苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因及其应用

摘要

本发明公开了一种苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因、检测引物及其应用，所述内参基因为McHMG1/2,所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明的发明人根据大量的数据分析及经验积累，经过严格的内参筛选程序，首次从众多候选新内参基因中筛选出苦瓜不同组织和不同成熟阶段果实中均表达最稳定的内参基因McHMG1/2，可适用于不同组织和成熟阶段苦瓜果实中果实成熟相关基因或其他功能基因的表达分析，显著提高所得数据的稳定性、可靠性和准确性，为功能基因表达的精确定量提供有力支持。

权利要求

1.McHMG1/2基因作为苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因的应用，其特征在于，所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2.McHMG1/2基因在苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的相对表达量分析中的应用，其特征在于，所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

3.检测McHMG1/2基因的特异性引物在苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的相对表达量分析中的应用，其特征在于，所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述特异性引物包括如SEQ ID NO.2所示的正向引物、以及如SEQ ID NO.3所示的反向引物。

4.检测McHMG1/2基因的试剂在苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的相对表达量分析中的应用，其特征在于，所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.检测McHMG1/2基因的试剂盒在苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的相对表达量分析中的应用，其特征在于，所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

6.根据权利要求2～5任一项所述的应用，其特征在于，所述基因相对表达量分析的方法为实时荧光定量PCR法。

说明书

苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于荧光定量PCR检测技术领域，更具体地，本发明涉及一种苦瓜不同器官和不同成熟期果实的内参基因、检测引物及其应用。

背景技术

[0002] 苦瓜(Momordica charantia L.)属于葫芦科一年生攀缘性草本植物，广泛种植于世界热带和亚热带地区。苦瓜各种器官的提取物，特别是茎、叶和果实，具有显著的药理作用，包括抗糖尿病、驱虫、抗肿瘤和抗炎等。绿熟期的苦瓜果实具有的独特风味和健康益处，性寒味苦、营养丰富，含有黄酮、多糖、生物肽、苦瓜甙、苦瓜素等活性成分，在我国被当作药膳兼具的蔬菜。然而，苦瓜果实作为一种典型的呼吸跃变性果实，采后不久就会迅速黄熟和软化，导致其食用和商业价值急剧下降。随着苦瓜遗传改良研究的深入，利用分子生物学技术探究苦瓜成熟相关基因的精确表达模式成为重要的研究内容。

[0003] 实时荧光定量PCR(qRT‑PCR)技术通常被用于分析目的基因的表达模式。使用qRT‑PCR技术精确检测苦瓜成熟相关基因的表达模式，需要筛选出在不同苦瓜组织，特别是不同成熟阶段果实中都能稳定表达的内参基因作为参照。

[0004] 目前，绝大多数苦瓜的分子生物学研究还在使用传统的内参基因，例如肌动蛋白‑7(ACT7)、甘油醛‑3‑磷酸脱氢酶(GAPDH)、18S核糖体RNA(18SrRNA)、肽基‑脯氨酰顺反式异构酶(CYP)和延伸因子1‑α(EF1α)等。然而，不断有研究表明，大部分传统内参基因在不同的植物物种、不同的组织器官、实验条件和发育阶段中表达并不稳定。这些传统内参基因是否可以用来精确量化苦瓜果实成熟相关基因的表达水平还不得而知。最近对苦瓜内参基因的一项研究也仅使用了幼苗的叶组织，并不全面。

[0005] 迄今为止，在不同苦瓜组织中、特别是在不同成熟阶段的果实中使用系统验证的内参基因还未见报道。

发明内容

[0006] 基于此，本发明的目的在于提供一种苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因、检测引物及其应用，所述内参基因在苦瓜不同组织和不同成熟期果实中均能稳定表达。

[0007] 实现上述发明目的的技术方案包括如下。

[0008] 本发明的第一方面，提供了一种苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因，其特征在于，所述内参基因为McHMG1/2,所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0009] 本发明的第二方面，提供了一种检测苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因的特异性引物，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.2所示的正向引物、以及如SEQ ID NO.3所示的反向引物。

[0010] 本发明的第三方面，提供了一种上述内参基因、或特异性引物在苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的相对表达量分析中的应用。

[0011] 本发明的第四方面，提供了一种含有上述特异性引物的检测试剂或试剂盒

[0012] 本发明的第五方面，提供了一种苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的实时荧光定量PCR检测方法，所述实时荧光定量PCR检测方法中使用McHMG1/2基因作为内参基因，所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0013] 本发明的发明人根据大量的数据分析及经验积累，经过严格的内参筛选程序，首次从众多候选新内参基因中筛选出苦瓜不同组织和不同成熟阶段果实中均表达最稳定的内参基因McHMG1/2，可适用于不同组织和成熟阶段苦瓜果实中果实成熟相关基因或其他功能基因的表达分析，显著提高所得数据的稳定性、可靠性和准确性，为功能基因表达的精确定量提供有力支持。

附图说明

[0014] 图1为本发明实施例1中用于RNA‑Seq的不同组织或器官以及不同成熟阶段的苦瓜示意图；其中，A为根；B为叶；C为雄花；D为雌花；E为茎；F为绿熟期的苦瓜果实；G为破色期的苦瓜果实；H为半黄期的苦瓜果实；I为全黄期的苦瓜果实；B～E中比例尺为1厘米；A、F～I中比例尺为5厘米。

[0015] 图2为本发明实施例2中对qRT‑PCR扩增引物的特异性分析。

[0016] 图3为本发明实施例2中已建立的5个内参基因(ERG)和11个候选新内参基因(NRG)的表达水平热图(A)和表达水平范围(B)；其中，红色表示高转录水平，蓝色表示低转录水平；R，根；S，茎；Fm，雄花；ff，雌花；L，叶；Pg，绿熟期果肉；Pb，破色期果肉；Pt，半黄期果肉；Py，全黄期果肉。

[0017] 图4为本发明实施例2中已建立的5个内参基因和11个候选新内参基因的表达稳定性分析；其中，A～E分别为基于geNorm、BestKeeper、ΔCt方法、NormFinder和RefFinder的16个候选内参基因的稳定性值；F为通过geNorm软件的成对变异(V)分析。

[0018] 图5为本发明实施例3中内参基因McHMG1/2的稳定性验证；其中，R，根；S，茎；Fm，雄花；ff，雌花；L，叶子；Pg，绿熟期果肉；Pb，破色期果肉；Pt，半黄期果肉；Py，全黄期果肉。

具体实施方式

[0019] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。

[0020] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。

[0021] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook等人，分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual,2013)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。

[0022] 在本发明中，发明人首先根据苦瓜不同组织和不同成熟阶段果实的转录组测序(RNA‑Seq)数据，计算每个基因转录本的变异系数(CV)、组织特异性系数(τ)和每千个碱基的转录每百万映射读取的转录本(TPM)，按照CV<0.5、τ<0.5和平均log2(TPM)>5的标准，筛2
选出11个候选新内参基因；然后，以相关系数(R)接近1，扩增效率接近100％，熔解曲线峰单一作为标准，对获得的11个候选新内参基因设计特异性扩增引物；接着，以从苦瓜不同组织和不同成熟阶段果实中cDNA为模板，在CFX96实时荧光定量PCR仪上进行荧光定量PCR反应，获得各个内参基因的表达数据Cq值，根据所得Cq值通过geNorm，NormFinder，ΔCt和BestKeeper四种软件对候选新内参基因进行稳定性评价，再使用RefFinder软件综合分析四种稳定性评价结果，选择综合稳定性最强的基因McHMG1/2作为苦瓜不同组织和不同成熟阶段果实的新内参基因；最后使用新内参基因McHMG1/2对果实成熟相关基因进行表达量校准分析验证其可靠性。本发明根据大量的数据分析及经验积累，经过严格的内参筛选程序，摆脱了传统内参基因的选择限制，首次从众多候选新内参基因中筛选出苦瓜不同组织和不同成熟阶段果实中均表达最稳定的内参基因，作为荧光定量的新内参基因。本发明中筛选得到的内参基因McHMG1/2适用于不同成熟阶段苦瓜果实中果实成熟相关基因或其他功能基因的表达分析，其应用较为普遍，能显著提高所得数据的稳定性、可靠性和准确性，为功能基因表达的精确定量提供有力支持。

[0023] 在本发明的其中一些实施例中，公开了一种苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因，所述内参基因为McHMG1/2,所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0024] McHMG1/2基因的核苷酸序列(SEQ ID NO.1)

[0025] TTTCAATTTGGCCTCTCGGACTTAATATCTCTCTTCTTTTTACTATCTTTCG

[0026] GTTCCCCTTTCCTCACACGCAGGTCCGCTCCCTCCACCCTCTTCAAACCCT

[0027] AAACCTAACCCAGCCTCGCTCCGGAGCCCCCCACCGAGGTTCGTTTCATC

[0028] GATCTCCTTCCAATTCCGACCTAATTTCACGTCTTTTCATTGTTTTCCTTCG

[0029] AGATTGTTGCTGATCCGATCTTATAACTGCAGGATTCGACATGAAAGGTG

[0030] GAAAATCGAAGTCCGAGTCGAAGAAAGCAGACGCGAAGTGAGTTTTTTTT

[0031] TTTTTTTTCTCGCCCTATTTCTCCGTCGGATGTGTTTAATTTATAGCTCTGA

[0032] TCGGCCCTAGATTTAAGAAGCTTCGTTGCTTAAATTACCTTTGTAAAAGCT

[0033] ATGCGTTGACCTTTTCTTTTTTGATTGATCGGTTTTGGCGATCTTTTTTGTA

[0034] GGCTTTCTGTGAAGAAAGGTGCAGCCAAAGCGGGCGCAACACGGGGTAA

[0035] GAAAGCAGGGAAGGATCCTAACAAACCTAAGCGGCCGGCCAGTGCCTTC

[0036] TTCGTTTTTATGTAATTATTTCATTTTTCAATTTACTTTTAGATGTCTGAAT

[0037] TACGCTGCTTGACTGCAAATTATTCATTCGGATGGTTGTAGAGTTGGAAA

[0038] AATTGCAAACAAGGAAGAAAAGAACTATGAAGTTGTTTTCGGTGATTTTT

[0039] GTTTAAGGATGTTAAATAAGCCGGCTTTCAACAAAACGATCTCTGTGTTA

[0040] TATGTGTATTTAGCTAGTGGACCCGTTCTTTTGTTTTATCTGTAAGTCGATT

[0041] ACGTATCTAAAATCTGTGTTGTCATGTTGTTGCACGTTTTGTAATTAAAGG

[0042] GAGGAGTTCAGGAAGAAGTTTAATGAAGAGAATCCGAATAACAAAGCAG

[0043] TATCCGCTGTAAGCTATTTACCTTTGTCTAATTGTCAATTCTTTTTTCTTGT

[0044] CCCCATTTCATATTATATAAATTCTTTTATGGAAATGAGCAGTTATAATTG

[0045] ACCTACAAATGATACCATCAGGTTGGTAAAGCTGCTGGACAGAAATGGA

[0046] AATCATTGTCAGATGCTGTACGTGATACCTCTCGTAGTATTTTCTAAATTT

[0047] CTCCTGGTATTATAAACTCTGTCTGAATTACTGTTTATAATATCAGGAAAA

[0048] AGCACCTTACATTGCTAAGGCTGACAAGAGGAAGGTTGAATATGAGAAA

[0049] AATATGAAGGCCTATAACAAGAAACAGGTACTGAAAACTTTCCGAATCTT

[0050] ATATTTTGCAGCTGTATTTTATTTTGTAAATTCATTATCTCTCCCTGCTCCA

[0051] TTTGAGTTCAGGCCAGTGGAGCCAATGCTGCTGAAGAAGATGAATCTGAG

[0052] AAGTCCATGTCTGAGGTGAATGATGATGAGGATGGAGACGAGGGCAGCG

[0053] AAGAGGTTAGTGGGTTGAAGAATTTTTTCCAGTCATTATTGTGCTTTGTAC

[0054] CCTTTCACTTATTTCATTTCTCTCTTGTGGTTGCAGGAGGAAGATGACGAG

[0055] TAATGAAGATGTAGATGGTAGTAAAGTCATTTAGGCTGTCAGTGAACTTG

[0056] ATCGTTCTATATTAATGGTCTGATCATTTCCTGTTAATTGTTTTTTATATCA

[0057] TGCAAATATATTAGTATCTCCCTGTTATTTTGTTTGTGCATTCAGAAACGA

[0058] ATGGTTGTAATGGGAGATCATCTGTCTTGTACCTTACAATGTTAGTTATTC

[0059] CAATCCAACTATGTTTTTTTTTTTCAACTGAAATGGCAACAACTTTCCACT

[0060] CCACATAGAGGAGATGAAGATGCA

[0061] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种检测苦瓜不同组织和不同成熟期果实的内参基因的特异性引物，所述特异性引物包括如SEQ ID NO.2所示的正向引物、以及如SEQ ID NO.3所示的反向引物。

[0062] 正向引物McHMG1/2‑F(SEQ ID NO.2)：GCACCTTACATTGCTAAGGC

[0063] 反向引物McHMG1/2‑R(SEQ ID NO.3)：CTCAGACATGGACTTCTCAG

[0064] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种含有上述特异性引物的检测试剂或试剂盒。

[0065] 在本发明的另一些实施例中，公开了所述内参基因、所述特异性引物或含有所述特异性引物的检测试剂或试剂盒在苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的相对表达量分析中的应用。

[0066] 在其中一些实施例中，所述基因相对表达量分析的方法为实时荧光定量PCR法。

[0067] 在本发明的另一些实施例中，公开了一种苦瓜不同组织和不同成熟期果实相关基因的实时荧光定量PCR检测方法，所述方法中使用McHMG1/2基因作为内参基因，所述McHMG1/2基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

[0068] 在其中一些实施例中，所述实时荧光定量PCR检测方法的反应体系为：0.05～0.15μg cDNA、2×SYBR混合液8～12μL，10μM正向引物0.3～0.5μL，10μM反向引物0.3～0.5μL，ddH2O补至20μL。

[0069] 在其中一些实施例中，所述正向引物和反向引物按等摩尔比混合。

[0070] 在其中一些实施例中，所述实时荧光定量PCR检测方法的反应程序为：94℃预变性30秒；94℃ 5秒、60℃ 45秒，40个循环。

[0071] 以下实施例中采用的苦瓜品种K13来源于广东省农业科学院蔬菜研究所瓜类研究二室。

[0072] 以下结合附图和具体实施例来详细说明本发明。

[0073] 实施例1苦瓜不同组织和成熟期果实的候选新内参基因的筛选

[0074] 本实施例是基于RNA‑Seq数据，在苦瓜不同组织和果实成熟阶段果实中筛选表达最稳定的候选内参基因，具体包括如下步骤：

[0075] 1、实验材料的取样和RNA‑Seq

[0076] 广东省农业科学院白云种植基地栽种苦瓜“K13”为实验材料。分别对苦瓜的根、叶、雄花、雌花和茎，以及绿熟期、破色期、半黄期和全黄期的苦瓜果实取样(图1)。样品离体后使用液氮速冻，送商业公司进行RNA‑Seq，备份样品于‑80℃冰箱保存。

[0077] 2、RNA‑Seq数据分析

[0078] 根据转录组数据，分别计算每个基因转录本的CV值、τ值和TPM值。计算公式分别为：

[0079]

[0080] σ和μ分别是所有组织中基因表达FPKM值的标准差(SD)和平均值。

[0081]

[0082] xi是基因在组织i中的表达量FPKM值，n是组织的数量。

[0083]

[0084] TPMi和FPKMi是组织i中基因的TPM值和FPKM值，∑jFPKMj是组织i中所有基因的FPKM值之和。

[0085] 3、候选新内参基因的筛选

[0086] 按照CV<0.5，τ<0.5和平均log2(TPM)>5的筛选标准，选出表达量前11的基因——DNAJ、HSCP2、ARF1、UP、HMG1/2、TRXH‑1、PHOS32、GAPDH2、RPL35‑2、UBC36、RPS8——作为候选新内参基因。选择McCYP、McEF1α、McTIP41、McACT7和McGAPDH共5个已建立的苦瓜内参基因作为对照。

[0087] 实施例2苦瓜不同组织和成熟期果实的新内参基因的确定

[0088] 以McCYP、McEF1α、McTIP41、McACT7和McGAPDH共5个已建立的苦瓜内参基因作为对照，从实施例1的11个候选新内参基因中选择最适合的内参基因。包括如下步骤：

[0089] 1、总RNA提取和cDNA合成

[0090] (1)、总RNA提取

[0091] 使用实施例1中‑80℃冰箱保存的样品，液氮冷冻，在研钵中磨成粉末。按照从TransZol Up Plus RNA提取试剂盒的说明，从每个样品中提取总RNA。使用NanoDrop 2000分光光度计测量总RNA的质量和浓度。260/280值介于1.8～2.1之间，纯度较高，适用于后续实验。

[0092] (2)、cDNA合成

[0093] 按照TransScript One‑Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix Kit试剂盒的说明，以Oligo(dT)18作为反转录引物，将总RNA(～2μg)反转录为20μL的cDNA。

[0094] 2、qRT‑PCR引物设计和验证

[0095] (1)、qRT‑PCR引物设计

[0096] 根据获得的11个候选新内参基因和5个已建立的苦瓜内参基因序列为基础，遵循qRT‑PCR引物设计的原则：GC含量为50％～60％，熔解温度(Tm)为58～60℃，引物长度为20～22bp，扩增长度为90～150bp，设计上述基因的特异定量引物。序列如表1所示，由商业公司合成，使用PAGE纯化法合成，并稀释成工作液备用。5个已建立内参基因和11个候选新内参基因信息具体见表1。

[0097] 表1

[0098]

[0099] (2)、qRT‑PCR反应

[0100] 在CFX96实时荧光定量PCR仪上进行PCR反应。在冰上配置反应体系，如表2所示。

[0101] 表2

[0102]反应组分 各组分体积
2×SYBR Green Mix 10μL
cDNA(～2μg/μL) 1μL
正向引物F(10μM) 0.4μL
反向引物R(10μM) 0.4μL
ddH2O 8.2μL

[0103] qRT‑PCR运行程序：

[0104] 测定熔解曲线

[0105] 每个反应做3个重复。获得各个内参基因的表达数据Cq值。

[0106] (3)、qRT‑PCR引物验证

[0107] 使用一系列5倍连续稀释的cDNA作为模板生成标准曲线，再通过标准曲线计算出2
引物的扩增效率和R。结果如表3所示。

[0108] 表3

[0109]

[0110]

[0111] 只有扩增效率为90％～110％且R2>0.98的引物才被认定为合格引物。由表3结果2
可知，所用引物的扩增效率和R均合格。

[0112] 对qRT‑PCR扩增引物的特异性分析结果如图2所示，从图2可知，5个传统内参基因和11个新内参基因的熔解曲线都显示出单一、重叠且无杂峰。表明无引物二聚体，没有非特异扩增，所有引物均能用于苦瓜qRT‑PCR实验。

[0113] 3、筛选出的11个内参基因的稳定性分析

[0114] 包括如下步骤：

[0115] (1)、基因表达范围检测

[0116] 根据所有内参基因在不同组织/器官的转录组数据构建了热图(热图利用log2(FPKM)值生成)，并利用Cq值显示16个基因的表达数据。结果如图3所示。

[0117] 热图结果显示：候选新内参基因在不同组织/器官中的表达波动小于已建立的内参基因(图3中的A)。合适的参考基因应具有中等的转录水平(Cq值为15至30)以提供最准确的归一化。

[0118] 利用Cq值显示16个基因的表达数据，75％的Cq值在“框”范围内，25％在“垂直线”范围内。晶须表示95％置信区间。框内直线表示Cq值的中位数，点表示异常值。Cq值分析结果表明，除McGAPDH(Cq值为20.46至32.63)外，所有内参基因都符合标准化使用的基本要求。根据Cq值绘制箱线图显示大多数候选新内参基因的表达范围比已建立的内参基因更稳定，更适合作为参考基因(图3中的B)。

[0119] (2)、基因表达稳定性评价

[0120] 将各个基因在每种组织样本中检测到的表达Cq值输入分析软件，通过geNorm，NormFinder，ΔCt和BestKeeper四种软件对16个基因进行稳定性评价(图4中的A～D)。再使用RefFinder软件综合分析四种软件的稳定性评价结果(图4中的E)。通过geNorm软件的成对变异(V)分析(通常采用0.15(V值)的临界值来确定是否需要添加额外的内参基因，结果显示不同组织和果实成熟阶段标准化的内参基因的最小数量为2(图4中的F)。

[0121] 具体分析数据如表4所示。

[0122] 表4

[0123]

[0124] 数值越小，表示基因表达越稳定。表4结果表明McHMG1/2是综合稳定性最强的基因，因此将其作为苦瓜不同组织和不同成熟阶段果实的新内参基因。

[0125] 实施例3内参基因McHMG1/2的表达稳定性验证

[0126] 使用表达最稳定的两个内参基因(McHMG1/2和McPHOS32)和表达最不稳定的内参基因(McHSCP2)单独或组合进行稳定性验证(数据校正)。所验证的两个基因为果实成熟相关基因McACO1和McACO2，将校正后的qRT‑PCR数据与原始RNA‑Seq的FPKM数据进行表达模式比对。结果如图5所示，图中数据是三个独立生物学重复的±SE(n＝3)的平均值。不同的字母表示由Duncan多重比较法确定的显著性差异(P<0.05)。

[0127] 图5中的A和C显示两个果实成熟相关基因McACO1和McACO2在不同组织和不同成熟阶段果实中的转录水平。图5中的B和D为两个果实成熟相关基因McACO1和McACO2在不同组织和不同成熟阶段果实中的qRT‑PCR分析。结果显示：McHMG1/2单独校准后的表达模式与McHMG1/2和McPHOS32组合校准后的表达模式相似，且与FPKM数据代表的表达模式也十分相似，然而McHSCP2校准后的表达模式却显示出异常。

[0128] 综上可知，McHMG1/2作为内参基因是最适合苦瓜不同器官和不同成熟期果实的定量表达分析。

[0129] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。