。

[0050] 图8：本发明的实施例18的牛奶外囊泡负载依克多因后的电镜图。

具体实施方式

[0051] 为更好的说明本发明，现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0052] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施案例仅是示例性的。

[0053] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。除非特殊说明，以下所用到的各种试剂均为商品化试剂，其中所用的化学试剂不低于分析纯。

[0054] 本发明采用微流控法，以天然纳米囊泡为载体，进行化妆品原料负载的制备技术，以提高化妆品原料的经完整皮肤递送的功效性能。

[0055] 本发明的微流控法是指通过精准控制层流液体的混合效应和反应条件来实现传统常规液体混合方法难以完成的微纳米粒制备技术。

[0056] 以下实施例中，玻色因购自福瑞达生物股份有限公司，高山火绒草愈伤组织来自高山火绒草种子培养成的愈伤组织。

[0057] 玻色因(Pro‑Xylane)，化学名称为羟丙基四氢吡喃三醇，是从山毛榉木糖中提取出来的一种木糖醇。玻色因可以促进细胞外基质糖胺聚糖（GAG）的分泌，增加真皮胶原的产生，达到促进真皮细胞修复、改善皮肤弹性、减少皱纹和增加皮肤紧致度的功效，从而对皮肤起到抗衰老的作用。目前，玻色因的抗皱紧致功效引起国内外美妆企业及爱美人士的强烈关注。玻色因是一种天然的抗氧化剂，它能够激活某些基因，促进细胞的自我修复和再生，改善肌肤敏感性和弹性。但其稳定性较差，在空气和光线下容易失效，因此需要特殊的保护措施。并且由于皮肤的屏障保护作用，玻色因在肌肤中的渗透性相对较低，导致其生物利用度较低，限制了其抗老效果。因而需要开发新的载体递送技术帮助其实现更好的功效。

[0058] 依克多因（Ectoin）是一种广泛存在于嗜盐菌和链球菌等非嗜盐菌中的环状氨基酸衍生物，可显著抑制转录因子AP‑2的活性，从而下调促炎因子的表达，具有良好的光防护效果。同时，依克多因也是常用的保湿剂，它的分子结构中含有较多的羧基和环状氨基，分子表面电荷分布密集，形成强烈的静电势，从而可以吸附的水分子起到保湿的效果，但是不当的存储会使其与环境中的水形成稳定的水结合物，从而降低其保湿的效果。

[0059] 本发明的微流控法用于植物愈伤组织类囊泡负载化妆品原料的工艺流程图见图1，以高山火绒草愈伤组织类囊泡负载化妆品原料玻色因为例：

[0060] 第一步，从高山火绒草愈伤组织培养液上清中通过超速离心的方法获得到高山火绒草类囊泡。

[0061] 第二步，用荧光染料FITC标记玻色因分子，以便后续对负载结果进行检测和分析。

[0062] 第三步，将高山火绒草愈伤组织培养液上清中分离得到高山火绒草类囊泡与玻色因工作液按1:1‑1:3体积比例分别吸到两个进样器中，完成样品准备。

[0063] 第四步，设置微流控的参数以使高山火绒草类囊泡负载玻色因。

[0064] 微流控中，总流率1‑120mL/min（可选地，总流率10‑60mL/min，优选地为45‑50mL/min，优选为50mL/min）；流率比1:（1‑9）（可选地，流率比为1:（2‑6），可选地为1：2、1：3、1：4、1：5或1：6）。

[0065] 进一步地，两种工作液之间的流向角度（即分别传输两种工作液的微流控通道1和微流控通道2之间的角度）之间的流向范围30‑180°，可选地为90‑180°。

[0066] 进一步地，微流控中，温度范围4‑45℃，可选地为20‑45℃。

[0067] 第五步，用超滤离心法或柱层析法分离去除未结合的外囊泡的游离玻色因，获得高山火绒草愈伤组织细胞类囊泡结合玻色因的样品。

[0068] 第六步，检测。纳米流式仪测定其颗粒数、阳性率等数据。

[0069] 第七步，结果统计。

[0070] 以下实施例中，纳米流式仪器不仅能够检测总的外泌体颗粒数，还有荧光通道可检测携带有荧光信号的外泌体。

[0071] 带有荧光信号的外泌体是指通过FITC等标记玻色因，成功负载玻色因的外泌体会发出荧光信号，而的游离多肽已在超滤洗涤中被洗去，故有阳性荧光信号的即为负载成功的。

[0072] 具体实施例如下：

[0073] 实施例1‑9：通过微流控法进行植物愈伤组织类囊泡负载化妆品原料玻色因。

[0074] 实施例1

[0075] 第一步，从高山火绒草愈伤组织培养液上清中通过超速离心的方法获得到高山火绒草类囊泡。

[0076] 第二步，用荧光染料FITC标记玻色因分子，以便后续对负载结果进行检测和分析。

[0077] 第三步，将高山火绒草愈伤组织培养液上清中分离得到高山火绒草愈伤组织类囊11
泡（2×10 个/mL）与玻色因溶液（1g/mL）按1:1‑1:3体积比例分别吸到两个进样器中，完成样品准备。

[0078] 第四步，设置微流控的参数：总流率50mL/min，流率比1:1，微流控通道1和微流控通道2之间的流向范围30‑89°，（设置微流控通道1和微流控通道2之间30‑89°的任意角度）；温度范围4‑19℃，（设置4‑19℃之间的任意温度）；以使高山火绒草类囊泡负载玻色因。

[0079] 第五步，用超滤离心法或柱层析法分离去除未结合的外囊泡的游离玻色因，获得高山火绒草愈伤组织细胞类囊泡结合玻色因的样品。

[0080] 第六步，检测。纳米流式仪测定其颗粒数、阳性率等数据。

[0081] 实施例2‑9与实施例1的区别如表1：

[0082] 表1实施例1‑9的植物类囊泡载体负载玻色因的主要参数

[0083] 。

[0084] 实施例1‑9的检测数据如表2：

[0085] 表2实施例1‑9的植物类囊泡载体负载化妆品的结果统计

[0086] 。

[0087] 表2中，回收率是指负载完收集的类囊泡总数量/原始投入的类囊泡数量。阳性率是指负载有玻色因的类囊泡数量/类囊泡总数量。

[0088] 表2中，回收率和阳性率为范围值，是因为进行了不同参数的尝试，

[0089] 例如，在实施例5中，载体：原料为1:1(v/v)时，总流率为50mL/min、流向90‑119°、温度20‑34℃时，回收率为67.3%，阳性率为61.9%，在载体：原料为1:3(v/v)时，总流率为50mL/min、流向90‑119°、温度20‑34℃时，回收率为63.4%，阳性率为62.9%，说明载体：原料为的投入比例对阳性率和回收率有一定的影响，但在载体：原料为1:1‑1:3（v/v）的范围内影响不大。

[0090] 根据表2可知，实施例1‑9的微流控条件负载操作下回收率没有显著性差异，代表了这些操作条件下没有造成明显的载体破坏和损失，经微流控负载的方法可以稳定地收集到处理后的样品。表2中也显示了纳米流式检测实施例1‑9中负载玻色因的高山火绒草愈伤组织类囊泡的阳性率。可以看到微流控中关键的三个技术参数是流率比、流向和温度，流率比为1：3‑1:6，流向：90‑180°，温度20‑45℃时，阳性率处于较高水平（≥70.5%）。

[0091] 流率比、流向和温度分别决定了负载时载体和原料之间剪切力的大小、受力方向和类囊泡吸附原料活性。从实施例1‑9结果中可以看到，随着流率比、流向角度和温度的增加，载体负载原料的阳性率呈现增加的趋势。在实验条件最佳的实施例9中，载体：原料为1:1，总流率为50mL/min，流率比为1:6，流向120‑180°，温度35‑45℃时，高山火绒草愈伤组织类囊泡的阳性率可高达80.4%（图2）。用TEM检测其负载前后的形态。图3为高山火绒草类囊泡负载前的电镜图；图4为负载玻色因的高山火绒草类囊泡的电镜图。对比图3和图4的结果可以看到负载前后植物类囊泡形态没有显著性变化，负载后有较好的形态完整性，说明微流控的流体压力基本不会对植物类囊泡形态造成损伤，可以高效地实现植物类囊泡负载化妆品原料。

[0092] 本发明还研究了通过微流控法进行哺乳动物细胞外囊泡负载化妆品原料效果，具体实施例如下：

[0093] 实施例10‑18：通过微流控法进行哺乳动物细胞外囊泡负载化妆品原料依克多因[0094] 微流控法用于哺乳动物乳汁来源的外囊泡负载化妆品原料的工艺流程图见图5.实施例10‑18以进行牛奶外囊泡负载化妆品原料依克多因为例，代表哺乳动物细胞乳源性外囊泡负载化妆品原料，摸索微流控法的关键技术参数：

[0095] 第一步，从市售的脱脂牛奶中通过超速离心的方法获得到牛奶外囊泡。

[0096] 第二步，用荧光染料FITC标记依克多因分子，以便后续对负载结果进行检测和分析。

[0097] 第三步，将牛奶外囊泡与依克多因溶液按1:1‑1:3比例分别吸到两个进样器中，完成样品准备。

[0098] 第四步，设置微流控的参数以使牛奶外囊泡负载依克多因。

[0099] 微流控中，总流率1‑120mL/min（可选地，总流率10‑60mL/min，优选地为45‑50mL/min，优选为50mL/min）；流率比1:（1‑9）（可选地，流率比为1:（2‑6），可选地为1：2、1：3、1：4、1：5或1：6）。

[0100] 进一步地，两种工作液之间的流向角度（即分别传输两种工作液的微流控通道1和微流控通道2之间的汇流角度）之间的流向范围30‑180°，可选地为90‑180°。

[0101] 进一步地，微流控中，温度范围4‑45℃，可选地为20‑45℃。

[0102] 第五步，用超滤离心法或柱层析法分离去除未结合的外囊泡的游离依克多因，获得牛奶外囊泡结合依克多因的样品。

[0103] 第六步，检测。纳米流式仪测定其颗粒数、阳性率等数据。

[0104] 第七步，结果统计。

[0105] 实施例10

[0106] 第一步，从市售的脱脂牛奶中通过超速离心的方法获得到牛奶外囊泡。

[0107] 第二步，用荧光染料FITC标记依克多因分子，以便后续对负载结果进行检测和分析。

[0108] 第三步，将牛奶外囊泡与依克多因溶液按1:1‑1:3比例分别吸到两个进样器中，完成样品准备。

[0109] 第四步，设置微流控的参数：总流率50mL/min，流率比1:1，微流控通道1和微流控通道2之间的流向范围30‑89°，（设置微流控通道1和微流控通道2之间30‑89°的任意角度）；温度范围4‑19℃，（设置4‑19℃之间的任意温度）；以使牛奶外囊泡负载依克多因。

[0110] 第五步，用超滤离心法或柱层析法分离去除未结合的外囊泡的游离依克多因，获得牛奶外囊泡结合依克多因的样品。

[0111] 第六步，检测。纳米流式仪测定其颗粒数、阳性率等数据。

[0112] 第七步，结果统计。

[0113] 实施例11‑18与实施例10的区别如表3：

[0114] 表3实施例10‑18微流控法哺乳动物乳源外囊泡负载依克多因的主要参数

[0115] 。

[0116] 实施例10‑18的检测数据如表4：

[0117] 表4实施例10‑18的哺乳动物细胞乳源外囊泡负载化妆品的结果统计

[0118] 。

[0119] 表4中，回收率是指负载完收集的类囊泡总数量/原始投入的类囊泡数量。阳性率是指负载有依克多因的类囊泡数量/类囊泡总数量。

[0120] 表4中，回收率和阳性率为范围值，是因为进行了不同参数的尝试，

[0121] 例如，在实施例14中，载体：原料为1:1（v/v）时，总流率为50mL/min、流向90‑119°、温度20‑34℃时，回收率为62.7%，阳性率为63.2%，在载体：原料为1:3（v/v）时，总流率为50mL/min时，、流向90‑119°、温度20‑34℃时，回收率为66.0%，阳性率为65.2%，说明投入载体和原料的比例对回收率和阳性率有一定的影响，但在1:1‑1:3（v/v）的范围内影响不大。

[0122] 根据表4，实施例10‑18的微流控条件负载操作下回收率没有显著性差异，代表了这些操作条件下没有造成明显的载体破坏损失，经微流控负载的方法可以稳定地收集到处理后的样品。表4中统计了纳米流式检测实施例10‑18中负载依克多因的牛奶外囊泡的阳性率。可以看到微流控中关键的三个技术参数是流率比、流向和温度范围，流率比为1：3‑1:6，流向为90‑180，温度为20‑45℃时，阳性率处于较高水平（≥61.3%）。

[0123] 流率比和循环次数分别决定了负载时载体和原料之间剪切力的大小和次数。从实施例10‑18结果中可以看到，随着流率比、流向角度和温度的增加，载体负载原料的阳性率呈现增加的趋势。在实验条件最佳的实施例18中，牛奶外囊泡负载依克多因阳性率可高达89.1%（图6）。用TEM检测其负载前后的形态。图7为牛奶外囊泡负载前的电镜图；图8为负载依克多因的牛奶外囊泡的电镜图。对比图7和图8的结果可以看到负载前后牛奶外囊泡的形态没有显著性变化，负载后有较好的形态完整性，说明微流控的流体压力基本不会对哺乳动物细胞外囊泡形态造成损伤，可以高效地实现哺乳动物细胞外囊泡负载化妆品原料。

[0124] 本发明在研究外囊泡负载化妆品原料时，还进行了多种负载方法，例如室温孵育法、超声法、推阻法等，具体地：

[0125] 对比例1：通过室温孵育法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因

[0126] 以高山火绒草愈伤组织类囊泡负载化妆品原料玻色因为例，第一步，从高山火绒草愈伤组织培养液上清中通过超速离心的方法获得到高山火绒草类囊泡。第二步，用荧光染料FITC标记玻色因分子，以便后续对负载结果进行检测和分析。第三步，将高山火绒草愈伤组织培养液上清中分离得到高山火绒草类囊泡与玻色因工作液按1:1‑1:3比例分别吸到两个进样器中，完成样品准备。第四步，室温孵育法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因：室温下（4‑40℃），转速40‑200rpm；时间2‑24h。第五步，用超滤离心法或柱层析法分离去除未结合的外囊泡的游离玻色因，获得高山火绒草愈伤组织细胞类囊泡结合玻色因的样品。第六步，检测。纳米流式仪测定其颗粒数、阳性率等数据。第七步，结果统计见表5，室温孵育法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因阳性率为0.4‑10.2%（尝试不同参数的结果）。

[0127] 对比例2：通过超声法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因

[0128] 以高山火绒草愈伤组织类囊泡负载化妆品原料玻色因为例，第一步，从高山火绒草愈伤组织培养液上清中通过超速离心的方法获得到高山火绒草类囊泡。第二步，用荧光染料FITC标记玻色因分子，以便后续对负载结果进行检测和分析。第三步，将高山火绒草愈伤组织培养液上清中分离得到高山火绒草类囊泡与玻色因工作液按1:1‑1:3比例分别吸到两个进样器中，完成样品准备。第四步，超声法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因：功率50‑300W；频率40‑100Hz；占空比20%‑100%；时间0.5‑30min。第五步，用超滤离心法或柱层析法分离去除未结合的外囊泡的游离玻色因，获得高山火绒草愈伤组织细胞类囊泡结合玻色因的样品。第六步，检测。纳米流式仪测定其颗粒数、阳性率等数据。第七步，结果统计见表5。超声法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因阳性率为7.5‑49.7%。超声法中要达到高阳性率需要精确控制超声条件为：功率为120W，频率为50Hz；占空比为50%；时间为3min。由于超声法受影响的因素很多，负载重复性差，阳性率变化较大，且超声产热，同时机械力控制不当容易造成植物类囊泡破裂。

[0129] 对比例3：通过推阻法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因

[0130] 以高山火绒草愈伤组织类囊泡负载化妆品原料玻色因为例，第一步，从高山火绒草愈伤组织培养液上清中通过超速离心的方法获得到高山火绒草类囊泡。第二步，用荧光染料FITC标记玻色因分子，以便后续对负载结果进行检测和分析。第三步，将高山火绒草愈伤组织培养液上清中分离得到高山火绒草类囊泡与玻色因工作液按1:1‑1:3比例分别吸到两个进样器中，完成样品准备。第四步，推阻法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因：400nm膜3‑20次，200nm膜3‑20次，100nm膜3‑20次。第五步，用超滤离心法或柱层析法分离去除未结合的外囊泡的游离玻色因，获得高山火绒草愈伤组织细胞类囊泡结合玻色因的样品。第六步，检测。纳米流式仪测定其颗粒数、阳性率等数据。第七步，结果统计见表5。推阻法进行植物类囊泡负载化妆品原料玻色因阳性率为10.3‑56.6%。推阻法要达到高阳性率需要精确控制推膜的次数，优先地为：400nm膜10次，200nm膜10次，100nm膜20次。

[0131] 主要参数比较如表5：

[0132] 表5不同方法进行高山火绒草愈伤组织类囊泡负载化妆品原料玻色因的结果

[0133] 。

[0134] 表5中，阳性率是指负载有玻色因的类囊泡数量/类囊泡总数量。

[0135] 表5中，回收率和阳性率为范围值，是因为进行了不同参数的尝试。

[0136] 由上述结果可知，经过不断地条件优化，对比例1‑3的阳性率最高56.6%，而微流控法的实施例9可以达到77.3‑80.4%的阳性率，为各种方法最高。经荧光光谱仪检测其玻色因的负载量为0.14g玻色因/1g纳米类囊泡，是其他常规负载方案中最高的方法。

[0137] 上述说明示出并描述了本发明的优选实施案例，如前所述，应当理解本发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施案例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离本发明的精神和范围，则都应在本发明所附权利要求的保护范围内。